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Der Lichtsammelkomplex 1 des Reaktionszentrums (RC-LH1) ist die zentrale photosynthetische Komponente purpurner phototropher Bakterien. Wir präsentieren zwei Kryo-Elektronenmikroskopie-Strukturen des RC-LH1-Komplexes aus Rhodopseudomonas palustris. Die Struktur des RC-LH114-W-Komplexes mit einer Auflösung von 2,65 Å besteht aus 14 Untereinheiten umfassenden LH1-Schleifen, die das Reaktionszentrum (RC) umgeben und durch das Protein W unterbrochen werden. Der Komplex ohne Protein W besteht hingegen vollständig aus dem RC, das von einer geschlossenen 16 Untereinheiten umfassenden LH1-Schleife umgeben ist. Der Vergleich dieser Strukturen liefert Einblicke in die Dynamik von Chinon im RC-LH1-Komplex, darunter bisher unbekannte Konformationsänderungen bei der Bindung von Chinon an die QB-Bindungsstelle des RC sowie die Lage zusätzlicher Chinonbindungsstellen, die den Transport von Chinon zum RC unterstützen. Die einzigartige Struktur des Proteins W verhindert das Schließen der LH1-Schleife und schafft so einen Kanal, der den Chinon/Chinolon-Austausch beschleunigt.
Die durch Photosynthese bereitgestellte Energie kann nahezu alles Leben auf der Erde erhalten und birgt großes Potenzial für die solare Biotechnologie. Purpurbakterien fördern nicht nur die globale Photosynthese, sondern weisen auch verschiedene Energiemodi und Stoffwechselfähigkeiten auf. Sie können die Photosynthese vermeiden und im Dunkeln als heterotrophe Bakterien wachsen, Stickstoff und Kohlendioxid fixieren, Wasserstoff produzieren und aromatische Verbindungen abbauen (1–3). Um die Energie für diese Prozesse bereitzustellen, muss Licht schnell und effizient in chemische Energie umgewandelt werden. Dieser Prozess beginnt, wenn der Lichtfangkomplex Licht absorbiert und die absorbierte Energie an das Reaktionszentrum (RC) weiterleitet, wodurch die Ladungstrennung eingeleitet wird (4–7). Die Grundeinheit der Photosynthese in Purpurbakterien besteht aus einem Typ-2-RC, das vom Lichtsammelkomplex 1 (LH1) umgeben ist und den RC-LH1-Kernkomplex bildet. LH1 besteht aus einer Anordnung gekrümmter αβ-Heterodimere, von denen jedes zwei bakterielle Chlorophyll-a-Moleküle (BChl-a) und ein oder zwei Carotinoide bindet (8–12). Die einfachste LH1-Antenne besteht aus 16 oder 17 αβ-Heterodimeren, die das Reaktionszentrum (RC) (9–13) in einer geschlossenen Schleife umschließen. In anderen Kernkomplexen unterbrechen jedoch Transmembranpeptide die Kontinuität des umgebenden LH1 und fördern so die Chinol/Chinon-Diffusion zwischen RC und dem Cytochrom-bc1-Komplex (11, 13–15). Die purpurfarbene phototrophe Pflanze Rhodopseudomonas (Rps.) ist ein Modellorganismus, der den Energie- und Elektronentransfer der Photosynthese untersucht. Die erste Kristallstruktur von Rps. Das Modell des RC-LH1-Komplexes von Rps. besteht aus dem RC, das von 15 heterodimeren LH1-Schleifen umgeben ist. Diese Schleifen werden durch ein unbekanntes Protein namens „Protein W“ unterbrochen (14). Protein W wurde später als RPA4402 identifiziert, ein uncharakterisiertes 10,5 kDa großes Protein mit drei vorhergesagten Transmembranhelices (TMH) (16). Wir schlagen vor, das Gen rpa4402, das für Protein W kodiert, in pufW umzubenennen, um es an die Nomenklatur der Gene für die RC-L-, M- (pufL, pufM) und LH1α-, β-Untereinheiten (pufA, pufB) anzugleichen. Interessanterweise ist Protein W nur ​​in etwa 10 % der RC-LH1-Komplexe vorhanden, was darauf hindeutet, dass Rps. palustris zwei verschiedene RC-LH1-Komplexe produziert. Wir berichten hier über die hochauflösenden Kryo-EM-Strukturen zweier Kernkomplexe: einen mit Protein W und 14 αβ-Heterodimeren und einen ohne Protein W, dafür mit einer geschlossenen 16-Heterodimer-LH1-Schleife. Unsere Struktur stellt einen Paradigmenwechsel im Verständnis des RC-LH1-Komplexes von Rps. palustris dar, da wir die homogene Population jeder Variante analysiert und eine ausreichende Auflösung erzielt haben, um jedes Peptid sowie die gebundenen Pigmente, Lipide und Chinone eindeutig zuzuordnen. Der Vergleich dieser Strukturen zeigt, dass die drei TMH-Proteine-W, die bisher in keinem anderen RC-LH1-Komplex gefunden wurden, einen Chinonkanal bilden, der den Chinon/Chinolon-Austausch beschleunigt. Wir haben mehrere konservierte Lipid- und Chinonbindungsstellen identifiziert und eine neue Konformationsänderung nach der Kombination von Chinon und Reaktionszentrum (RC) aufgedeckt, die möglicherweise für das Photosystem II (PSII)-RC oxygenierter phototropher Organismen geeignet ist. Unsere Ergebnisse liefern neue Einblicke in die Kinetik der Chinon/Chinolon-Bindung und des Austauschs im RC-LH1-Kernkomplex purpurner phototropher Bakterien.
Um eine detaillierte Untersuchung der beiden in Rps. palustris vorkommenden Komplexe zu ermöglichen, isolierten wir jedes RC-LH1-Molekül biochemisch. Der Protein-W-defiziente Komplex (im Folgenden ΔpufW genannt) wurde aus dem Stamm ohne das pufW-Gen (16) aufgereinigt, wobei nur ein RC-LH1-Komplex produziert werden kann. Der Protein-W-haltige Komplex wird von einem Stamm produziert. Das Protein W dieses Stammes ist am C-Terminus mit einem 10xHis-Tag modifiziert, sodass der Protein-W-haltige Komplex durch Metallimmobilisierung effektiv mit dem meisten Protein-W-defizienten Stamm kombiniert werden kann. Die Trennung des Komplexes erfolgte effektiv mittels Affinitätschromatographie (IMAC) (16).
Wie in Abbildung 1 dargestellt, enthalten beide Komplexe ein aus drei Untereinheiten bestehendes Reaktionszentrum (RC-L, RC-M und RC-H), das von einer LH1-Antenne umgeben ist. Die 2,80 Å-Struktur des Komplexes ohne Protein W zeigt 16 αβ-Heterodimere, die eine geschlossene LH1-Schleife bilden, welche das RC vollständig umschließt. Dieser Komplex wird im Folgenden als RC-LH116-Komplex bezeichnet. Die 2,65 Å-Struktur des Protein-W-haltigen Komplexes weist ein 14-Heterodimer LH1 auf, das durch Protein W unterbrochen wird. Dieser Komplex wird im Folgenden als RC-LH114-W bezeichnet.
(A und B) Oberflächenrepräsentation der Verbindung. (C und D) Gebundene Pigmente in Stäbchenform. (E und F) Die von der cytoplasmatischen Oberfläche aus beobachteten Komplexe zeigen die Peptide und LH1-Untereinheiten in schematischer Darstellung und sind im Uhrzeigersinn vom Protein-W-Spalt aus nummeriert [entsprechend der Nummerierung des Rba-sphaeroides-Komplexes (13)]. Die Proteinuntereinheit von LH1-α ist gelb, die von LH1-β blau, die von Protein-W rot, die von RC-H cyan, die von RC-L orange und die von RC-M magenta. Cofaktoren sind als Stäbchen dargestellt: Grün steht für BChl- und BPh-Moleküle, Lila für Carotinoide und Gelb für UQ10-Moleküle. (G und H) Vergrößerte Ansicht des Protein-W-Spalts im entsprechenden Bereich des RC-LH114-W-Komplexes (G) und des RC-LH116-Komplexes (H). Cofaktoren werden raumfüllend dargestellt, chelatisiertes Chinon ist blau dargestellt. Die Protein-W-Lücke ist in (G) durch eine blaue gestrichelte Linie hervorgehoben, und die kleinen Löcher, durch die Chinon/Chinolol auf dem LH116-Ring diffundiert, sind in (H) durch eine schwarze gestrichelte Linie hervorgehoben.
Abbildung 1 (A und B) zeigt das Reaktionszentrum (RC), umgeben von offenen oder geschlossenen Anordnungen von LH1αβ-Heterodimeren, von denen jedes zwei BChl und ein Carotinoid bindet (Abbildung 1, C und D). Frühere Studien haben gezeigt, dass Rps der LH1-Komplex ist. Im Biosyntheseweg von Spirulina-Xanthin enthalten diese Spezies gemischte Populationen von Carotinoiden (17). Spiropyrroxanthin ist jedoch das dominante Carotinoid, und seine Dichte ist zufriedenstellend. Daher haben wir Spiropyrroxanthin für die Modellierung aller LH1-Bindungsstellen gewählt. Die α- und β-Polypeptide sind einzelne Transmembranhelices (TMHs) mit kurzen äußeren Membranregionen (Abbildung 1, A, B, E und F). Obwohl die Dichte von 17 Aminosäureresten am C-Terminus nicht beobachtet wurde, wurde das α-Polypeptid in beiden Komplexen von Met1 bis Ala46 gespalten. Das β-Polypeptid war in RC-LH116 von Gly4 bis Tyr52 und in RC-LH114-W von Ser5 bis Tyr52 verkürzt. Es wurde keine Dichte für 3 oder 4 N-terminale bzw. 13 C-terminale Aminosäurereste beobachtet (Abbildung S1). Massenspektrometrische Analysen des aus dem Wildtyp-Stamm hergestellten gemischten RC-LH1-Komplexes zeigten, dass die fehlende Region auf eine heterologe Abspaltung dieser Peptide zurückzuführen ist (Abbildungen S1 und S2). Die N-terminale Formylierung von α-Met1 wurde ebenfalls beobachtet (f). Die Analyse ergab, dass das α-Peptid aus den Aminosäureresten fMet1 bis Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 und das β-Peptid aus den Aminosäureresten Ser2 bis Ala53 besteht, was gut mit der Elektronendichtekarte der Tieftemperatur-EM übereinstimmt.
Die Koordination von α-His29 und β-His36 bewirkt, dass sich die BChls gegenüberliegen; jedes αβ-Heterodimer bildet mit seinen Nachbarn eine offene (RC-LH114-W) oder eine geschlossene Schleife (RC-LH116) um das RC. Das Exziton-gekoppelte Pigmentarray ist in Abbildung 1, C und D dargestellt. Verglichen mit der 877-nm-Bande von RC-LH114-W beträgt die Rotverschiebung der Absorption bei 880 nm für RC-LH116 3 nm (Abbildung 2A). Das Circulardichroismus-Spektrum ist jedoch nahezu identisch (Abbildung 2B), was darauf hindeutet, dass die lokale Umgebung der BChls trotz des deutlichen Unterschieds zwischen offenen und geschlossenen Schleifen sehr ähnlich ist. Die Rotverschiebung der Absorption könnte auf eine reduzierte thermische Bewegung und erhöhte Stabilität in der geschlossenen Schleife (18, 19), auf eine durch die geschlossene Schleife bedingte Änderung der Pigmentkopplung (20, 21) oder auf eine Kombination dieser beiden Effekte (11) zurückzuführen sein.
(A) UV/VIS/NIR-Absorptionsspektrum, dessen Peaks mit den entsprechenden Pigmenten markiert und auf den BPh-Peak bei 775 nm normiert sind. (B) Circulardichroismus-Spektrum, normiert auf die BChl-Absorption bei 805 nm. (C und D) Ausgewählte ΔA-Spektren aus den zeitaufgelösten Absorptionsspektren des RC-LH114-W-Komplexes (C) und des RC-LH116-Komplexes (D). Zur besseren Vergleichbarkeit sind alle Spektren auf ΔA von −A bei 0,2 ps normiert. (E) Die Oxidationsrate von Cytochrom c2 nach Bestrahlung in Gegenwart verschiedener UQ2-Konzentrationen (siehe Abb. S8 für Rohdaten). (F) In Zellen, die unter schwachem, mittlerem oder starkem Licht (10, 30 bzw. 300 μM m⁻² s⁻¹) kultiviert wurden, die Protein-W- und RC-L-Untereinheiten im gereinigten Komplex und das Verhältnis der separierten Membran. Die Proteinmenge wird mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Immunassay bestimmt (siehe Abbildung S9 für die Rohdaten). Das Verhältnis wird relativ zum gereinigten RC-LH114-W-Komplex ermittelt. Das stöchiometrische Verhältnis von RC-L zu Protein-W im Komplex beträgt 1:1.
Die BChls an Position 1 in der deformierten αβ14-Schleife von RC-LH114-W (Abb. 1, A, C und E) sind 6,8 ​​Å näher am primären Donor (P) des RC als die entsprechenden BChls in RC-LH116 (Abb. 1, B, D und F sowie Abb. S3). Die Kinetik der transienten Absorption beider Komplexe zeigt jedoch, dass die Zeitkonstanten des Anregungsenergietransfers von LH1 zu RC für RC-LH114-W und RC-LH116 40 ± 4 bzw. 44 ± 3 ps betragen (Abb. 2, C und D, Abb. S4 und Tab. S2). Auch der Elektronentransfer innerhalb des RC unterscheidet sich nicht signifikant (Abb. S5 und zugehöriger ergänzender Text). Wir vermuten, dass die hohe Übereinstimmung der Energietransferzeit zwischen LH1 und RC-P auf die ähnliche Distanz, den ähnlichen Winkel und die ähnliche potenzielle Energie der meisten BChl in den beiden LH1-Schleifen zurückzuführen ist. Die Untersuchung des LH1-Energiemusters zur Erreichung des minimalen Abstands scheint nicht schneller zu sein als der direkte Energietransfer von suboptimalen Positionen zum Reaktionszentrum (RC). Die offene LH1-Schleife in RC-LH114-W kann unter Tieftemperaturbedingungen für die Strukturanalyse auch nur geringfügige thermische Bewegungen aufweisen, und es liegt bei Raumtemperatur eine längere αβ14-Ringkonformation vor, die sich aus dem Pigmentierungsabstand von βBChls an der Position von RC 1 ergibt.
Der RC-LH116-Komplex enthält 32 BChls und 16 Carotinoide. Seine Gesamtstruktur entspricht derjenigen von Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) Stamm 970 (PDB ID 7C9R) (12) und der Grünalge Blc. viridis (PDB ID 6ET5) (10). Nach der Sequenzanalyse zeigten sich nur geringfügige Abweichungen in den Positionen der αβ-Heterodimere, insbesondere der Aminosäuren 1–5, 15 und 16 (Abbildung S6). Das Protein W beeinflusst die Struktur von LH1 maßgeblich. Dessen drei Transmembranhelices (TMHs) sind durch kurze Schleifen verbunden, wobei sich der N-Terminus auf der Lumenseite und der C-Terminus auf der cytoplasmatischen Seite des Komplexes befindet (Abbildungen 1A und 3A–D). Protein-W ist überwiegend hydrophob (Abb. 3B), und TMH2 und TMH3 interagieren mit LH1αβ-14 und bilden eine Transmembranoberfläche (Abb. 3B und E bis G). Die Grenzfläche besteht hauptsächlich aus Phe-, Leu- und Val-Resten in der Transmembranregion. Diese Reste sind mit hydrophoben Aminosäuren und αβ-14-Pigmenten gestapelt. Einige polare Reste tragen ebenfalls zur Interaktion bei, darunter die Wasserstoffbrücke zwischen W-Thr68 und β-Trp42 an der Oberfläche der Komplexhöhle (Abb. 3F und G). Auf der Oberfläche des Zytoplasmas befindet sich Gln34 in Nachbarschaft zur Ketogruppe der αβ-14-Carotinoide. Darüber hinaus wurde das n-Dodecyl-β-D-maltosid-Molekül (β-DDM) identifiziert, dessen hydrophober Schwanz sich bis zur Grenzfläche zwischen Protein-W und αβ-14 erstreckt, während der Lipidrest möglicherweise im Zellinneren lokalisiert ist. Wir stellten außerdem fest, dass die C-terminalen Auflösungsbereiche von Protein W und RCH sehr nahe beieinander liegen, jedoch nicht im Bereich spezifischer Wechselwirkungen (Abbildung 1, A und E). Es könnten jedoch Wechselwirkungen in den nicht aufgelösten C-terminalen Aminosäuren dieser beiden Proteine ​​bestehen, die einen Mechanismus für die Rekrutierung von Protein W während der Assemblierung des RC-LH114-W-Komplexes darstellen könnten.
(A) Protein-W, das der Grenzfläche zu LH1αβ14 zugewandt ist, besitzt in cartoonhafter Form eine stabförmige Seitenkette (rot), die in einem Ausschnitt des elektrostatischen Potentialdiagramms dargestellt ist (transparente graue Fläche mit einem Konturniveau von 0,13). (B) Protein-W wird durch eine hydrophobe Farbgebung dargestellt. Polare und geladene Bereiche sind cyan, hydrophobe Bereiche weiß und stark hydrophobe Bereiche orange dargestellt. (C und D) Protein-W ist cartoonhaft dargestellt, wobei die Orientierung der in (A) (C) entspricht und es in (D) um 180° gedreht ist. Entsprechend ihrer Position in der Sequenz sind die unterscheidbaren Aminosäuren in Regenbogenfarben dargestellt, wobei der N-Terminus blau und der C-Terminus rot ist. (E) Protein-W in derselben Ansicht wie in (A), wobei die Aminosäuren an der Grenzfläche zwischen Protein-W und LH1 durch Stäbe mit Markierungen dargestellt sind. (F) Protein-W ist in der Cartoon-Darstellung relativ zu (E) und LH1αβ14 sowie in der Balkendarstellung relativ zu den Grenzflächenresten um 90° gedreht. Die überhängenden Reste des β-Polypeptids sind markiert. Der Cofaktor ist als Balken in der Farbe von Abbildung 1 dargestellt, das zersetzte β-DDM ist grau und Sauerstoff rot dargestellt. (G) Die Ansicht aus (F) ist um 180° gedreht, wobei die prominenten Reste des markierten α-Polypeptids sichtbar sind.
Protein-W ersetzt ein αβ-Heterodimer (das 15. in Abb. 1F) und verhindert dadurch den Ringschluss sowie die Neigung der ersten drei αβ-Heterodimere. Der maximale Neigungswinkel des ersten αβ-1-Heterodimers relativ zur Filmnormalen betrug 25° bis 29° (Abb. 1, A und E). Dieser Winkel entsteht durch die Neigung von αβ-1 um 2° bis 8° in RC A sharp contrast-LH116 (Abb. 1, B und F). Das zweite und dritte Heterodimer sind um 12° bis 22° bzw. 5° bis 10° geneigt. Aufgrund der sterischen Hinderung durch RC ist das zweite αβ-Paar (entsprechend dem 16. αβ in Abb. 1F) nicht in die Neigung von αβ-1 einbezogen, wodurch eine deutliche Lücke im LH1-Ring entsteht (Abb. 1, A und E). Aufgrund des Fehlens zweier αβ-Heterodimere, verbunden mit dem Verlust von vier BChl und zwei Carotinoiden, bindet keines der Carotinoide an die verdrillte αβ-1-Untereinheit. Dies führt zu einem LH114-W-Ring mit 13 Carotinoiden (vegetarisch) und 28 BChls. Die lokalen Auflösungsschätzungen der beiden Komplexe in den αβ1- bis αβ7-Regionen sind geringer als die des restlichen LH1-Schleifenbereichs. Dies könnte die inhärente Plastizität der LH1-Untereinheit in der Nähe der RC-QB-Bindungsstelle widerspiegeln (Abbildung 4).
Die Abbildungen von RC-LH114-W (A und B) und RC-LH116 (C und D) zeigen die gleiche Draufsicht/Seitenansicht (A und B) (A und C) und die gleiche Kavitätsoberfläche wie in Abb. 1 (B und D). Die farbigen Legenden befinden sich rechts.
Der einzige weitere charakteristische Kernkomplex mit einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:14 ist das RC-LH1-PufX-Dimer von Rhodococcus sphaeroides (Rba.) (13). Protein W und PufX weisen jedoch keine offensichtliche Homologie auf und haben einen signifikanten Einfluss auf ihre jeweiligen LH1-Strukturen. PufX ist eine einzelne Transmembranhelix (TMH) mit einer N-terminalen cytoplasmatischen Domäne, die mit der cytoplasmatischen Seite der RC-H-Untereinheit (13) an einer Position interagiert, die Rps. palustris LH116αβ-16 entspricht. PufX bildet einen Kanal für den Chinon/Chinolon-Austausch zwischen RC-LH1 und dem Cytochrom-bcl-Komplex und ist in allen Kernkomplexen von Rba. sphaeroides vorhanden (13). Obwohl die Monomer-Monomer-Grenzfläche in Rba. Das Sphaeroides-RC-LH1-PufX-Dimer befindet sich an der Bindungsstelle von Protein W in RC-LH114-W, und die durch PufX und Protein W induzierte Lücke liegt an einer äquivalenten Position (Abbildung S7A). Die Lücke in RC-LH114-W ist zudem mit dem hypothetischen Chinonkanal (8) von Pseudomonas rosea LH1 ausgerichtet, der von Peptiden gebildet wird, die weder mit Protein W noch mit PufX verwandt sind (Abbildung S7B). Darüber hinaus befindet sich der Chinonkanal in Blc. The emerald green LH1, der durch den Ausschluss einer γ-Untereinheit (7) entsteht, an einer ähnlichen Position (Abbildung S7C). Obwohl sie durch unterschiedliche Proteine ​​vermittelt werden, scheint das Auftreten dieser Chinon-/Chinololkanäle an einer gemeinsamen Position im RC-LH1-Komplex ein Beispiel für konvergente Evolution zu sein. Dies deutet darauf hin, dass die durch Protein W erzeugte Lücke als Chinonkanal fungieren könnte.
Die Lücke in der LH114-W-Schleife ermöglicht die Bildung einer durchgehenden Membranregion zwischen dem Innenraum des RC-LH114-W-Komplexes und der umgebenden Membran (Abbildung 1G), anstatt die beiden Domänen wie bei Proteinen über eine Proteinpore zu verbinden. Der RC-LH116-Komplex ähnelt einem geschlossenen Tch.-Nadel-ähnlichen Komplex (22) (Abbildung 1H). Da die Diffusion von Chinon durch die Membran schneller ist als die Diffusion durch den engen Proteinkanal, kann die offene LH114-W-Schleife einen schnelleren RC-Umsatz ermöglichen als die geschlossene LH116-Schleife, und die Diffusion von Chinon in das RC könnte stärker eingeschränkt sein. Um zu testen, ob Protein W die Umwandlung von Chinonen durch das RC beeinflusst, führten wir einen Cytochrom-Oxidationstest mit einer bestimmten Konzentration von Ubichinon 2 (UQ2) (einem Analogon des natürlichen UQ10 mit einem kürzeren Isoprenrest) durch (Abbildung 2E). Obwohl das Vorhandensein von chelatisiertem Chinon die genaue Bestimmung der scheinbaren Michaelis-Konstante erschwert (RC-LH114-W und RC-LH116 sind für 0,2±0,1μM bzw. 0,5±0,2μM geeignet), ist die maximale Reaktionsgeschwindigkeit von RC-LH114-W ( 4,6±0,2 e-RC-1 s-1 ) um 28±5% größer als die von RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1 ).
Wir schätzten zunächst, dass Protein-W in etwa 10 % des Kernkomplexes vorliegt (16). Die Belegungsraten von Zellen, die unter schwachem, mittlerem und starkem Licht wachsen, betragen hier 15 ± 0,6 %, 11 ± 1 % bzw. 0,9 ± 0,5 % (Abbildung 2F). Ein quantitativer Vergleich mittels Massenspektrometrie zeigte, dass die Anfügung eines Histidin-Tags die relative Häufigkeit von Protein-W im Vergleich zu Wildtyp-Stämmen nicht verringerte (P = 0,59). Daher sind diese Werte kein Artefakt von modifiziertem Protein-W (Abbildung S10). Die geringe Belegungsrate von Protein-W im RC-LH1-Komplex könnte jedoch dazu führen, dass einige Reaktionszentren (RCs) schneller umklappen und dadurch den langsameren Chinon/Chinolon-Austausch im RC-LH116-Komplex kompensieren. Wir stellten fest, dass die hohe Lichtbelegungsrate im Widerspruch zu den jüngsten Transkriptomikdaten steht, welche darauf hindeuten, dass die pufW-Genexpression unter starkem Licht zunimmt (Abbildung S11) (23). Der Unterschied zwischen der pufW-Transkription und dem Einbau von Protein W in den RC-LH1-Komplex ist unklar und könnte die komplexe Regulation des Proteins widerspiegeln.
In RC-LH114-W sind 6 Cardiolipin- (CDL), 7 Phosphatidylcholin- (POPC), 1 Phosphatidylglycerin- (POPG) und 29 β-DDM-Moleküle lokalisiert und modelliert. In RC-LH116 sind 6 CDLs, 24 POPCs, 2 POPGs und 12 β-DDMs enthalten (Abbildung 5, A und B). In diesen beiden Strukturen befindet sich CDL fast ausschließlich auf der cytoplasmatischen Seite des Komplexes, während POPC, POPG und β-DDM überwiegend auf der luminalen Seite lokalisiert sind. Zwei Lipid- und Detergenzmoleküle wurden in der αβ-1- bis αβ-6-Region des RC-LH114-W-Komplexes isoliert (Abbildung 5A), und fünf wurden in der entsprechenden Region von RC-LH116 isoliert (Abbildung 5B). Weitere Lipide, hauptsächlich CDL, wurden auf der anderen Seite des Komplexes gefunden und zwischen RC und αβ-7 bis αβ-13 akkumuliert (Abbildung 5, A und B). Andere strukturell aufgelöste Lipide und Detergenzien befinden sich außerhalb des LH1-Rings, und gut aufgelöste Acylketten erstrecken sich zwischen den LH1-Untereinheiten. Diese wurden in RC-LH114-W vorläufig als β-DDM und in RC als β-DDM definiert. Eine Mischung aus β-DDM und POPC-LH116. Die ähnlichen Positionen der chelatbildenden Lipide und Detergenzien in unserer Struktur deuten darauf hin, dass es sich um physiologisch relevante Bindungsstellen handelt (Abbildung S12A). Die Positionen äquivalenter Moleküle in Tch weisen ebenfalls eine gute Übereinstimmung auf. Gentle und Trv. Die RC-LH1s des Stammes 970 (Abbildung S12, B bis E) (9, 12) und die Wasserstoffbrückenbindungsreste der Lipidkopfgruppe zeigten eine recht gute Konservierung in der Sequenzübereinstimmung (Abbildung S13), was darauf hindeutet, dass diese Stellen im RC-LH1-Komplex konserviert sein könnten.
(A und B) Die Peptide RC-LH114-W (A) und RC-LH116 (B) sind schematisch dargestellt, die Pigmente als Stäbchen (Farbschema in Abbildung 1). Lipide sind rot, Detergenzien grau dargestellt. An die RC-QA- und QB-Stellen gebundenes UQ ist gelb, isoliertes UQ blau. (C und D) Ansichten wie (A) und (B), jedoch ohne Lipide. (E bis G) Vergrößerte Ansicht von Q1 (E), Q2 (F) und Q3 (G) aus RC-LH116 mit den sich gegenseitig beeinflussenden Seitenketten. Wasserstoffbrückenbindungen sind als schwarze gestrichelte Linien dargestellt.
In RC-LH116 sind sowohl RC QA als auch QB UQ, die am Elektronentransfer im Ladungstrennungsprozess beteiligt sind, an ihren Bindungsstellen zersetzt. In RC-LH114-W konnte das Chinon QB jedoch nicht aufgelöst werden und wird weiter unten detailliert beschrieben. Zusätzlich zu den Chinonen QA und QB wurden in der Struktur von RC-LH114-W zwei chelatierte UQ-Moleküle (zwischen den Ringen RC und LH1) anhand ihrer gut aufgelösten Kopfgruppen (in Q1 bzw. Q2) lokalisiert (Abb. 5C). Q1 sind zwei Isopreneinheiten zugeordnet, und die Elektronendichtekarte zeigt die vollständigen zehn Isoprenketten von Q2. In der Struktur von RC-LH116 wurden drei chelatierte UQ10-Moleküle (Q1 bis Q3, Abb. 5D) aufgelöst, und alle Moleküle weisen eine klare Elektronendichte entlang der gesamten Kette auf (Abb. 5D bis G). In den beiden Strukturen weisen die Positionen der Chinonkopfgruppen von Q1 und Q2 eine ausgezeichnete Übereinstimmung auf (Abb. S12F) und interagieren ausschließlich mit dem Reaktionszentrum (RC). Q1 befindet sich am Eingang der W-Lücke von RC-LH114-W (Abb. 1G und 5, C, D und E), und Q2 liegt in der Nähe der QB-Bindungsstelle (Abb. 5, C, D und F). Die konservierten Aminosäurereste L-Trp143 und L-Trp269 liegen sehr nahe an Q1 und Q2 und ermöglichen potenzielle π-Stapelung-Wechselwirkungen (Abb. 5, E und F sowie Abb. S12). L-Gln88, 3,0 Å vom distalen Sauerstoffatom von Q1 entfernt, bildet eine starke Wasserstoffbrücke (Abb. 5E); dieser Rest ist in allen Reaktionszentren konserviert, mit Ausnahme des am weitesten entfernten (Abb. S13). L-Ser91 ist in den meisten anderen Reaktionszentren (RCs) konservativ durch Thr ersetzt (Abbildung S13), befindet sich 3,8 Å vom Methylsauerstoff von Q1 entfernt und kann schwache Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden (Abbildung 5E). Q3 scheint keine spezifische Wechselwirkung einzugehen, sondern liegt in der hydrophoben Region zwischen der RC-M-Untereinheit und der LH1-α-Untereinheit 5 bis 6 (Abbildung 5, D und G). Q1, Q2 und Q3 oder benachbarte chelatierte Chinone wurden auch in Tch. Gentle, Trv. Stamm 970 und Blc. identifiziert. Die Irisstruktur (9, 10, 12) deutet auf eine konservierte zusätzliche Chinonbindungsstelle im RC-LH1-Komplex hin (Abbildung S12G). Die fünf zersetzten UQs in RC-LH116 stimmen gut mit den 5,8±0,7 der einzelnen Komplexe überein, die mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt wurden, während die drei zersetzten UQs in RC-LH114-W niedriger sind. Der gemessene Wert von 6,2±0,3 (Abb. S14) deutet darauf hin, dass in der Struktur nicht aufgelöste UQ-Moleküle vorhanden sind.
Die pseudosymmetrischen Polypeptide L und M enthalten jeweils fünf Transmembranhelices (TMH) und bilden ein Heterodimer, das aus einem BChl-Dimer, zwei BChl-Monomeren, zwei Bakteriophagen-(BPh)-Monomeren, einem Nicht-Häm-Eisenatom und ein oder zwei UQ10-Molekülen besteht. Durch Wasserstoffbrückenbindungen an der terminalen Ketogruppe und deren bekannte Akkumulation in RNA-Polymerasen (Rps) werden Carotinoide in die M-Untereinheit eingebaut, die als cis-3,4-Dehydroorhodopin bezeichnet wird. Spezies (25). Die äußere Membrandomäne von RC-H ist über eine einzelne TMH an die Membran verankert. Die Gesamtstruktur des RC ähnelt dem dreiteiligen RC verwandter Spezies (wie z. B. Rba sphaeroides (PDB-ID: 3I4D)). Die Makrozyklen von BChl und BPh, das Carotinoid-Grundgerüst und das Nicht-Häm-Eisen überlappen sich im Auflösungsbereich dieser Strukturen, ebenso wie die UQ10-Kopfgruppe an der QA-Stelle und das QB-Chinon an RC-LH116 (Abbildung S15).
Die Verfügbarkeit zweier RC-Strukturen mit unterschiedlichen QB-Bindungsstellen-Besetzungsraten bietet eine neue Möglichkeit, die konsistenten Konformationsänderungen bei der QB-Chinonbindung zu untersuchen. Im RC-LH116-Komplex befindet sich das QB-Chinon in der vollständig gebundenen „proximalen“ Position (26), während im getrennten RC-LH114-W-Komplex kein QB-Chinon vorhanden ist. Das Fehlen von QB-Chinon im RC-LH114-W-Komplex ist überraschend, da dieser aktiv ist, sogar aktiver als der RC-LH116-Komplex mit strukturell aufgelöstem QB-Chinon. Obwohl die beiden LH1-Ringe etwa sechs Chinone chelatisieren, sind fünf im geschlossenen RC-LH116-Ring strukturell aufgelöst, während im offenen RC-LH114-W-Ring nur drei strukturell eingeschränkt sind. Diese erhöhte strukturelle Unordnung könnte auf einen schnelleren Austausch der QB-Bindungsstellen im RC-LH114-W-Komplex, eine schnellere Chinonkinetik im Komplex und eine erhöhte Wahrscheinlichkeit des Überquerens der LH1-Schleife zurückzuführen sein. Wir vermuten, dass das Fehlen von UQ an der RC-QB-Stelle von RC-LH114-W auf einen komplexeren und aktiveren Komplex zurückzuführen ist und dass die QB-Stelle von RC-LH114-W im UQ-Umsatz sofort eingefroren wurde. Das spezifische Stadium (der Zugang zur QB-Stelle ist verschlossen) spiegelt die Konformation dieser Aktivität wider.
Ohne QB würde die begleitende Rotation von L-Phe217 eine Position einnehmen, die mit der UQ10-Bindung inkompatibel ist, da es zu einer räumlichen Kollision mit der ersten Isopreneinheit des Schwanzes käme (Abbildung 6A). Darüber hinaus sind die wesentlichen Konformationsänderungen deutlich erkennbar, insbesondere die Helix de (kurze Helix in der Schleife zwischen TMH D und E), in der L-Phe217 in die QB-Bindungstasche verschoben wird, sowie die Rotation von L-Tyr223 (Abbildung 6A). Dadurch wird die Wasserstoffbrücke zum M-Asp45-Gerüst aufgebrochen und der Eingang zur QB-Bindungsstelle verschlossen (Abbildung 6B). Die Helix de dreht sich an ihrer Basis, das Cα von L-Ser209 verschiebt sich um 0,33 Å, während sich das Cα von L-Val221 um 3,52 Å verschiebt. In TMH D und E sind keine Veränderungen zu beobachten; sie sind in beiden Strukturen deckungsgleich (Abbildung 6A). Soweit uns bekannt, handelt es sich hierbei um die erste Struktur im natürlichen Reaktionszentrum, die die Chinonbindungsstelle (QB) verschließt. Ein Vergleich mit der vollständigen (QB-gebundenen) Struktur zeigt, dass vor der Reduktion des Chinons eine Konformationsänderung erforderlich ist, um den Eintritt in das Chinon zu ermöglichen. L-Phe217 rotiert und bildet eine π-Stapelung mit der Chinonkopfgruppe, während sich die Helix nach außen verschiebt. Dadurch können das Molekülgerüst von L-Gly222 und die Seitenkette von L-Tyr223 ein stabiles Wasserstoffbrückennetzwerk ausbilden (Abbildung 6, A und C).
(A) Überlagerte schematische Darstellung der Hologrammstruktur (L-Kette, orange/M-Kette, magenta) und der Apo-Struktur (grau), in der die wichtigsten Aminosäurereste stabförmig dargestellt sind. UQ10 ist durch einen gelben Balken repräsentiert. Die gestrichelte Linie zeigt die in der gesamten Struktur gebildeten Wasserstoffbrückenbindungen an. (B und C) Oberflächenrepräsentation des Apolipoproteins und der gesamten Ringstruktur, wobei die Seitenketten-Sauerstoffatome von L-Phe217 blau bzw. L-Tyr223 rot hervorgehoben sind. Die L-Untereinheit ist orange; die M- und H-Untereinheiten sind nicht farbig dargestellt. (D und E) Apolipoprotein (D) und gesamte (E) RC-QB-Stellen [farblich entsprechend (A) dargestellt] und Thermophilus thermophilus PSII (grün, blau mit Kunststoffchinon; PDB-ID: 3WU2) Align (58).
Überraschenderweise sind zwar mehrere Strukturen von QB-defizienten Reaktionszentren ohne LH1 verfügbar, die in dieser Studie beobachteten Konformationsänderungen wurden jedoch bisher nicht beschrieben. Dazu gehören die QB-Depletionsstrukturen von Blc. viridis (PDB-ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB-ID: 1EYS) (28) und Rba. sphaeroides (PDB-ID: 1OGV) (29), die alle nahezu identisch mit ihrer jeweiligen QB-Gesamtstruktur sind. Eine genaue Untersuchung von 3PRC zeigte, dass LDAO-Detergenzmoleküle (Lauryldimethylaminoxid) am Eingang der QB-Position binden, was eine Umlagerung in eine geschlossene Konformation verhindern könnte. Obwohl sich LDAO in 1EYS und 1OGV nicht an derselben Position zersetzt, wurden diese Reaktionszentren mit demselben Detergens hergestellt und könnten daher denselben Effekt aufweisen. Die Kristallstruktur von Rba. Das mit Cytochrom c2 kokristallisierte Sphaeroides RC (PDB-ID: 1L9B) scheint ebenfalls eine geschlossene QB-Bindungsstelle zu besitzen. In diesem Fall nimmt die N-terminale Region des RC-M-Polypeptids (die über die Wasserstoffbrücke des Tyr-Restes der Q-Helix mit der QB-Bindungsstelle interagiert) jedoch eine unnatürliche Konformation an, und die Konformationsänderung der QB-Bindungsstelle wurde nicht weiter untersucht (30). Erfreulicherweise wurde eine solche Deformation des M-Polypeptids in der RC-LH114-W-Struktur nicht beobachtet, die nahezu identisch mit der N-terminalen Region des RC-LH116 RC ist. Es ist außerdem anzumerken, dass nach Entfernung der detergentbasierten LH1-Antenne die Apolipoprotein-RCs in der PDB aufgelöst werden konnten, wodurch die internen Chinonpools und Lipide im Spalt zwischen dem RC und der Innenfläche des umgebenden LH1-Rings eliminiert wurden (31, 32). Das Reaktionszentrum (RC) bleibt funktionsfähig, da es alle Cofaktoren mit Ausnahme des zersetzbaren QB-Chinons enthält, welches weniger stabil ist und häufig während der Präparation verloren geht (33). Darüber hinaus ist bekannt, dass die Entfernung von LH1 und natürlichen cyclischen Lipiden aus dem RC Funktionen beeinträchtigen kann, wie beispielsweise die verkürzte Lebensdauer des ladungsgetrennten P+QB-Zustands (31, 34, 35). Daher vermuten wir, dass der lokale LH1-Ring, der das RC umgibt, die „geschlossene“ QB-Bindungsstelle aufrechterhält und somit die lokale Umgebung in der Nähe der QB-Bindung bewahrt.
Obwohl Apolipoprotein (ohne QB-Chinon) und die vollständige Struktur lediglich zwei Momentaufnahmen des Umsatzes der QB-Bindungsstelle darstellen und nicht eine Abfolge von Ereignissen, gibt es Hinweise darauf, dass die Bindung durch Hydrochinon reguliert werden kann, um eine erneute Bindung und damit eine Substrathemmung zu verhindern. Die Wechselwirkung von Chinolol und Chinon in der Nähe der QB-Bindungsstelle von Apolipoprotein könnte unterschiedlich sein, was zu deren Abstoßung durch das Reaktionszentrum (RC) führt. Es wird seit Langem angenommen, dass Konformationsänderungen bei der Bindung und Reduktion von Chinonen eine Rolle spielen. Die Fähigkeit gefrorener Reaktionszentren, Chinone nach Dunkeladaptation zu reduzieren, ist beeinträchtigt (36); Röntgenkristallographie zeigt, dass diese Beeinträchtigung darauf zurückzuführen ist, dass QB-Chinone in einer „distalen“ Konformation etwa 4,5 Å von der aktiven proximalen Position entfernt gefangen sind (26, 37). Wir vermuten, dass diese distale Bindungskonformation eine Momentaufnahme des Zwischenzustands zwischen Apolipoprotein und der vollständigen Ringstruktur darstellt, der auf die initiale Wechselwirkung mit Chinon und die Öffnung der QB-Bindungsstelle folgt.
Der im PSII-Komplex bestimmter phototropher Bakterien und Cyanobakterien, Algen und Pflanzen vorkommende Typ-II-Reaktionskomplex (RC) weist strukturelle und funktionelle Konservierung auf (38). Die in Abbildung 6 (D und E) dargestellte Strukturübereinstimmung unterstreicht die Ähnlichkeit zwischen PSII-RCs und der Chinonbindungsstelle (QB) des bakteriellen RC-Komplexes. Dieser Vergleich dient seit Langem als Modell für die Untersuchung der eng verwandten Systeme der Chinonbindung und -reduktion. Frühere Veröffentlichungen legten nahe, dass die PSII-Reduktion von Chinonen mit Konformationsänderungen einhergeht (39, 40). Angesichts der evolutionären Konservierung des RC könnte dieser bisher unbekannte Bindungsmechanismus daher auch auf die QB-Stelle des PSII-RC in oxygenierten phototrophen Pflanzen anwendbar sein.
Die Stämme Rps ΔpufW (unmarkierte pufW-Deletion) und PufW-His (C-terminal 10x His-markiertes Protein-W, exprimiert vom natürlichen pufW-Locus) von *Ps palustris* CGA009 wurden in unserer vorherigen Arbeit (16) beschrieben. Diese Stämme und der isogene Wildtyp-Elternstamm wurden aus dem Gefrierschrank gewonnen, indem eine kleine Anzahl von Zellen auf PYE-Agar (jeweils 5 g/l; gelagert in LB bei -80 °C, mit 50 % (w/v) Glycerin, Protein, Hefeextrakt und Succinat) [1,5 % (w/v)] ausgestrichen wurde. Die Agarplatte wurde über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur unter anaeroben Bedingungen inkubiert und anschließend 3 bis 5 Tage lang mit weißem Licht (~50 μmol m⁻² s⁻¹) von OSRAM 116-W-Halogenlampen (RS Components, UK) bestrahlt, bis sich eine einzelne Kolonie bildete. Eine einzelne Kolonie wurde verwendet, um 10 ml M22+-Medium (41) mit 0,1 % (w/v) Caseinhydrolysat (im Folgenden als M22 bezeichnet) zu beimpfen. Die Kultur wurde 48 Stunden lang unter Sauerstoffmangel im Dunkeln bei 34 °C und 180 U/min geschüttelt. Anschließend wurden 70 ml der Kultur unter denselben Bedingungen für 24 Stunden inkubiert. 1 ml dieser semi-aeroben Kultur wurde verwendet, um 30 ml M22-Medium in einer 30-ml-Universal-Schraubverschlussflasche aus transparentem Glas zu beimpfen und 48 Stunden lang mit einem sterilen Magnetrührstab unter Rühren (~50 μmol m⁻² s⁻¹) bestrahlt. Anschließend wurden 30 ml dieser Kultur unter denselben Bedingungen mit etwa 1 Liter Kultur beimpft. Diese 30 ml Kultur wurden dann verwendet, um etwa 9 Liter Kultur zu beimpfen, die 72 Stunden lang mit ~200 μmol m⁻² s⁻¹ bestrahlt wurden. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 7132 RCF für 30 Minuten geerntet, in ~10 ml 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) resuspendiert und bis zur Verwendung bei -20°C gelagert.
Nach dem Auftauen werden einige Kristalle Desoxyribonuklease I (Merck, UK), Lysozym (Merck, UK) und zwei Roche-Holoenzym-Proteaseinhibitor-Tabletten (Merck, UK) zu den resuspendierten Zellen gegeben. In einer French-Presse (Aminco, USA) mit 20.000 psi wurden die Zellen 8- bis 12-mal aufgeschlossen. Nach Entfernung intakter Zellen und unlöslicher Bestandteile durch Zentrifugation bei 18.500 g für 15 Minuten bei 4 °C wurde die Membran durch Zentrifugation bei 113.000 g für 2 Stunden bei 43.000 °C aus dem pigmentierten Lysat präzipitiert. Die lösliche Fraktion wird verworfen und die farbige Membran in 100 bis 200 ml 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) resuspendiert und homogenisiert, bis keine sichtbaren Aggregate mehr vorhanden sind. Die suspendierte Membran wurde in 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, USA) mit 2 % (w/v) β-DDM 1 Stunde lang im Dunkeln bei 4 °C unter leichtem Rühren inkubiert. Anschließend wurde sie 1 Stunde lang bei 4 °C und 150.000 g zentrifugiert, um unlösliche Reste zu entfernen.
Die solubilisierende Membran des ΔpufW-Stamms wurde auf eine 50 ml DEAE-Sepharose-Ionenaustauschsäule mit drei Säulenvolumina (SV) Bindungspuffer [20 mM Tris-HCl (pH 8,0) mit 0,03 % (w/v) β-DDM] aufgetragen. Die Säule wurde mit zwei SV Bindungspuffer und anschließend mit zwei weiteren Bindungspuffern, die 50 mM NaCl enthielten, gewaschen. Der RC-LH116-Komplex wurde mit einem linearen Gradienten von 150 bis 300 mM NaCl (in Bindungspuffer) bei 1,75 SV eluiert, der verbleibende Bindungskomplex mit einem Bindungspuffer, der 300 mM NaCl enthielt, bei 0,5 SV. Das Absorptionsspektrum wird zwischen 250 und 1000 nm aufgenommen. Die Fraktion mit einem Absorptionsverhältnis (A880/A280) von über 1 im Bereich von 880 bis 280 nm wird aufgefangen, mit Bindungspuffer zweifach verdünnt und die gleiche Prozedur zur Reinigung an der DEAE-Säule wiederholt. Fraktionen mit A880/A280-Verhältnissen über 1,7 und A880/A805-Verhältnissen über 3,0 werden verdünnt, ein dritter Ionenaustausch durchgeführt und Fraktionen mit A880/A280-Verhältnissen über 2,2 und A880/A805-Verhältnissen über 5,0 werden aufgefangen. Der partiell gereinigte Komplex wurde in einem Amicon-Zentrifugalfilter mit einer Molekulargewichtsausschlussgrenze (MWCO) von 100.000 (Merck, UK) auf ca. 2 ml konzentriert und auf eine Superdex 200 16/600 Größenausschlusschromatographie-Säule (GE Healthcare, USA) mit 200 mM NaCl-Puffer aufgetragen. Die Elution erfolgte mit demselben Puffer bei 1,5 Säulenvolumina (SV). Die Absorptionsspektren der Größenausschlussfraktion wurden aufgenommen und die Spektren mit A880/A280-Verhältnissen über 2,4 und A880/A805-Verhältnissen über 5,8 bis 100 A880 konzentriert. Diese wurden umgehend für die Kryo-TEM-Grid-Präparation oder zur Lagerung verwendet und bis zur Verwendung bei -80 °C aufbewahrt.
Die solubilisierende Membran des PufW-His-Stamms wurde auf eine 20 ml HisPrep FF Ni-NTA-Sepharose-Säule (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl und 0,03 % (w/w) β-DDM) in IMAC-Puffer (GE Healthcare) aufgetragen. Die Säule wurde mit fünf Säulenvolumina (CVs) IMAC-Puffer und anschließend mit fünf CVs IMAC-Puffer, der 10 mM Histidin enthielt, gewaschen. Der Kernkomplex wurde mit fünf IMAC-Pufferlösungen, die 100 mM Histidin enthielten, von der Säule eluiert. Die Fraktion mit dem RC-LH114-W-Komplex wurde in einem Rührkessel mit einem Amicon-Filter (100.000 MWCO, Merck, UK) auf ca. 10 ml konzentriert, 20-fach mit Bindungspuffer verdünnt und anschließend zu 25 ml DEAE-Sepharose gegeben, wobei vier CVs an den Puffer gebunden wurden. Die Säule wurde mit vier CV-Bindungspuffern gewaschen, anschließend wurde der Komplex auf acht CVs mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100 mM NaCl (in Bindungspuffer) eluiert, und die verbleibenden vier CVs enthielten 100 mM Bindungspuffer. Die restlichen Komplexe, die auf der Natriumchlorid-Fraktion eluiert wurden, kombiniert mit einem A880/A280-Verhältnis größer als 2,4 und einem A880/A805-Verhältnis größer als 4,6, wurden in einem Amicon 100.000 MWCO Zentrifugalfilter auf ~2 ml konzentriert und mit 1,5 CV IMAC in einer zuvor mit Puffer äquilibrierten Superdex 200 16/600 Größenausschluss-Säule befüllt und anschließend im gleichen Puffer über 1,5 CV eluiert. Sammeln Sie die Absorptionsspektren der Größenausschlussfraktionen und konzentrieren Sie die Absorptionsspektren mit A880/A280-Verhältnissen über 2,1 und A880/A805-Verhältnissen über 4,6 bis 100 A880, die sofort für die Präparation von gefrorenen TEM-Gittern verwendet oder bis zum Bedarf bei -80°C gelagert werden.
Zur Herstellung von Tieftemperatur-TEM-Grids wurde ein Leica EM GP Immersionsfroster verwendet. Der Komplex wurde in IMAC-Puffer auf eine OD₈₈₀ von 50 verdünnt und anschließend 5 μl davon auf ein frisch plasmaaktiviertes, kohlenstoffbeschichtetes Kupfernetz (QUANTIFOIL 1.2/1.3, Agar Scientific, UK) aufgetragen. Das Grid wurde 30 s bei 20 °C und 60 % relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert, anschließend 3 s lang abgetupft und dann in flüssigem Ethan bei -176 °C abgeschreckt.
Die Daten des RC-LH114-W-Komplexes wurden am eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) mit einem Titan Krios-Mikroskop aufgenommen. Das Mikroskop arbeitet mit einer Beschleunigungsspannung von 300 kV, einer nominellen Vergrößerung von 130.000× und einer Energie von [Wert fehlt]. Es wurde ein Spalt von 20 eV gewählt. Zur Datenerfassung wurde ein Gatan 968 GIF Quantum mit K2-Peakdetektor im Zählmodus verwendet. Die kalibrierte Pixelgröße beträgt 1,048 Å, die Dosisleistung 3,83 e⁻ Å⁻² s⁻¹. Die Filmaufnahme dauerte 11 Sekunden und wurde in 40 Abschnitte unterteilt. Mithilfe der kohlenstoffbeschichteten Fläche wurde das Mikroskop neu fokussiert, und anschließend wurden pro Loch drei Filme aufgenommen. Insgesamt wurden 3130 Filme mit Defokussierungswerten zwischen -1 und -3 μm erfasst.
Die Daten für den RC-LH116-Komplex wurden mit demselben Mikroskop im Asterbury Biostructure Laboratory (Universität Leeds, Großbritannien) erhoben. Die Datenerfassung erfolgte im Zählmodus bei einer Vergrößerung von 130.000. Die Pixelgröße wurde mit einer Dosis von 4,6 e⁻Å⁻²s⁻¹ auf 1,065 Å kalibriert. Die Filmaufnahme dauerte 12 Sekunden und wurde in 48 Abschnitte unterteilt. Insgesamt wurden 3359 Filme mit Defokussierungswerten zwischen -1 und -3 μm aufgenommen.
Die gesamte Datenverarbeitung erfolgt in der Relion 3.0-Pipeline (42). Mithilfe von Motioncorr 2 (43) wird die Strahlbewegung durch Dosisgewichtung korrigiert. Anschließend wird mit CTFFIND 4.1 (44) der CTF-Parameter (Kontrasttransferfunktion) bestimmt. Typische Mikrofotografien nach diesen ersten Verarbeitungsschritten sind in Abbildung 2.S16 dargestellt. Die Vorlage für die automatische Selektion wird durch manuelle Auswahl von ca. 250 Pixeln aus 1000 Partikeln in einem 250-Pixel-Bild generiert. Dabei wird auf eine Referenzklassifizierung in zwei Dimensionen (2D) verzichtet, wodurch Klassifizierungen mit Probenverunreinigungen oder ohne erkennbare Merkmale verworfen werden. Anschließend wurde die automatische Selektion auf alle Mikrofotografien angewendet. Dabei umfasste der RC-LH114-W-Komplex 849.359 Partikel und der RC-LH116-Komplex 476.547 Partikel. Alle ausgewählten Partikel wurden zwei Runden einer nicht-referenzbasierten 2D-Klassifizierung unterzogen. Nach jedem Durchlauf wurden Partikel, die den Kohlenstoffbereich, Probenverunreinigungen, keine erkennbaren Merkmale oder stark überlappende Partikel aufwiesen, verworfen. Dies führte zu 772.033 (90,9 %) bzw. 359.678 (75,5 %) Partikeln, die für die 3D-Klassifizierung von RC-LH114-W bzw. RC-LH116 verwendet wurden. Das initiale 3D-Referenzmodell wurde mittels stochastischem Gradientenabstieg generiert. Anhand dieses Modells wurden die ausgewählten Partikel in vier 3D-Kategorien klassifiziert. Mit dem Modell der jeweiligen Kategorie als Referenz wurde eine 3D-Verfeinerung der Partikel der größten Kategorie durchgeführt. Anschließend wurde der Lösungsmittelbereich mit einem initialen 15-Å-Tiefpassfilter abgedeckt, 6 Pixel für weiche Kanten hinzugefügt und die Pixel nachbearbeitet, um die Modulationsübertragungsfunktion des Gatan-K2-Peaks des oberen Detektors zu korrigieren. Für den RC-LH114-W-Datensatz wurde das Ausgangsmodell modifiziert, indem die hohe Dichte an den Rändern der Maske (die in UCSF Chimera nicht mit der Dichte des Kernkomplexes übereinstimmt) entfernt wurde. Die resultierenden Modelle (die Auflösungen von RC-LH114-W und RC-LH116 betragen 3,91 bzw. 4,16 Å) dienen als Referenz für die zweite Runde der 3D-Klassifizierung. Die verwendeten Partikel werden der ursprünglichen 3D-Klasse zugeordnet und weisen keine starke Korrelation mit ihrer Umgebung auf. Es gibt keine Überlappungen oder fehlende offensichtliche Strukturmerkmale. Nach der zweiten Runde der 3D-Klassifizierung wurde die Kategorie mit der höchsten Auflösung ausgewählt [Für RC-LH114-W umfasst eine Kategorie 377.703 Partikel (44,5 %), für RC-LH116 gibt es zwei Kategorien mit insgesamt 260.752 Partikeln (54,7 %), die nur nach der anfänglichen Rotation und der anschließenden Ausrichtung mit geringfügigen Unterschieden übereinstimmen]. Die ausgewählten Partikel werden in einem 400-Pixel-Feld erneut extrahiert und mittels 3D-Verfeinerung optimiert. Die Lösungsmittelmaske wird mithilfe eines anfänglichen 15-Å-Tiefpassfilters, einer 3-Pixel-Kartenerweiterung und einer 3-Pixel-Softmaske generiert. Nach jedem Schritt werden CTF-Verfeinerung pro Partikel, Bewegungskorrektur pro Partikel und eine zweite Runde CTF-Verfeinerung pro Partikel durchgeführt. Anschließend erfolgen 3D-Verfeinerung, Lösungsmittelmaskierung und Nachbearbeitung, um die resultierende Textur weiter zu verfeinern. Mit einem FSC-Grenzwert (Fourier Shell Correlation Coefficient) von 0,143 betragen die Auflösungen der finalen Modelle von RC-LH114-W und RC-LH116 2,65 bzw. 2,80 Å. Die FSC-Kurve des finalen Modells ist in Abbildung 2.S17 dargestellt.
Alle Proteinsequenzen wurden von UniProtKB heruntergeladen: LH1-β (PufB; UniProt-ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProt-ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt-ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt-ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt-ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt-ID: Q6N1K3). Mit SWISS-MODEL (45) wurde ein Homologiemodell von RC erstellt, das die Proteinsequenzen von RC-L, RC-M und RC-H enthält. Die Kristallstruktur von Rba. sphaeroides RC diente als Vorlage (PDB-ID: 5LSE) (46). Verwenden Sie das „Fit Map“-Tool in UCSF Chimera, um das generierte Modell an die Karte anzupassen (47), die Proteinstruktur zu verbessern und die Cofaktoren [4×BChl a (Restname der Monomerbibliothek = BCL), 2×BPh a (BPH), ein oder zwei Arten von UQ10 (U10), ein Nicht-Häm-Eisen (Fe) und ein 3,4-Dihydrohexacarbonylcholin (QAK)] mit Coot (48) hinzuzufügen. Da QAK nicht in der Monomerbibliothek verfügbar ist, wurde es mit dem eLBOW-Tool in PHENIX (49) parametrisiert.
Anschließend wurde die LH1-Untereinheit konstruiert. Zunächst wurde das automatische Konstruktionswerkzeug in PHENIX (49) verwendet, um einen Teil der LH1-Sequenz anhand der Karte und der Proteinsequenzen von LH1-α und LH1-β automatisch zu erstellen. Die vollständigste LH1-Untereinheit wurde ausgewählt, extrahiert und in Coot geladen. Die fehlende Sequenz wurde manuell ergänzt und die gesamte Struktur manuell verfeinert, bevor zwei BCls (BCL) und ein Spirilloxanthin (CRT) [entsprechend der Dichte des LH1-Komplexes und dem bekannten Carotinoidgehalt (17)] hinzugefügt wurden. Die vollständige LH1-Untereinheit wurde kopiert und mithilfe des „Docking Map Tools“ von UCSF Chimera in den angrenzenden, nicht modellierten Bereich der LH1-Dichte gedockt. Anschließend wurde sie in Coot verfeinert. Dieser Vorgang wurde wiederholt, bis alle LH1-Untereinheiten modelliert waren. Für die RC-LH114-W-Struktur wird durch Extraktion der nicht zugeordneten Elektronendichte in Coot das Protein von den übrigen Nicht-Protein-Komponenten in der USCF-Chimera-Karte segmentiert. Anschließend wird mit dem Autobuild-Tool das Ausgangsmodell erstellt und die verbleibenden Untereinheiten (Protein-W) in PHENIX (49) modelliert. Fehlende Sequenzen werden dem resultierenden Modell in Coot (48) hinzugefügt und die gesamte Untereinheit manuell verfeinert. Die verbleibende nicht zugeordnete Elektronendichte passt zur Kombination aus Lipiden (PDB-Monomerbibliothek-ID von CDL = CDL, POPC = 6PL und POPG = PGT), β-DDM-Detergenz (LMT) und UQ10-Molekülen (U10). Die Optimierung in PHENIX (49) und die manuelle Optimierung in Coot (48) dienen dazu, das vollständige Ausgangsmodell so lange zu perfektionieren, bis die Modellstatistik und die visuelle Qualität der Anpassung nicht weiter verbessert werden können. Zum Schluss wird LocScale (50) verwendet, um die lokale Karte zu schärfen, und anschließend werden mehrere weitere Zyklen der Modellierung der nicht zugeordneten Dichte sowie der automatischen und manuellen Optimierung durchgeführt.
Die jeweiligen Peptide, Cofaktoren und anderen Lipide und Chinone, die in ihre jeweiligen Dichten angedockt sind, sind in den Abbildungen 1 und 2 sowie in den Tabellen S18 bis S23 dargestellt. Die statistischen Informationen des finalen Modells sind in Tabelle S1 aufgeführt.
Sofern nicht anders angegeben, wurden die UV/Vis/NIR-Absorptionsspektren mit einem Cary60-Spektrophotometer (Agilent, USA) in 1-nm-Schritten von 250 nm bis 1000 nm und mit einer Integrationszeit von 0,1s aufgenommen.
Die Probe wurde in einer Quarzküvette mit 2 mm Schichtdicke auf einen A₈₈₀-Wert von 1 verdünnt und das Absorptionsspektrum im Bereich von 400 bis 1000 nm aufgenommen. Die Zirkulardichroismus-Spektren wurden mit einem Jasco 810 Spektropolarimeter (Jasco, Japan) in 1-nm-Schritten zwischen 400 nm und 950 nm mit einer Scangeschwindigkeit von 20 nm min^-1 gemessen.
Der molare Extinktionskoeffizient wird durch Verdünnen des Kernkomplexes auf eine A₈₈₀ von ca. 50 bestimmt. Dazu werden 10 μl in 990 μl Bindungspuffer oder Methanol verdünnt und das Absorptionsspektrum sofort aufgenommen, um den Abbau von BChl zu minimieren. Der BChl-Gehalt jeder Methanolprobe wurde anhand des Extinktionskoeffizienten bei 771 nm von 54,8 mM^-1 cm^-1 berechnet und der Extinktionskoeffizient bestimmt (51). Die gemessene BChl-Konzentration wird durch 32 (RC-LH114-W) bzw. 36 (RC-LH116) dividiert, um die Konzentration des Kernkomplexes zu bestimmen. Diese wird anschließend verwendet, um das Absorptionsspektrum derselben Probe im Puffer zu ermitteln. Für jede Probe wurden drei Messungen durchgeführt, und die mittlere Absorption des BChl-Q_y-Maximums wurde für die Berechnung verwendet. Der Extinktionskoeffizient von RC-LH114-W, gemessen bei 878 nm, beträgt 3280±140 mM-1 cm-1, während der Extinktionskoeffizient von RC-LH116, gemessen bei 880 nm, 3800±30 mM-1 cm-1 beträgt.
UQ10 wurde gemäß der Methode in (52) quantifiziert. Kurz gesagt, wurde eine Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC) mit dem Agilent 1200 HPLC-System durchgeführt. Etwa 0,02 nmol RC-LH116 oder RC-LH114-W wurden in 50 μl eines 50:50-Gemisches aus Methanol und Chloroform, das 0,02 % (w/v) Eisen(III)-chlorid enthielt, gelöst und in die voräquilibrierte Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm-Säule injiziert. Die Elution erfolgte mit 1 ml/min bei 40 °C in HPLC-Laufmittel (80:20 Methanol:2-Propanol) auf einer 25 cm × Säule. Die isokratische Elution in HPLC-Laufmittel wurde durchgeführt, um die Absorption bei 275 nm (UQ10), 450 nm (Carotinoide) und 780 nm (BChl) über 1 Stunde zu messen. Der Peak im 275-nm-Chromatogramm bei 25,5 Minuten wurde integriert; er enthielt keine weiteren nachweisbaren Verbindungen. Die integrierte Fläche dient zur Berechnung der extrahierten molaren Menge an UQ10 anhand der Kalibrierkurve, die durch Injektion reiner Standards von 0 bis 5,8 nmol erstellt wurde (Abbildung S14). Jede Probe wurde dreifach analysiert, und der angegebene Fehler entspricht der Standardabweichung des Mittelwerts.
Eine Lösung des RC-LH1-Komplexes mit einer maximalen Qy-Absorption von 0,1 wurde mit 30 μM reduziertem Pferdeherz-Cytochrom c2 (Merck, UK) und 0 bis 50 μMUQ2 (Merck, UK) hergestellt. Für jede UQ2-Konzentration wurden drei 1-ml-Proben angesetzt und über Nacht im Dunkeln bei 4 °C inkubiert, um eine vollständige Dunkeladaption vor der Messung zu gewährleisten. Die Lösung wurde in ein modulares Spektralphotometer OLIS RSM1000 mit einem 300-nm-Flammen-/500-Linien-Gitter, einem Einlassspalt von 1,24 mm, einem mittleren Spalt von 0,12 mm und einem Auslassspalt von 0,6 mm gefüllt. Ein 600-nm-Langpassfilter wurde am Eingang des Proben-Photomultiplier-Röhrchens und des Referenz-Photomultiplier-Röhrchens platziert, um Anregungslicht auszuschließen. Die Absorption wurde bei 550 nm mit einer Integrationszeit von 0,15 s gemessen. Das Anregungslicht wird von einer 880-nm-LED (Leuchtdiode M880F2) (Thorlabs Ltd., UK) über ein Glasfaserkabel mit 90 % Intensität und einen DC2200-Controller (Thorlabs Ltd., UK) eingekoppelt und unter einem Winkel von 90° auf die Lichtquelle gerichtet. Der Messstrahl wird einem Spiegel gegenübergestellt, um jegliches Licht, das nicht von der Probe absorbiert wurde, zurückzulenken. Die Absorption wird 10 s vor der 50-sekündigen Beleuchtung gemessen. Anschließend wird die Absorption weitere 60 s im Dunkeln gemessen, um zu bestimmen, inwieweit Chinolol spontan Cytochrom c23+ reduziert (siehe Abbildung S8 für die Rohdaten).
Die Daten wurden verarbeitet, indem eine lineare Anfangsreaktionsgeschwindigkeit innerhalb von 0,5 bis 10 s (abhängig von der UQ2-Konzentration) angepasst und die Reaktionsgeschwindigkeiten aller drei Proben bei jeder UQ2-Konzentration gemittelt wurden. Die anhand des jeweiligen Extinktionskoeffizienten berechnete RC-LH1-Konzentration wurde verwendet, um die Reaktionsgeschwindigkeit in die katalytische Effizienz umzurechnen, diese in Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) darzustellen und an das Michaelis-Menten-Modell anzupassen, um die scheinbaren Km- und Kcat-Werte zu bestimmen.
Für die transienten Absorptionsmessungen wurde die RC-LH1-Probe in IMAC-Puffer, der 50 mM Natriumascorbat (Merck, USA) und 0,4 mM Terbutin (Merck, USA) enthielt, auf ca. 2 μM verdünnt. Ascorbinsäure dient als Opfer-Elektronendonator, und tert-Butaclofen wird als QB-Inhibitor eingesetzt, um sicherzustellen, dass der Haupt-RC-Donor während der gesamten Messung reduziert bleibt (d. h. nicht photooxidiert wird). Etwa 3 ml der Probe werden in eine speziell angefertigte Rotationsküvette (ca. 0,1 m Durchmesser, 350 U/min) mit einer optischen Weglänge von 2 mm gegeben, um der Probe im Laserstrahlengang ausreichend Zeit für die Dunkeladaptation zwischen den Anregungspulsen zu gewährleisten. Verwenden Sie Laserpulse von ca. 100 fs Dauer, um das Ti:Saphir-Lasersystem (Spectra Physics, USA) zu verstärken und die Probe bei 880 nm mit einer Wiederholrate von 1 kHz anzuregen (20 nJ für NIR bzw. 100 nJ für Vis). Vor der Datenerfassung belichten Sie die Probe etwa 30 Minuten lang mit Anregungslicht. Die Belichtung führt zu einer Inaktivierung der QA (möglicherweise wird die QA ein- oder zweimal reduziert). Dieser Prozess ist jedoch reversibel, da die RC nach einer längeren Dunkeladaptation langsam wieder QA-aktiv wird. Ein Helios-Spektrometer (Ultrafast Systems, USA) wurde zur Messung transienter Spektren mit einer Verzögerungszeit von -10 bis 7000 ps verwendet. Verwenden Sie die Software Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA), um die Datensätze zu entgruppieren, zusammenzuführen und zu standardisieren. Verwenden Sie das Softwarepaket CarpetView (Light Conversion Ltd., Litauen), um aus dem kombinierten Datensatz differentielle Spektren im Zusammenhang mit dem Zerfall zu erhalten, oder verwenden Sie eine Funktion, die mehrere Exponenten mit der Instrumentenantwort faltet, um die spektrale Entwicklung bei einer einzelnen Wellenlänge in Origin (OriginLab, USA) anzupassen.
Wie bereits erwähnt (53), wurde ein photosynthetischer Film hergestellt, der den LH1-Komplex ohne Reaktionszentrum (RC) und periphere LH2-Antenne enthielt. Die Membran wurde in 20 mM Tris (pH 8,0) verdünnt und anschließend in eine Quarzküvette mit 2 mm optischer Weglänge gefüllt. Die Probe wurde mit einem 30 nJ Laserpuls bei 540 nm und einer Verzögerungszeit von -10 bis 7000 ps angeregt. Die Datenverarbeitung erfolgte wie für die Rps. pal-Probe beschrieben.
Die Membran wurde durch Zentrifugation bei 150.000 g für 2 Stunden bei 4 °C pelletiert und anschließend in 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 200 mM NaCl resuspendiert. Die Membran wurde durch langsames Rühren in 2 % (w/v) β-DDM für 1 Stunde im Dunkeln bei 4 °C gelöst. Die Probe wurde in 100 mM Triethylammoniumcarbonat (pH 8,0) (TEAB; Merck, UK) auf eine Proteinkonzentration von 2,5 mg ml⁻¹ (Bio-Rad-Analyse) verdünnt. Die weitere Verarbeitung erfolgte nach der zuvor publizierten Methode (54), beginnend mit der Verdünnung von 50 μg Protein in insgesamt 50 μl TEAB, das 1 % (w/v) Natriumlaurat (Merck, UK) enthielt. Nach 60 Sekunden Ultraschallbehandlung wurde die Probe mit 5 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (Merck, UK) 30 Minuten lang bei 37 °C reduziert. Zur S-Alkylierung wurde die Probe mit 10 mM Methyl-S-methylthiomethansulfonat (Merck, UK) versetzt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur aus einer 200 mM Isopropanol-Stammlösung zugegeben. Die proteolytische Verdauung erfolgte durch Zugabe von 2 μg Trypsin/Endoproteinase Lys-C-Gemisch (Promega, UK) und Inkubation für 3 Stunden bei 37 °C. Das Laurat-Tensid wurde durch Zugabe von 50 μl Ethylacetat und 10 μl 10%iger (v/v) Trifluoressigsäure (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) in LC-Qualität und anschließendes Vortexen für 60 Sekunden extrahiert. Die Phasentrennung wurde durch Zentrifugation bei 15.700 g für 5 Minuten erreicht. Gemäß Herstellerprotokoll wurde eine C18-Spin-Säule (Thermo Fisher Scientific, UK) verwendet, um die Peptid enthaltende untere Phase vorsichtig abzusaugen und zu entsalzen. Nach Trocknung durch Vakuumzentrifugation wurde die Probe in 0,5 % TFA und 3 % Acetonitril gelöst und 500 ng mittels Nanoflow-RP-Chromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie unter Verwendung der zuvor beschriebenen Systemparameter analysiert.
Verwenden Sie MaxQuant v.1.5.3.30 (56) zur Proteinidentifizierung und -quantifizierung in der Proteomdatenbank von Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository (http://proteomecentral.proteomexchange.org) in der ProteomeXchange Alliance unter der Datensatzkennung PXD020402 hinterlegt.
Für die Analyse mittels RPLC gekoppelt mit Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie wurde der RC-LH1-Komplex aus Wildtyp-Rps hergestellt. Gemäß der zuvor publizierten Methode (16) betrug die Proteinkonzentration in Palustris-Zellen 2 mg ml⁻¹ in 20 mM HEPES (pH 7,8), 100 mM NaCl und 0,03 % (w/v) β-DDM (Bio-Rad-Analyse). Nach Herstellerangaben wurden 10 μg Protein mittels Fällung mit dem 2D-Reinigungskit (GE Healthcare, USA) extrahiert und das Präzipitat in 20 μl einer Lösung aus 60 % (v/v) Ameisensäure (FA), 20 % (v/v) Acetonitril und 20 % (v/v) Wasser gelöst. Fünf Mikroliter wurden mittels RPLC (Dionex RSLC) gekoppelt mit Massenspektrometrie (Maxis UHR-TOF, Bruker) analysiert. Für die Trennung wird eine MabPac 1,2 × 100 mm Säule (Thermo Fisher Scientific, UK) bei 60 °C und einer Flussrate von 100 μl/min verwendet. Der Gradient besteht aus 85 % (v/v) Lösungsmittel A [0,1 % (v/v) Ameisensäure (FA) und 0,02 % (v/v) Trifluoressigsäure (TFA) in wässriger Lösung] und 85 % (v/v) Lösungsmittel B [0,1 % (v/v) FA und 0,02 % (v/v) TFA in 90 % (v/v) Acetonitril]. Mit einer Standard-Elektrospray-Ionisationsquelle und Standardparametern wird über 60 Minuten ein Massenspektrometer im Bereich von 100 bis 2750 m/z (Masse-zu-Ladungs-Verhältnis) aufgenommen. Mithilfe des FindPept-Tools des Bioinformatik-Portals ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/) wird das Massenspektrum den Untereinheiten des Komplexes zugeordnet.
Die Zellen wurden 72 Stunden lang unter 100 ml NF-niedrigem (10 μM m⁻² s⁻¹), mittlerem (30 μM m⁻² s⁻¹) oder hohem (300 μM m⁻² s⁻¹) Licht kultiviert. Das Medium war M22 (M22-Medium ohne Ammoniumsulfat und mit Natriumacetat anstelle von Natriumsuccinat) und wurde in einer 100-ml-Schraubverschlussflasche (23) verwendet. In fünf Zyklen à 30 Sekunden wurden die Zellen mit 0,1 μm großen Glasperlen im Volumenverhältnis 1:1 lysiert und anschließend 5 Minuten auf Eis gekühlt. Unlösliche Bestandteile, intakte Zellen und Glasperlen wurden durch Zentrifugation bei 16.000 g für 10 Minuten in einer Tischmikrozentrifuge abgetrennt. Die Membran wurde in einem Ti 70.1 Rotor bei 100.000 RCF in 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) mit einem 40/15% (w/w) Saccharosegradienten über 10 Stunden getrennt.
Wie in unserer vorherigen Arbeit beschrieben, erfolgte der Immunnachweis des His-Tags an PufW (16). Kurz gesagt, wurde der gereinigte Kernkomplex (11,8 nM) oder die Membran mit der gleichen RC-Konzentration (bestimmt durch Oxidation, Subtraktion des reduzierten Differenzspektrums und Abgleich der Beladung auf dem gefärbten Gel) in 2x SDS-Probenpuffer (Merck, UK) zweifach verdünnt. Die Proteine ​​wurden auf einem Replikat-12%igen Bis-Tris-NuPage-Gel (Thermo Fisher Scientific, UK) aufgetrennt. Das Gel wurde mit Coomassie-Brillantblau (Bio-Rad, UK) gefärbt, um die RC-L-Untereinheit zu beladen und sichtbar zu machen. Das Protein des zweiten Gels wurde für den Immunassay auf eine methanolaktivierte Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran (Thermo Fisher Scientific, UK) transferiert. Die PVDF-Membran wurde in 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2 % (v/v) Tween-20 und 5 % (w/v) Magermilchpulver blockiert und anschließend 4 Stunden lang mit dem primären Anti-His-Antikörper (in verdünntem Antikörperpuffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl und 0,05 % (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen für 5 Minuten in Antikörperpuffer wurde die Membran mit Meerrettichperoxidase (Sigma-Aldrich, UK) Anti-Maus-Sekundärantikörper (1:10.000 in Antikörperpuffer verdünnt) kombiniert. Inkubation zur Detektion (5 Minuten nach 3 Waschschritten in Antikörperpuffer) mit WESTAR ETA C 2.0 Chemilumineszenzsubstrat (Cyanagen, Italien) und Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Die Intensitätsverteilung jeder gefärbten Gel- oder Immunoassay-Spur wurde dargestellt, die Fläche unter dem Peak integriert und das Intensitätsverhältnis von RC-L (gefärbtes Gel) zu Protein-W (Immunoassay) in ImageJ (57) berechnet. Anschließend wurde das Bild verarbeitet. Diese Verhältnisse wurden in molare Verhältnisse umgerechnet, indem angenommen wurde, dass das Verhältnis von RC-L zu Protein-W in der reinen RC-LH114-W-Probe 1:1 beträgt. Der gesamte Datensatz wurde entsprechend normalisiert.
Ergänzendes Material zu diesem Artikel finden Sie unter http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
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Die hochauflösende Struktur des Lichtfallen-1-Komplexes im Reaktionszentrum liefert neue Erkenntnisse über die Chinondynamik.
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