Der Artikel ist Teil des Forschungsthemas „Fortschrittliche Bioremediationstechnologien und Recyclingverfahren für synthetische organische Verbindungen (SOC)“. Alle 14 Artikel ansehen
Niedermolekulare polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) wie Naphthalin und substituierte Naphthaline (Methylnaphthalin, Naphthoesäure, 1-Naphthyl-N-methylcarbamat usw.) finden in verschiedenen Industriezweigen breite Anwendung und sind genotoxisch, mutagen und/oder karzinogen. Diese synthetischen organischen Verbindungen (SOC) oder Xenobiotika gelten als prioritäre Schadstoffe und stellen eine ernsthafte Bedrohung für die globale Umwelt und die öffentliche Gesundheit dar. Die Intensität menschlicher Aktivitäten (z. B. Kohlevergasung, Ölraffinerie, Fahrzeugemissionen und landwirtschaftliche Anwendungen) bestimmt Konzentration, Verbleib und Transport dieser allgegenwärtigen und persistenten Verbindungen. Neben physikalischen und chemischen Behandlungs- bzw. Entfernungsverfahren haben sich umweltfreundliche Technologien wie die Bioremediation, die Mikroorganismen nutzt, welche PAK vollständig abbauen oder in ungiftige Nebenprodukte umwandeln können, als sichere, kostengünstige und vielversprechende Alternative etabliert. Verschiedene Bakterienarten der Phyla Proteobacteria (Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia und Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus und Paenibacillus) und Actinobacteria (Rhodococcus und Arthrobacter) in der Bodenmikrobiota haben die Fähigkeit gezeigt, diverse organische Verbindungen abzubauen. Stoffwechselstudien, Genomik und metagenomische Analysen tragen zum Verständnis der katabolen Komplexität und Diversität dieser einfachen Lebensformen bei, die wiederum für einen effizienten biologischen Abbau genutzt werden können. Die langjährige Präsenz von PAKs hat durch horizontalen Gentransfer mithilfe genetischer Elemente wie Plasmiden, Transposons, Bakteriophagen, genomischen Inseln und integrativen konjugativen Elementen zur Entstehung neuer Abbauphänotypen geführt. Systembiologie und Gentechnik spezifischer Isolate oder Modellgemeinschaften (Konsortien) ermöglichen durch Synergieeffekte eine umfassende, schnelle und effiziente Sanierung dieser PAKs. In diesem Übersichtsartikel konzentrieren wir uns auf die verschiedenen Stoffwechselwege und die Diversität, die genetische Zusammensetzung und Diversität sowie die zellulären Reaktionen/Anpassungen von Naphthalin und substituierten Naphthalinen abbauenden Bakterien. Dies liefert ökologische Informationen für die Anwendung im Feld und die Optimierung von Bakterienstämmen zur effizienten Sanierung kontaminierter Standorte.
Die rasante Entwicklung von Industriezweigen (Petrochemie, Landwirtschaft, Pharmazie, Textilfarben, Kosmetik etc.) hat zu globalem wirtschaftlichem Wohlstand und einem verbesserten Lebensstandard beigetragen. Diese exponentielle Entwicklung hat zur Produktion einer Vielzahl synthetischer organischer Verbindungen (SOCs) geführt, die zur Herstellung verschiedenster Produkte verwendet werden. Zu diesen Fremdstoffen bzw. SOCs zählen polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK), Pestizide, Herbizide, Weichmacher, Farbstoffe, Pharmazeutika, Organophosphate, Flammschutzmittel, flüchtige organische Lösungsmittel etc. Sie gelangen in die Atmosphäre sowie in aquatische und terrestrische Ökosysteme, wo sie vielfältige Auswirkungen haben und durch die Veränderung physikochemischer Eigenschaften und der Gemeinschaftsstruktur schädliche Effekte auf verschiedene Organismengruppen ausüben (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Viele aromatische Schadstoffe haben starke und zerstörerische Auswirkungen auf intakte Ökosysteme und Biodiversitäts-Hotspots (z. B. Korallenriffe, arktische und antarktische Eisschilde, Hochgebirgsseen, Tiefseesedimente usw.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Jüngste geomikrobiologische Studien haben gezeigt, dass die Ablagerung synthetischer organischer Stoffe (z. B. aromatischer Schadstoffe) und ihrer Derivate auf Oberflächen künstlicher Strukturen (z. B. Kulturdenkmäler aus Granit, Stein, Holz und Metall) deren Abbau beschleunigt (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Menschliche Aktivitäten können den biologischen Abbau von Denkmälern und Gebäuden durch Luftverschmutzung und Klimawandel verstärken und verschlimmern (Liu et al. 2020). Diese organischen Schadstoffe reagieren mit dem Wasserdampf in der Atmosphäre und lagern sich auf den Strukturen ab, was zu physikalischem und chemischem Materialabbau führt. Biodegradation ist allgemein als unerwünschte Veränderung des Aussehens und der Eigenschaften von Materialien durch lebende Organismen anerkannt, die deren Erhaltung beeinträchtigt (Pochon und Jaton, 1967). Die weitere mikrobielle Aktivität (Metabolismus) dieser Verbindungen kann die strukturelle Integrität, die Wirksamkeit von Konservierungsmaßnahmen und den kulturellen Wert mindern (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Andererseits hat sich in einigen Fällen die Anpassung und Reaktion von Mikroorganismen an diese Strukturen als vorteilhaft erwiesen, da sie Biofilme und andere schützende Krusten bilden, die die Zersetzungsrate verringern (Martino, 2016). Daher erfordert die Entwicklung effektiver, langfristiger und nachhaltiger Konservierungsstrategien für Denkmäler aus Stein, Metall und Holz ein umfassendes Verständnis der dabei beteiligten Schlüsselprozesse. Im Vergleich zu natürlichen Prozessen (geologische Prozesse, Waldbrände, Vulkanausbrüche, Pflanzen- und Bakterienreaktionen) führen menschliche Aktivitäten zur Freisetzung großer Mengen polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (PAK) und anderer organischer Kohlenstoffverbindungen (OC) in Ökosysteme. Viele in der Landwirtschaft (Insektizide und Pestizide wie DDT, Atrazin, Carbaryl, Pentachlorphenol usw.), der Industrie (Rohöl, Ölschlamm/Ölabfälle, erdölbasierte Kunststoffe, PCB, Weichmacher, Detergenzien, Desinfektionsmittel, Begasungsmittel, Duftstoffe und Konservierungsmittel), Körperpflegeprodukten (Sonnenschutzmittel, Desinfektionsmittel, Insektenschutzmittel und polyzyklische Moschusverbindungen) und Munition (Sprengstoffe wie 2,4,6-TNT) verwendete polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) sind potenzielle Xenobiotika, die die Gesundheit des Planeten beeinträchtigen können (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna und Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Diese Liste kann um erdölbasierte Verbindungen (Heizöle, Schmierstoffe, Asphaltene), hochmolekulare Biokunststoffe und ionische Flüssigkeiten erweitert werden (Amde et al., 2015). Tabelle 1 listet verschiedene aromatische Schadstoffe und ihre Anwendungen in unterschiedlichen Industriezweigen auf. In den letzten Jahren haben die anthropogenen Emissionen flüchtiger organischer Verbindungen sowie von Kohlendioxid und anderen Treibhausgasen zugenommen (Dvorak et al., 2017). Die anthropogenen Einflüsse überwiegen jedoch die natürlichen deutlich. Darüber hinaus stellten wir fest, dass einige organische Schadstoffe (SOCs) in vielen Umweltsystemen persistent sind und als neuartige Schadstoffe mit negativen Auswirkungen auf Biome identifiziert wurden (Abbildung 1). Umweltbehörden wie die US-Umweltschutzbehörde (USEPA) haben viele dieser Schadstoffe aufgrund ihrer zytotoxischen, genotoxischen, mutagenen und karzinogenen Eigenschaften in ihre Prioritätenliste aufgenommen. Daher sind strenge Entsorgungsvorschriften und effektive Strategien zur Abfallbehandlung bzw. -beseitigung aus kontaminierten Ökosystemen erforderlich. Verschiedene physikalische und chemische Behandlungsmethoden wie Pyrolyse, oxidative thermische Behandlung, Belüftung, Deponierung, Verbrennung usw. sind ineffektiv und kostspielig und erzeugen korrosive, toxische und schwer zu behandelnde Nebenprodukte. Angesichts des weltweit wachsenden Umweltbewusstseins rücken Mikroorganismen, die Schadstoffe und deren Derivate (wie halogenierte, Nitro-, Alkyl- und/oder Methylverbindungen) abbauen können, immer stärker in den Fokus (Fennell et al., 2004; Haritash und Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Der Einsatz dieser einheimischen Mikroorganismen, allein oder in Mischkulturen (Kolonien), zur Entfernung aromatischer Schadstoffe bietet Vorteile hinsichtlich Umweltverträglichkeit, Kosten, Effizienz, Effektivität und Nachhaltigkeit. Forscher untersuchen zudem die Integration mikrobieller Prozesse mit elektrochemischen Redoxmethoden, sogenannte bioelektrochemische Systeme (BES), als vielversprechende Technologie zur Schadstoffbehandlung bzw. -entfernung (Huang et al., 2011). Die BES-Technologie hat aufgrund ihrer hohen Effizienz, geringen Kosten, Umweltverträglichkeit, des Betriebs bei Raumtemperatur, der Verwendung biokompatibler Materialien und der Möglichkeit, wertvolle Nebenprodukte (z. B. Strom, Kraftstoff und Chemikalien) zu gewinnen, zunehmend an Bedeutung gewonnen (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Die Entwicklung von Hochdurchsatz-Genomsequenzierung und Omics-Methoden hat eine Fülle neuer Informationen zur genetischen Regulation, Proteomik und Fluxomik der Reaktionen verschiedener abbauender Mikroorganismen geliefert. Die Kombination dieser Methoden mit der Systembiologie hat unser Verständnis der Selektion und Feinabstimmung von Ziel-Katabolismuswegen in Mikroorganismen (d. h. des metabolischen Designs) zur Erzielung eines effizienten und effektiven biologischen Abbaus weiter verbessert. Um effektive Bioremediationsstrategien mit geeigneten Mikroorganismen zu entwickeln, müssen wir deren biochemisches Potenzial, metabolische Diversität, genetische Zusammensetzung und Ökologie (Autoökologie/Synökologie) verstehen.
Abb. 1. Quellen und Wege niedermolekularer PAKs durch verschiedene Umweltsysteme und verschiedene Faktoren, die die Biota beeinflussen. Gestrichelte Linien stellen Wechselwirkungen zwischen Ökosystemelementen dar.
In dieser Übersichtsarbeit fassen wir die Daten zum Abbau einfacher PAKs wie Naphthalin und substituierter Naphthaline durch verschiedene Bakterienisolate zusammen. Dabei werden Stoffwechselwege und Diversität, am Abbau beteiligte Enzyme, Genzusammensetzung und -diversität, zelluläre Reaktionen sowie verschiedene Aspekte der Bioremediation betrachtet. Das Verständnis der biochemischen und molekularen Prozesse ermöglicht die Identifizierung geeigneter Wirtsstämme und deren anschließende genetische Modifizierung für eine effektive Bioremediation dieser prioritären Schadstoffe. Dies trägt zur Entwicklung von Strategien für die Etablierung standortspezifischer Bakterienkonsortien für eine effektive Bioremediation bei.
Das Vorhandensein einer Vielzahl toxischer und gefährlicher aromatischer Verbindungen (die die Hückel-Regel 4n + 2π Elektronen, n = 1, 2, 3, … erfüllen) stellt eine ernsthafte Bedrohung für verschiedene Umweltmedien wie Luft, Boden, Sedimente sowie Oberflächen- und Grundwasser dar (Puglisi et al., 2007). Diese Verbindungen besitzen einzelne (monocyclische) oder mehrere (polycyclische) Benzolringe, die linear, gewinkelt oder in Clustern angeordnet sind. Aufgrund ihrer hohen negativen Resonanzenergie und ihrer Inertheit weisen sie in der Umwelt Stabilität bzw. Instabilität auf, was durch ihre Hydrophobie und ihren reduzierten Zustand erklärt werden kann. Wird der aromatische Ring zusätzlich durch Methyl- (-CH3), Carboxyl- (-COOH), Hydroxyl- (-OH) oder Sulfonatgruppen (-HSO3) ersetzt, erhöht sich seine Stabilität, seine Affinität zu Makromolekülen steigt und es kommt in biologischen Systemen zu einer Bioakkumulation (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Einige niedermolekulare polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (LMWAH), wie Naphthalin und seine Derivate [Methylnaphthalin, Naphthoesäure, Naphthalinsulfonat und 1-Naphthyl-N-methylcarbamat (Carbaryl)], wurden von der US-Umweltschutzbehörde (EPA) aufgrund ihrer genotoxischen, mutagenen und/oder karzinogenen Eigenschaften in die Liste der prioritären organischen Schadstoffe aufgenommen (Cerniglia, 1984). Die Freisetzung dieser Klasse von NM-PAHs in die Umwelt kann zu einer Bioakkumulation dieser Verbindungen auf allen Ebenen der Nahrungskette führen und dadurch die Gesundheit von Ökosystemen beeinträchtigen (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Die Quellen und Wege von PAK in die Biota verlaufen primär durch Migration und Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Ökosystemkomponenten wie Boden, Grundwasser, Oberflächenwasser, Nutzpflanzen und Atmosphäre (Arey und Atkinson, 2003). Abbildung 1 zeigt die Wechselwirkungen und die Verteilung verschiedener niedermolekularer PAK in Ökosystemen sowie ihre Wege in die Biota bzw. die Exposition des Menschen. PAK lagern sich infolge von Luftverschmutzung und durch die Migration (Verwehung) von Fahrzeugabgasen, industriellen Abgasen (Kohlevergasung, Verbrennung und Koksherstellung) und deren Ablagerung auf Oberflächen ab. Industrielle Aktivitäten wie die Herstellung von synthetischen Textilien, Farbstoffen und Lacken, die Holzimprägnierung, die Kautschukverarbeitung, die Zementherstellung, die Pestizidproduktion und landwirtschaftliche Anwendungen sind Hauptquellen für PAK in terrestrischen und aquatischen Systemen (Bamforth und Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Studien haben gezeigt, dass Böden in Vorstadt- und Stadtgebieten, in der Nähe von Autobahnen und in Großstädten aufgrund von Emissionen aus Kraftwerken, Wohnungsheizungen, Luft- und Straßenverkehr sowie Bautätigkeiten anfälliger für polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) sind (Suman et al., 2016). Eine Studie aus dem Jahr 2008 ergab PAK-Konzentrationen von bis zu 7189 μg/kg im Boden nahe Straßen in New Orleans, Louisiana, USA, während diese im Freien nur 2404 μg/kg betrugen. Ähnliche PAK-Werte von bis zu 300 μg/kg wurden in Gebieten nahe Kohlevergasungsanlagen in mehreren US-amerikanischen Städten gemessen (Kanaly und Harayama, 2000; Bamforth und Singleton, 2005). Böden aus verschiedenen indischen Städten wie Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni und Venkataraman, 2000) und Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014) weisen hohe Konzentrationen an polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) auf. Aromatische Verbindungen werden leicht an Bodenpartikel, organische Substanz und Tonminerale adsorbiert und stellen somit wichtige Kohlenstoffsenken in Ökosystemen dar (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Zu den Hauptquellen für PAK in aquatischen Ökosystemen zählen Niederschlag (Nass- und Trockenniederschlag sowie Wasserdampf), städtischer Oberflächenabfluss, Abwassereinleitungen, Grundwasserneubildung usw. (Srogi, 2007). Schätzungsweise 80 % der PAK in marinen Ökosystemen stammen aus Niederschlägen, Sedimentation und Abwassereinleitungen (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Höhere PAK-Konzentrationen im Oberflächenwasser oder Sickerwasser von Abfalldeponien gelangen schließlich ins Grundwasser und stellen eine erhebliche Gefahr für die öffentliche Gesundheit dar, da über 70 % der Bevölkerung in Süd- und Südostasien Grundwasser trinken (Duttagupta et al., 2019). Eine aktuelle Studie von Duttagupta et al. (2020) mit Flusswasser- (32) und Grundwasseranalysen (235) in Westbengalen, Indien, ergab, dass schätzungsweise 53 % der Stadtbevölkerung und 44 % der Landbevölkerung (insgesamt 20 Millionen Einwohner) Naphthalin (4,9–10,6 μg/L) und seinen Derivaten ausgesetzt sein könnten. Unterschiedliche Landnutzungsmuster und verstärkte Grundwasserentnahme gelten als Hauptfaktoren für den vertikalen Transport (Advektion) von PAK mit niedrigem Molekulargewicht im Untergrund. Landwirtschaftliche Abflüsse, kommunale und industrielle Abwassereinleitungen sowie Abfall- und Müllabfuhren beeinflussen die PAK-Belastung in Flussgebieten und Untergrundsedimenten. Niederschläge verschärfen die PAK-Verschmutzung zusätzlich. Hohe Konzentrationen von PAK und ihren Alkylderivaten (insgesamt 51) wurden in Flüssen und Einzugsgebieten weltweit nachgewiesen, beispielsweise im Fraser River, Louan River, Denso River, Missouri River, Anacostia River, Ebro River und Delaware River (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). In Sedimenten des Gangesbeckens wurden Naphthalin und Phenanthren als die bedeutendsten PAK-Verbindungen identifiziert (Nachweis in 70 % der Proben) (Duttagupta et al., 2019). Studien belegen zudem, dass die Chlorung von Trinkwasser zur Bildung toxischerer, oxygenierter und chlorierter PAK führen kann (Manoli und Samara, 1999). PAK reichern sich in Getreide, Obst und Gemüse an, da Pflanzen sie aus kontaminierten Böden, Grundwasser und Niederschlägen aufnehmen (Fismes et al., 2002). Zahlreiche Wasserorganismen wie Fische, Muscheln, Venusmuscheln und Garnelen sind durch den Verzehr kontaminierter Lebensmittel und Meerwasser sowie über Gewebe und Haut mit PAK belastet (Mackay und Fraser, 2000). Auch Zubereitungsmethoden wie Grillen, Braten, Räuchern, Frittieren, Trocknen, Backen und Kochen über Holzkohle können zu einer signifikanten PAK-Belastung von Lebensmitteln führen. Dies hängt maßgeblich von der Wahl des Räuchermaterials, dem Gehalt an phenolischen/aromatischen Kohlenwasserstoffen, dem Garverfahren, der Art der Heizung, dem Feuchtigkeitsgehalt, der Sauerstoffzufuhr und der Verbrennungstemperatur ab (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) wurden auch in Milch in unterschiedlichen Konzentrationen (0,75–2,1 mg/L) nachgewiesen (Girelli et al., 2014). Die Anreicherung dieser PAK in Lebensmitteln hängt ebenfalls von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Lebensmittel ab, während ihre toxischen Wirkungen mit physiologischen Funktionen, Stoffwechselaktivität, Absorption, Verteilung und Körperverteilung zusammenhängen (Mechini et al., 2011).
Die Toxizität und schädlichen Wirkungen polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (PAK) sind seit Langem bekannt (Cherniglia, 1984). Niedermolekulare PAK (zwei bis drei Ringe) können kovalent an verschiedene Makromoleküle wie DNA, RNA und Proteine ​​binden und sind karzinogen (Santarelli et al., 2008). Aufgrund ihrer hydrophoben Natur werden sie von Lipidmembranen abgeschirmt. Im menschlichen Körper oxidieren Cytochrom-P450-Monooxygenasen PAK zu Epoxiden, von denen einige hochreaktiv sind (z. B. Baediol-Epoxid) und zur Transformation normaler Zellen in maligne Zellen führen können (Marston et al., 2001). Darüber hinaus sind die Transformationsprodukte von PAK, wie Chinone, Phenole, Epoxide, Diole usw., toxischer als die Ausgangsverbindungen. Bestimmte polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) und ihre Stoffwechselprodukte können Hormone und verschiedene Enzyme im Stoffwechsel beeinflussen und dadurch Wachstum, das zentrale Nervensystem sowie das Fortpflanzungs- und Immunsystem beeinträchtigen (Swetha und Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Kurzfristige Exposition gegenüber PAK mit niedrigem Molekulargewicht kann bei Asthmatikern zu Lungenfunktionsstörungen und Thrombosen führen und das Risiko für Haut-, Lungen-, Blasen- und Magen-Darm-Krebs erhöhen (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Tierstudien haben zudem gezeigt, dass PAK-Exposition negative Auswirkungen auf die Fortpflanzung und Entwicklung haben und Katarakte, Nieren- und Leberschäden sowie Gelbsucht verursachen kann. Verschiedene Biotransformationsprodukte von PAK, wie Diole, Epoxide, Chinone und freie Radikale (Kationen), bilden DNA-Addukte. Stabile Addukte verändern nachweislich die DNA-Replikationsmaschinerie, während instabile Addukte die DNA depurinieren können (hauptsächlich zu Adenin und gelegentlich zu Guanin); beide können Fehler verursachen, die zu Mutationen führen (Schweigert et al. 2001). Darüber hinaus können Chinone (Benzo-/Pan-) reaktive Sauerstoffspezies (ROS) bilden, die DNA und andere Makromoleküle schädigen und dadurch die Gewebefunktion bzw. -lebensfähigkeit beeinträchtigen (Ewa und Danuta 2017). Chronische Exposition gegenüber niedrigen Konzentrationen von Pyren, Biphenyl und Naphthalin führt bei Versuchstieren zu Krebs (Diggs et al. 2012). Aufgrund ihrer letalen Toxizität hat die Sanierung bzw. Entfernung dieser PAK von betroffenen/kontaminierten Standorten höchste Priorität.
Zur Entfernung von PAK aus kontaminierten Standorten/Umgebungen wurden verschiedene physikalische und chemische Verfahren eingesetzt. Verfahren wie Verbrennung, Dechlorierung, UV-Oxidation, Fixierung und Lösungsmittelextraktion weisen jedoch zahlreiche Nachteile auf, darunter die Bildung toxischer Nebenprodukte, Prozesskomplexität, Sicherheits- und Regulierungsfragen, geringe Effizienz und hohe Kosten. Die mikrobielle Biodegradation (Bioremediation) stellt hingegen einen vielversprechenden alternativen Ansatz dar, bei dem Mikroorganismen in Form von Reinkulturen oder Kolonien eingesetzt werden. Im Vergleich zu physikalischen und chemischen Verfahren ist dieser Prozess umweltfreundlich, nicht-invasiv, kostengünstig und nachhaltig. Die Bioremediation kann am betroffenen Standort (in situ) oder an einem speziell vorbereiteten Standort (ex situ) durchgeführt werden und gilt daher als nachhaltigere Sanierungsmethode als herkömmliche physikalische und chemische Methoden (Juhasz und Naidu, 2000; Andreoni und Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Das Verständnis der mikrobiellen Stoffwechselprozesse beim Abbau aromatischer Schadstoffe hat enorme wissenschaftliche und ökonomische Bedeutung für die ökologische und umweltbezogene Nachhaltigkeit. Weltweit sind schätzungsweise 2,1 × 10¹⁸ Gramm Kohlenstoff (C) in Sedimenten und organischen Verbindungen (z. B. Erdöl, Erdgas und Kohle, d. h. fossilen Brennstoffen) gespeichert und leisten damit einen bedeutenden Beitrag zum globalen Kohlenstoffkreislauf. Die rasante Industrialisierung, die Förderung fossiler Brennstoffe und menschliche Aktivitäten führen jedoch zur Erschöpfung dieser lithosphärischen Kohlenstoffspeicher und zur Freisetzung von schätzungsweise 5,5 × 10¹⁵ g organischem Kohlenstoff (als Schadstoffe) jährlich in die Atmosphäre (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Der größte Teil dieses organischen Kohlenstoffs gelangt durch Sedimentation, Transport und Oberflächenabfluss in terrestrische und marine Ökosysteme. Darüber hinaus belasten neue synthetische Schadstoffe aus fossilen Brennstoffen, wie Kunststoffe, Weichmacher und Kunststoffstabilisatoren (Phthalate und ihre Isomere), marine, bodennahe und aquatische Ökosysteme sowie deren Lebewesen stark und verschärfen so die globalen Klimarisiken. Verschiedene Arten von Mikroplastik, Nanoplastik, Plastikfragmenten und deren toxischen Monomerprodukten aus Polyethylenterephthalat (PET) haben sich im Pazifik zwischen Nordamerika und Südostasien angesammelt und den „Großen Pazifischen Müllstrudel“ gebildet, der die Meereslebewesen schädigt (Newell et al., 2020). Wissenschaftliche Studien haben gezeigt, dass diese Schadstoffe/Abfälle weder physikalisch noch chemisch entfernt werden können. Besonders nützlich sind in diesem Zusammenhang Mikroorganismen, die Schadstoffe oxidativ zu Kohlendioxid, chemischer Energie und anderen ungiftigen Nebenprodukten metabolisieren können, welche schließlich in andere Nährstoffkreisläufe (H₂, O₂, N₂, S, P, Fe usw.) einfließen. Daher ist das Verständnis der mikrobiellen Ökophysiologie der Mineralisierung aromatischer Schadstoffe und ihrer Umweltkontrolle entscheidend für die Bewertung des mikrobiellen Kohlenstoffkreislaufs, der Nettokohlenstoffbilanz und zukünftiger Klimarisiken. Angesichts der dringenden Notwendigkeit, diese Verbindungen aus der Umwelt zu entfernen, sind verschiedene Öko-Industrien entstanden, die sich auf saubere Technologien konzentrieren. Alternativ dazu gilt die Verwertung von Industrieabfällen/Abfallchemikalien, die sich in Ökosystemen ansammeln (Abfallverwertung), als eine der Säulen der Kreislaufwirtschaft und der Ziele für nachhaltige Entwicklung (Close et al., 2012). Daher ist das Verständnis der metabolischen, enzymatischen und genetischen Aspekte dieser potenziellen Abbaukandidaten von größter Bedeutung für die effektive Entfernung und biologische Sanierung solcher aromatischer Schadstoffe.
Unter den zahlreichen aromatischen Schadstoffen widmen wir den niedermolekularen PAKs wie Naphthalin und substituierten Naphthalinen besondere Aufmerksamkeit. Diese Verbindungen sind Hauptbestandteile von aus Erdöl gewonnenen Kraftstoffen, Textilfarbstoffen, Konsumgütern, Pestiziden (Mottenkugeln und Insektenschutzmitteln), Weichmachern und Tanninen und sind daher in vielen Ökosystemen weit verbreitet (Preuss et al., 2003). Jüngste Berichte weisen auf die Anreicherung von Naphthalin in Grundwasserleitern, Grundwasser und Unterböden, ungesättigten Bodenzonen und Flussbetten hin, was auf eine Bioakkumulation in der Umwelt schließen lässt (Duttagupta et al., 2019, 2020). Tabelle 2 fasst die physikalisch-chemischen Eigenschaften, Anwendungen und gesundheitlichen Auswirkungen von Naphthalin und seinen Derivaten zusammen. Im Vergleich zu anderen hochmolekularen PAKs sind Naphthalin und seine Derivate weniger hydrophob, besser wasserlöslich und weit verbreitet in Ökosystemen. Daher werden sie häufig als Modellsubstrate zur Untersuchung des Metabolismus, der Genetik und der metabolischen Diversität von PAKs eingesetzt. Zahlreiche Mikroorganismen können Naphthalin und seine Derivate metabolisieren, und es liegen umfassende Informationen zu ihren Stoffwechselwegen, Enzymen und regulatorischen Merkmalen vor (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Aufgrund ihrer hohen Konzentration und Bioverfügbarkeit gelten Naphthalin und seine Derivate zudem als Prototypverbindungen für die Bewertung von Umweltverschmutzungen. Die US-Umweltschutzbehörde (EPA) schätzt die durchschnittliche Naphthalinkonzentration in Zigarettenrauch auf 5,19 μg pro Kubikmeter, hauptsächlich aufgrund unvollständiger Verbrennung, und auf 7,8 bis 46 μg in Nebenstromrauch. Die Belastung durch Kreosot und Naphthalin ist hingegen 100- bis 10.000-mal höher (Preuss et al. 2003). Insbesondere Naphthalin weist eine spezies-, regions- und geschlechtsspezifische Atemwegstoxizität und Karzinogenität auf. Basierend auf Tierstudien stuft die Internationale Agentur für Krebsforschung (IARC) Naphthalin als „möglicherweise krebserregend für den Menschen“ (Gruppe 2B) ein. Die Exposition gegenüber substituierten Naphthalinen, vorwiegend durch Inhalation oder parenterale (orale) Verabreichung, verursacht Lungengewebeschäden und erhöht die Häufigkeit von Lungentumoren bei Ratten und Mäusen (National Toxicology Program 2). Akute Wirkungen umfassen Übelkeit, Erbrechen, Bauchschmerzen, Durchfall, Kopfschmerzen, Verwirrtheit, starkes Schwitzen, Fieber, Herzrasen usw. Andererseits ist das Breitband-Carbamat-Insektizid Carbaryl (1-Naphthyl-N-methylcarbamat) bekanntermaßen toxisch für aquatische Wirbellose, Amphibien, Honigbienen und Menschen und hemmt nachweislich die Acetylcholinesterase, was zu Lähmungen führt (Smulders et al., 2003; Bulen und Distel, 2011). Daher ist das Verständnis der Mechanismen des mikrobiellen Abbaus, der genetischen Regulation sowie enzymatischer und zellulärer Reaktionen entscheidend für die Entwicklung von Bioremediationsstrategien in kontaminierten Umgebungen.
Tabelle 2. Detaillierte Informationen zu den physikalisch-chemischen Eigenschaften, Verwendungen, Identifizierungsmethoden und damit verbundenen Krankheiten von Naphthalin und seinen Derivaten.
In belasteten Lebensräumen können hydrophobe und lipophile aromatische Schadstoffe vielfältige zelluläre Effekte auf das Umweltmikrobiom (die mikrobielle Gemeinschaft) hervorrufen, wie z. B. Veränderungen der Membranfluidität und -permeabilität, Quellung der Lipiddoppelschicht, Störung des Energietransfers (Elektronentransportkette/protonenmotorische Kraft) und Beeinträchtigung der Aktivität membrangebundener Proteine ​​(Sikkema et al., 1995). Darüber hinaus erzeugen einige lösliche Zwischenprodukte wie Catechole und Chinone reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und bilden Addukte mit DNA und Proteinen (Penning et al., 1999). Die hohe Konzentration solcher Verbindungen in Ökosystemen übt somit einen Selektionsdruck auf mikrobielle Gemeinschaften aus, diese auf verschiedenen physiologischen Ebenen effizient abzubauen, darunter Aufnahme/Transport, intrazelluläre Umwandlung, Assimilation/Verwertung und Kompartimentierung.
Eine Suche in der Ribosomal Database Project-II (RDP-II) ergab, dass insgesamt 926 Bakterienarten aus Medien oder Anreicherungskulturen isoliert wurden, die mit Naphthalin oder seinen Derivaten kontaminiert waren. Die Gruppe der Proteobakterien wies die höchste Anzahl an Vertretern auf (n = 755), gefolgt von Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) und nicht klassifizierten Bakterien (8) (Abbildung 2). Vertreter der γ-Proteobakterien (Pseudomonadales und Xanthomonadales) dominierten alle gramnegativen Gruppen mit hohem G+C-Gehalt (54 %), während Clostridiales und Bacillales (30 %) grampositive Gruppen mit niedrigem G+C-Gehalt darstellten. Pseudomonas (mit 338 Arten die größte Gruppe) kann Naphthalin und seine Methylderivate in verschiedenen belasteten Ökosystemen (Kohlenteer, Erdöl, Rohöl, Klärschlamm, Ölverschmutzungen, Abwasser, organische Abfälle und Deponien) sowie in intakten Ökosystemen (Boden, Flüsse, Sedimente und Grundwasser) abbauen (Abbildung 2). Anreicherungsstudien und metagenomische Analysen einiger dieser Regionen zeigten zudem, dass auch nicht kultivierte Legionella- und Clostridium-Arten über Abbaukapazität verfügen könnten. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, diese Bakterien zu kultivieren, um neue Stoffwechselwege und die metabolische Diversität zu erforschen.
Abb. 2. Taxonomische Diversität und ökologische Verteilung bakterieller Vertreter in mit Naphthalin und Naphthalinderivaten kontaminierten Umgebungen.
Unter den verschiedenen aromatischen Kohlenwasserstoff-abbauenden Mikroorganismen sind die meisten in der Lage, Naphthalin als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle abzubauen. Die Abfolge der Ereignisse im Naphthalin-Stoffwechsel wurde für Pseudomonas sp. beschrieben. (Stämme: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 und CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 und andere Stämme (ND6 und AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis und Zylstra, 2004; Sota et al., 2006). Der Stoffwechsel wird durch eine Multikomponenten-Dioxygenase [Naphthalindioxygenase (NDO), eine ringhydroxylierende Dioxygenase] initiiert, die die Oxidation eines der aromatischen Ringe des Naphthalins unter Verwendung von molekularem Sauerstoff als zweitem Substrat katalysiert und Naphthalin in cis-Naphthalindiol umwandelt (Abbildung 3). cis-Dihydrodiol wird umgewandelt 1,2-Dihydroxynaphthalin wird durch eine Dehydrogenase in 2-Hydroxychromen-2-carbonsäure umgewandelt. Eine ringöffnende Dioxygenase, die 1,2-Dihydroxynaphthalin-Dioxygenase (12DHNDO), wandelt 1,2-Dihydroxynaphthalin in 2-Hydroxychromen-2-carbonsäure um. Durch enzymatische cis-trans-Isomerisierung entsteht trans-o-Hydroxybenzylidenpyruvat, welches durch eine Hydratase-Aldolase in Salicylaldehyd und Pyruvat gespalten wird. Pyruvat war die erste C3-Verbindung, die aus dem Naphthalin-Kohlenstoffgerüst abgeleitet und in den zentralen Kohlenstoffstoffwechselweg eingeleitet wurde. Zusätzlich wandelt eine NAD+-abhängige Salicylaldehyd-Dehydrogenase Salicylaldehyd in Salicylsäure um. Dieser Stoffwechselweg wird als „oberer Abbauweg“ des Naphthalins bezeichnet. Er ist in den meisten Naphthalin-abbauenden Bakterien weit verbreitet. Es gibt jedoch einige Ausnahmen, beispielsweise in … Bei thermophilen Bacillus hamburgii 2 wird der Naphthalinabbau durch Naphthalin-2,3-Dioxygenase eingeleitet, wobei 2,3-Dihydroxynaphthalin entsteht (Annweiler et al., 2000).
Abbildung 3. Stoffwechselwege von Naphthalin, Methylnaphthalin, Naphthoesäure und Carbaryl. Die eingekreisten Zahlen bezeichnen Enzyme, die für die sequentielle Umwandlung von Naphthalin und seinen Derivaten in Folgeprodukte verantwortlich sind. 1 – Naphthalindioxygenase (NDO); 2 – cis-Dihydrodiol-Dehydrogenase; 3 – 1,2-Dihydroxynaphthalindioxygenase; 4 – 2-Hydroxychromen-2-carbonsäure-Isomerase; 5 – trans-O-Hydroxybenzylidenpyruvat-Hydratase-Aldolase; 6 – Salicylaldehyd-Dehydrogenase; 7 – Salicylat-1-Hydroxylase; 8 – Catechol-2,3-Dioxygenase (C23DO); 9 – 2-Hydroxymuconat-Semialdehyd-Dehydrogenase; 10 – 2-Oxopent-4-enoat-Hydratase. 11, 4-Hydroxy-2-oxopentanoat-Aldolase; 12, Acetaldehyd-Dehydrogenase; 13, Catechol-1,2-Dioxygenase (C12DO); 14, Muconat-Cycloisomerase; 15, Muconolacton-Delta-Isomerase; 16, β-Ketoadipatenollacton-Hydrolase; 17, β-Ketoadipat-Succinyl-CoA-Transferase; 18, β-Ketoadipat-CoA-Thiolase; 19, Succinyl-CoA:Acetyl-CoA-Succinyltransferase; 20, Salicylat-5-Hydroxylase; 21, Gentisat-1,2-Dioxygenase (GDO); 22, Maleylpyruvat-Isomerase; 23, Fumarylpyruvat-Hydrolase; 24, Methylnaphthalinhydroxylase (NDO); 25, Hydroxymethylnaphthalindehydrogenase; 26, Naphthaldehyddehydrogenase; 27, 3-Formylsalicylsäureoxidase; 28, Hydroxyisophthalatdecarboxylase; 29, Carbarylhydrolase (CH); 30, 1-Naphthol-2-hydroxylase.
Abhängig vom Organismus und seiner genetischen Ausstattung wird die entstehende Salicylsäure entweder über den Catechol-Weg mithilfe der Salicylat-1-Hydroxylase (S1H) oder über den Gentisat-Weg mithilfe der Salicylat-5-Hydroxylase (S5H) weiter verstoffwechselt (Abbildung 3). Da Salicylsäure das wichtigste Zwischenprodukt im Naphthalin-Stoffwechsel (oberer Stoffwechselweg) ist, werden die Schritte von der Salicylsäure zum TCA-Zwischenprodukt häufig als unterer Stoffwechselweg bezeichnet, und die entsprechenden Gene sind in einem einzigen Operon organisiert. Häufig werden die Gene des Operons des oberen Stoffwechselwegs (nah) und des Operons des unteren Stoffwechselwegs (sal) durch gemeinsame regulatorische Faktoren reguliert; beispielsweise wirken NahR und Salicylsäure als Induktoren, wodurch beide Operons Naphthalin vollständig verstoffwechseln können (Phale et al., 2019, 2020).
Darüber hinaus wird Catechol durch Catechol-2,3-Dioxygenase (C23DO) über den meta-Weg zyklisch zu 2-Hydroxymuconat-Semialdehyd gespalten (Yen et al., 1988) und anschließend durch 2-Hydroxymuconat-Semialdehyd-Hydrolase zu 2-Hydroxypent-2,4-diensäure hydrolysiert. 2-Hydroxypent-2,4-diensäure wird dann durch eine Hydratase (2-Oxopent-4-enoat-Hydratase) und eine Aldolase (4-Hydroxy-2-oxopentanoat-Aldolase) zu Pyruvat und Acetaldehyd umgewandelt und gelangt anschließend in den zentralen Kohlenstoffkreislauf (Abbildung 3). Alternativ wird Catechol durch Catechol-1,2-Oxygenase (C12DO) über den ortho-Weg zyklisch zu cis,cis-Muconat gespalten. Muconat-Cycloisomerase, Muconolacton-Isomerase und β-Ketoadipat-Nollacton-Hydrolase wandeln cis,cis-Muconat in 3-Oxoadipat um, welches über Succinyl-CoA und Acetyl-CoA in den zentralen Kohlenstoffstoffwechselweg eintritt (Nozaki et al., 1968) (Abbildung 3).
Im Gentisat-Stoffwechselweg (2,5-Dihydroxybenzoat-Stoffwechselweg) wird der aromatische Ring durch Gentisat-1,2-Dioxygenase (GDO) gespalten, wodurch Maleylpyruvat entsteht. Dieses Produkt kann direkt zu Pyruvat und Malat hydrolysiert oder zu Fumarylpyruvat isomerisiert werden, welches wiederum zu Pyruvat und Fumarat hydrolysiert werden kann (Larkin und Day, 1986). Die Wahl des alternativen Stoffwechselwegs wurde sowohl bei gramnegativen als auch bei grampositiven Bakterien auf biochemischer und genetischer Ebene beobachtet (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Gramnegative Bakterien (Pseudomonas) bevorzugen die Verwendung von Salicylsäure, einem Induktor des Naphthalinstoffwechsels, und decarboxylieren diese mithilfe der Salicylat-1-Hydroxylase zu Brenzcatechin (Gibson und Subramanian, 1984). Andererseits wandelt die Salicylat-5-Hydroxylase in Gram-positiven Bakterien (Rhodococcus) Salicylsäure in Gentisinsäure um, während Salicylsäure keinen induktiven Effekt auf die Transkription von Naphthalin-Genen hat (Grund et al., 1992) (Abbildung 3).
Es wurde berichtet, dass Arten wie Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a sowie Pseudomonas- und Mycobacterium-Arten Monomethylnaphthalin oder Dimethylnaphthalin abbauen können (Dean-Raymond und Bartha, 1975; Cane und Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Der Abbauweg von 1-Methylnaphthalin und 2-Methylnaphthalin durch Pseudomonas sp. CSV86 wurde insbesondere auf biochemischer und enzymatischer Ebene eingehend untersucht (Mahajan et al., 1994). 1-Methylnaphthalin wird über zwei Stoffwechselwege verstoffwechselt. Zunächst wird der aromatische Ring (der unsubstituierte Ring des Methylnaphthalins) hydroxyliert, wodurch cis-1,2-Dihydroxy-1,2-dihydro-8-methylnaphthalin entsteht. Dieses wird weiter zu Methylsalicylat und Methylcatechol oxidiert und gelangt nach Ringöffnung in den zentralen Kohlenstoffstoffwechselweg (Abbildung 3). Dieser Weg wird als „Kohlenstoffquellenweg“ bezeichnet. Im zweiten Weg, dem „Entgiftungsweg“, kann die Methylgruppe durch NDO zu 1-Hydroxymethylnaphthalin hydroxyliert werden. Dieses wird weiter zu 1-Naphthoesäure oxidiert und als Endprodukt in das Kulturmedium ausgeschieden. Studien haben gezeigt, dass der Stamm CSV86 nicht auf 1- und 2-Naphthoesäure als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen kann, was seinen Entgiftungsweg bestätigt (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). In 2-Methylnaphthalin wird die Methylgruppe durch Hydroxylase zu 2-Hydroxymethylnaphthalin hydroxyliert. Zusätzlich wird der unsubstituierte Ring des Naphthalinrings hydroxyliert, wodurch ein Dihydrodiol entsteht, das in einer Reihe enzymkatalysierter Reaktionen zu 4-Hydroxymethylcatechol oxidiert wird und über die meta-Ringspaltung in den zentralen Kohlenstoffkreislauf gelangt. Ähnlich wurde berichtet, dass S. paucimobilis 2322 NDO zur Hydroxylierung von 2-Methylnaphthalin nutzt, welches weiter zu Methylsalicylat und Methylcatechol oxidiert wird (Dutta et al., 1998).
Naphthoesäuren (substituiert/unsubstituiert) sind Entgiftungs-/Biotransformationsprodukte, die beim Abbau von Methylnaphthalin, Phenanthren und Anthracen entstehen und in das verbrauchte Kulturmedium freigesetzt werden. Es wurde berichtet, dass das Bodenisolat Stenotrophomonas maltophilia CSV89 1-Naphthoesäure als Kohlenstoffquelle verstoffwechseln kann (Phale et al., 1995). Der Metabolismus beginnt mit der Dihydroxylierung des aromatischen Rings zu 1,2-Dihydroxy-8-carboxynaphthalin. Das entstehende Diol wird über 2-Hydroxy-3-carboxybenzylidenpyruvat, 3-Formylsalicylsäure, 2-Hydroxyisophthalsäure und Salicylsäure zu Brenzcatechin oxidiert und gelangt über die meta-Ringspaltung in den zentralen Kohlenstoffstoffwechselweg (Abbildung 3).
Carbaryl ist ein Naphthylcarbamat-Pestizid. Seit der Grünen Revolution in Indien in den 1970er Jahren hat der Einsatz chemischer Düngemittel und Pestizide zu einem Anstieg der Emissionen polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (PAK) aus diffusen landwirtschaftlichen Quellen geführt (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Schätzungsweise 55 % (85.722.000 Hektar) der gesamten Ackerfläche Indiens werden mit chemischen Pestiziden behandelt. In den letzten fünf Jahren (2015–2020) verbrauchte der indische Agrarsektor durchschnittlich 55.000 bis 60.000 Tonnen Pestizide pro Jahr (Ministerium für Genossenschaften und Bauernwohlfahrt, Landwirtschaftsministerium, Regierung von Indien, August 2020). In der nördlichen und zentralen Gangesebene (den bevölkerungsreichsten Bundesstaaten) ist der Einsatz von Pestiziden im Ackerbau weit verbreitet, wobei Insektizide überwiegen. Carbaryl (1-Naphthyl-N-methylcarbamat) ist ein breit wirksames, mäßig bis stark toxisches Carbamatinsektizid, das in der indischen Landwirtschaft mit einer durchschnittlichen Aufwandmenge von 100–110 Tonnen eingesetzt wird. Es wird üblicherweise unter dem Handelsnamen Sevin vertrieben und dient der Bekämpfung von Insekten (Blattläusen, Feuerameisen, Flöhen, Milben, Spinnen und vielen anderen Schädlingen im Freien), die verschiedene Nutzpflanzen (Mais, Sojabohnen, Baumwolle, Obst und Gemüse) befallen. Zur Bekämpfung anderer Schädlinge können auch Mikroorganismen wie Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus und Arthrobacter eingesetzt werden. Es wurde berichtet, dass RC100 Carbaryl abbauen kann (Larkin und Day, 1986; Chapalamadugu und Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha und Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Der Abbauweg von Carbaryl wurde in Bodenisolaten der Pseudomonas sp. Stämme C4, C5 und C6 umfassend auf biochemischer, enzymatischer und genetischer Ebene untersucht (Swetha und Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (Abb. 3). Der Stoffwechselweg beginnt mit der Hydrolyse der Esterbindung durch Carbarylhydrolase (CH), wobei 1-Naphthol, Methylamin und Kohlendioxid entstehen. 1-Naphthol wird durch 1-Naphtholhydroxylase (1-NH) in 1,2-Dihydroxynaphthalin umgewandelt, welches anschließend über den zentralen Kohlenstoffstoffwechselweg via Salicylat und Gentisat weiter verstoffwechselt wird. Einige Carbaryl-abbauende Bakterien metabolisieren es durch Spaltung des Catechol-ortho-Rings zu Salicylsäure (Larkin und Day, 1986; Chapalamadugu und Chaudhry, 1991). Naphthalin-abbauende Bakterien metabolisieren Salicylsäure primär über Catechol, während Carbaryl-abbauende Bakterien Salicylsäure bevorzugt über den Gentisatweg verstoffwechseln.
Naphthalinsulfonsäure/Disulfonsäure und Naphthylaminsulfonsäurederivate können als Zwischenprodukte bei der Herstellung von Azofarbstoffen, Netzmitteln, Dispergiermitteln usw. verwendet werden. Obwohl diese Verbindungen für den Menschen eine geringe Toxizität aufweisen, haben Zytotoxizitätsstudien gezeigt, dass sie für Fische, Daphnien und Algen letal sind (Greim et al., 1994). Vertreter der Gattung Pseudomonas (Stämme A3, C22) initiieren den Metabolismus durch doppelte Hydroxylierung des die Sulfonsäuregruppe enthaltenden aromatischen Rings zu einem Dihydrodiol, welches durch spontane Abspaltung der Sulfitgruppe weiter zu 1,2-Dihydroxynaphthalin umgewandelt wird (Brilon et al., 1981). Das resultierende 1,2-Dihydroxynaphthalin wird über den klassischen Naphthalinweg, d. h. den Catechol- oder Gentisatweg, abgebaut (Abbildung 4). Es wurde gezeigt, dass Aminonaphthalinsulfonsäure und Hydroxynaphthalinsulfonsäure durch gemischte Bakterienkonsortien mit komplementären katabolen Stoffwechselwegen vollständig abgebaut werden können (Nortemann et al., 1986). Dabei desulfuriert ein Mitglied des Konsortiums Aminonaphthalinsulfonsäure bzw. Hydroxynaphthalinsulfonsäure durch 1,2-Dioxygenierung, während Aminosalicylat bzw. Hydroxysalicylat als Endprodukt in das Kulturmedium freigesetzt und anschließend von anderen Mitgliedern des Konsortiums aufgenommen wird. Naphthalindisulfonsäure ist relativ polar, aber schwer abbaubar und kann daher über verschiedene Stoffwechselwege verstoffwechselt werden. Die erste Desulfurierung erfolgt während der regioselektiven Dihydroxylierung des aromatischen Rings und der Sulfonsäuregruppe. Die zweite Entschwefelung erfolgt während der Hydroxylierung von 5-Sulfosalicylsäure durch Salicylsäure-5-Hydroxylase zu Gentisinsäure, die in den zentralen Kohlenstoffkreislauf eintritt (Brilon et al., 1981) (Abbildung 4). Die für den Naphthalinabbau verantwortlichen Enzyme sind auch am Naphthalinsulfonat-Stoffwechsel beteiligt (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Abbildung 4. Stoffwechselwege des Naphthalinsulfonats. Die Zahlen in den Kreisen bezeichnen die für den Naphthylsulfonat-Stoffwechsel verantwortlichen Enzyme, ähnlich/identisch mit den in Abb. 3 beschriebenen Enzymen.
Niedermolekulare PAK (LMW-PAK) sind reduzierbar, hydrophob und schwerlöslich und daher nicht dem natürlichen Abbau unterworfen. Aerobe Mikroorganismen können sie jedoch durch Absorption von molekularem Sauerstoff (O₂) oxidieren. Diese Enzyme gehören hauptsächlich zur Klasse der Oxidoreduktasen und katalysieren verschiedene Reaktionen wie die Hydroxylierung (Mono- oder Dihydroxylierung), Dehydrierung und Spaltung aromatischer Ringe. Die Reaktionsprodukte weisen eine höhere Oxidationsstufe auf und werden leichter über den zentralen Kohlenstoffstoffwechselweg verstoffwechselt (Phale et al., 2020). Die Enzyme dieses Abbauwegs sind induzierbar. Ihre Aktivität ist sehr gering oder vernachlässigbar, wenn die Zellen auf einfachen Kohlenstoffquellen wie Glucose oder organischen Säuren kultiviert werden. Tabelle 3 fasst die verschiedenen Enzyme (Oxygenasen, Hydrolasen, Dehydrogenasen, Oxidasen usw.) zusammen, die am Stoffwechsel von Naphthalin und seinen Derivaten beteiligt sind.
Tabelle 3. Biochemische Eigenschaften der Enzyme, die für den Abbau von Naphthalin und seinen Derivaten verantwortlich sind.
Radioisotopenstudien (¹⁸O₂) haben gezeigt, dass der Einbau von molekularem Sauerstoff (O₂) in aromatische Ringe durch Oxygenasen der wichtigste Schritt für die Aktivierung des weiteren biologischen Abbaus einer Verbindung ist (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Der Einbau eines Sauerstoffatoms (O) aus molekularem Sauerstoff (O₂) in das Substrat wird entweder durch endogene oder exogene Monooxygenasen (auch Hydroxylasen genannt) initiiert. Ein weiteres Sauerstoffatom wird zu Wasser reduziert. Exogene Monooxygenasen reduzieren Flavin mit NADH oder NADPH, während bei endogenen Monooxygenasen Flavin durch das Substrat reduziert wird. Die Position der Hydroxylierung führt zu einer Vielfalt an Produkten. Beispielsweise hydroxyliert die Salicylat-1-Hydroxylase Salicylsäure an der C1-Position und bildet so Brenzcatechin. Andererseits hydroxyliert die aus mehreren Komponenten bestehende Salicylat-5-Hydroxylase (mit den Untereinheiten Reduktase, Ferredoxin und Oxygenase) die Salicylsäure an der C5-Position und bildet dabei Gentisinsäure (Yamamoto et al., 1965).
Dioxygenasen bauen zwei Sauerstoffatome in das Substrat ein. Je nach den entstehenden Produkten werden sie in ringhydroxylierende und ringspaltende Dioxygenasen unterteilt. Ringhydroxylierende Dioxygenasen wandeln aromatische Substrate in cis-Dihydrodiole (z. B. Naphthalin) um und sind weit verbreitet in Bakterien. Bisherige Studien haben gezeigt, dass Organismen mit ringhydroxylierenden Dioxygenasen auf verschiedenen aromatischen Kohlenstoffquellen wachsen können. Diese Enzyme werden als Naphthalin-Dioxygenase (NDO), Toluol-Dioxygenase (TDO) und Biphenyl-Dioxygenase (BPDO) klassifiziert. Sowohl NDO als auch BPDO können die Doppeloxidation und Seitenkettenhydroxylierung verschiedener polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (Toluol, Nitrotoluol, Xylol, Ethylbenzol, Naphthalin, Biphenyl, Fluoren, Indol, Methylnaphthalin, Naphthalinsulfonat, Phenanthren, Anthracen, Acetophenon usw.) katalysieren (Boyd und Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO ist ein Mehrkomponentensystem, bestehend aus einer Oxidoreduktase, einem Ferredoxin und einer Oxygenasekomponente mit aktivem Zentrum (Gibson und Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). Die katalytische Einheit von NDO besteht aus einer großen α-Untereinheit und einer kleinen β-Untereinheit in einer α₃β₃-Konfiguration. NDO gehört zu einer großen Familie von Oxygenasen. Seine α-Untereinheit enthält eine Rieske-Stelle [2Fe-2S] und ein mononukleäres Nicht-Häm-Eisenatom, welches die Substratspezifität von NDO bestimmt (Parales et al., 1998). Typischerweise werden in einem katalytischen Zyklus zwei Elektronen aus der Reduktion von Pyridinnukleotid über eine Reduktase, ein Ferredoxin und eine Rieske-Stelle auf das Fe(II)-Ion im aktiven Zentrum übertragen. Die Reduktionsäquivalente aktivieren molekularen Sauerstoff, der eine Voraussetzung für die Substrat-Dihydroxylierung ist (Ferraro et al., 2005). Bislang wurden nur wenige NDOs aus verschiedenen Stämmen gereinigt und detailliert charakterisiert, und die genetische Kontrolle der am Naphthalinabbau beteiligten Stoffwechselwege wurde eingehend untersucht (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Ringspaltende Dioxygenasen (endo- oder ortho-Ringspaltende Enzyme und exodiol- oder meta-Ringspaltende Enzyme) wirken auf hydroxylierte aromatische Verbindungen. Beispielsweise ist die ortho-Ringspaltende Dioxygenase die Catechol-1,2-Dioxygenase, während die meta-Ringspaltende Dioxygenase die Catechol-2,3-Dioxygenase ist (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Neben verschiedenen Oxygenasen existieren auch verschiedene Dehydrogenasen, die für die Dehydrierung aromatischer Dihydrodiole, Alkohole und Aldehyde unter Verwendung von NAD+/NADP+ als Elektronenakzeptoren verantwortlich sind. Diese Enzyme spielen eine wichtige Rolle im Stoffwechsel (Gibson und Subramanian, 1984; Shaw und Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Enzyme wie Hydrolasen (Esterasen, Amidasen) bilden eine weitere wichtige Enzymklasse, die mithilfe von Wasser kovalente Bindungen spaltet und eine breite Substratspezifität aufweist. Carbarylhydrolase und andere Hydrolasen gelten als Bestandteile des Periplasmas (Transmembranbereich) gramnegativer Bakterien (Kamini et al., 2018). Carbaryl besitzt sowohl eine Amid- als auch eine Esterbindung und kann daher durch Esterasen oder Amidasen zu 1-Naphthol hydrolysiert werden. Carbaryl in Rhizobium rhizobium Stamm AC10023 und Arthrobacter Stamm RC100 fungiert als Esterase bzw. Amidase. In Arthrobacter Stamm RC100 wirkt Carbaryl zusätzlich als Amidase. Es wurde gezeigt, dass RC100 vier Insektizide der N-Methylcarbamat-Klasse hydrolysiert, darunter Carbaryl, Methomyl, Mefenaminsäure und XMC (Hayaatsu et al., 2001). Es wurde berichtet, dass CH in Pseudomonas sp. C5pp Carbaryl (100 % Aktivität) und 1-Naphthylacetat (36 % Aktivität) spalten kann, nicht aber 1-Naphthylacetamid, was darauf hindeutet, dass es sich um eine Esterase handelt (Trivedi et al., 2016).
Biochemische Studien, Enzymregulationsmuster und genetische Analysen haben gezeigt, dass die Gene des Naphthalinabbaus aus zwei induzierbaren regulatorischen Einheiten oder „Operons“ bestehen: nah (der „Upstream-Pathway“, der Naphthalin in Salicylsäure umwandelt) und sal (der „Downstream-Pathway“, der Salicylsäure über Catechol in den zentralen Kohlenstoffstoffwechselweg umwandelt). Salicylsäure und ihre Analoga können als Induktoren wirken (Shamsuzzaman und Barnsley, 1974). In Gegenwart von Glucose oder organischen Säuren wird das Operon reprimiert. Abbildung 5 zeigt die vollständige genetische Organisation des Naphthalinabbaus (in Operonform). Mehrere benannte Varianten/Formen des nah-Gens (ndo/pah/dox) wurden beschrieben und weisen eine hohe Sequenzhomologie (90 %) zwischen allen Pseudomonas-Arten auf (Abbasian et al., 2016). Die Gene des Naphthalin-Upstream-Pathways sind im Allgemeinen in einer Konsensusreihenfolge angeordnet, wie in Abbildung 5A dargestellt. Ein weiteres Gen, nahQ, ist ebenfalls am Naphthalinstoffwechsel beteiligt und befindet sich üblicherweise zwischen nahC und nahE, seine genaue Funktion ist jedoch noch nicht geklärt. Ebenso wurde das für die Naphthalin-sensitive Chemotaxis verantwortliche Gen nahY bei einigen Vertretern am distalen Ende des nah-Operons gefunden. In Ralstonia sp. wurde das für die Glutathion-S-Transferase (gsh) kodierende Gen U2 zwischen nahAa und nahAb lokalisiert, hatte aber keinen Einfluss auf die Naphthalinverwertung (Zylstra et al., 1997).
Abbildung 5. Genetische Organisation und Diversität, die während des Naphthalinabbaus bei verschiedenen Bakterienarten beobachtet wurden; (A) Oberer Naphthalinweg, Metabolisierung von Naphthalin zu Salicylsäure; (B) Unterer Naphthalinweg, Salicylsäure über Catechol zum zentralen Kohlenstoffweg; (C) Salicylsäure über Gentisat zum zentralen Kohlenstoffweg.
Der „untere Stoffwechselweg“ (sal-Operon) besteht typischerweise aus nahGTHINLMOKJ und wandelt Salicylat über den Catechol-Metaring-Spaltungsweg in Pyruvat und Acetaldehyd um. Das nahG-Gen (kodierend für Salicylathydroxylase) ist am proximalen Ende des Operons konserviert (Abb. 5B). Im Vergleich zu anderen Naphthalin-abbauenden Stämmen sind die nah- und sal-Operons in P. putida CSV86 tandemartig angeordnet und sehr eng verwandt (ca. 7,5 kb). In einigen gramnegativen Bakterien, wie z. B. Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 und P. putida AK5, wird Naphthalin als zentrales Kohlenstoffmetabolit über den Gentisatweg (in Form des sgp/nag-Operons) verstoffwechselt. Die Genkassette wird typischerweise in der Form nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI dargestellt, wobei sich nagR (das für einen Regulator vom LysR-Typ kodiert) am oberen Ende befindet (Abbildung 5C).
Carbaryl gelangt über den Metabolismus von 1-Naphthol, 1,2-Dihydroxynaphthalin, Salicylsäure und Gentisinsäure in den zentralen Kohlenstoffkreislauf (Abbildung 3). Basierend auf genetischen und metabolischen Studien wurde vorgeschlagen, diesen Stoffwechselweg in einen „vorgelagerten“ (Umwandlung von Carbaryl in Salicylsäure), einen „mittleren“ (Umwandlung von Salicylsäure in Gentisinsäure) und einen „nachgelagerten“ (Umwandlung von Gentisinsäure in Zwischenprodukte des zentralen Kohlenstoffkreislaufs) zu unterteilen (Singh et al., 2013). Die Genomanalyse von C5pp (Supercontig A, 76,3 kb) ergab, dass das Gen mcbACBDEF an der Umwandlung von Carbaryl in Salicylsäure beteiligt ist, gefolgt von mcbIJKL bei der Umwandlung von Salicylsäure in Gentisinsäure und mcbOQP bei der Umwandlung von Gentisinsäure in zentrale Kohlenstoffzwischenprodukte (Fumarat und Pyruvat, Trivedi et al., 2016) (Abbildung 6).
Es wurde berichtet, dass Enzyme, die am Abbau aromatischer Kohlenwasserstoffe (einschließlich Naphthalin und Salicylsäure) beteiligt sind, durch die entsprechenden Verbindungen induziert und durch einfache Kohlenstoffquellen wie Glucose oder organische Säuren gehemmt werden können (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Von den verschiedenen Stoffwechselwegen des Naphthalins und seiner Derivate wurden die regulatorischen Merkmale von Naphthalin und Carbaryl bereits teilweise untersucht. Beim Naphthalin werden Gene sowohl im Upstream- als auch im Downstream-Stoffwechselweg durch NahR reguliert, einen LysR-artigen, trans-aktiven positiven Regulator. NahR ist für die Induktion des nah-Gens durch Salicylsäure und dessen anschließende hohe Expression erforderlich (Yen und Gunsalus, 1982). Des Weiteren haben Studien gezeigt, dass der integrative Wirtsfaktor (IHF) und XylR (ein Sigma-54-abhängiger Transkriptionsregulator) ebenfalls entscheidend für die transkriptionelle Aktivierung von Genen im Naphthalinstoffwechsel sind (Ramos et al., 1997). Studien haben gezeigt, dass Enzyme des Catechol-Meta-Ringöffnungswegs, insbesondere die Catechol-2,3-Dioxygenase, in Gegenwart von Naphthalin und/oder Salicylsäure induziert werden (Basu et al., 2006). Studien haben außerdem gezeigt, dass Enzyme des Catechol-Ortho-Ringöffnungswegs, insbesondere die Catechol-1,2-Dioxygenase, in Gegenwart von Benzoesäure und cis,cis-Muconat induziert werden (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
Im Stamm C5pp kodieren fünf Gene, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR und mcbS, Regulatoren der LysR/TetR-Familie von Transkriptionsregulatoren, die für die Kontrolle des Carbarylabbaus verantwortlich sind. Das homologe Gen mcbG ist am engsten mit dem LysR-Typ-Regulator PhnS (58 % Aminosäureidentität) verwandt, der am Phenanthrenstoffwechsel in Burkholderia RP00725 beteiligt ist (Trivedi et al., 2016). Das Gen mcbH ist am Zwischenproduktweg (Umwandlung von Salicylsäure in Gentisinsäure) beteiligt und gehört zur LysR-Typ-Transkriptionsregulatorfamilie NagR/DntR/NahR in Pseudomonas und Burkholderia. Mitglieder dieser Familie erkennen Salicylsäure als spezifisches Effektormolekül zur Induktion von Abbaugenen. Andererseits wurden im nachgeschalteten Stoffwechselweg (Gentisat-zentraler Kohlenstoffstoffwechselweg) drei Gene, mcbN, mcbR und mcbS, identifiziert, die zu den Transkriptionsregulatoren vom Typ LysR und TetR gehören.
Bei Prokaryoten sind horizontale Gentransferprozesse (Aufnahme, Austausch oder Übertragung) über Plasmide, Transposons, Prophagen, genomische Inseln und integrative konjugative Elemente (ICE) Hauptursachen für die Plastizität bakterieller Genome und führen zum Gewinn oder Verlust spezifischer Funktionen/Merkmale. Dies ermöglicht Bakterien eine schnelle Anpassung an unterschiedliche Umweltbedingungen und bietet dem Wirt potenziell adaptive metabolische Vorteile, wie beispielsweise den Abbau aromatischer Verbindungen. Metabolische Veränderungen werden häufig durch die Feinabstimmung von Abbau-Operons, deren Regulationsmechanismen und Enzymspezifitäten erreicht, was den Abbau eines breiteren Spektrums aromatischer Verbindungen ermöglicht (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Die Genkassetten für den Naphthalinabbau wurden auf verschiedenen mobilen Elementen wie Plasmiden (konjugativ und nicht-konjugativ), Transposons, Genomen, ICEs und Kombinationen verschiedener Bakterienarten gefunden (Abbildung 5). In Pseudomonas G7 werden die nah- und sal-Operons des Plasmids NAH7 in gleicher Orientierung transkribiert und sind Teil eines defekten Transposons, dessen Mobilisierung die Transposase Tn4653 erfordert (Sota et al., 2006). Im Pseudomonas-Stamm NCIB9816-4 wurde das Gen auf dem konjugativen Plasmid pDTG1 als zwei Operons (ca. 15 kb voneinander entfernt) gefunden, die in entgegengesetzter Richtung transkribiert werden (Dennis und Zylstra, 2004). Im Pseudomonas putida-Stamm AK5 kodiert das nicht-konjugative Plasmid pAK5 das Enzym, das für den Naphthalinabbau über den Gentisatweg verantwortlich ist (Izmalkova et al., 2013). Im Pseudomonas-Stamm PMD-1 befindet sich das nah-Operon auf dem Chromosom, während das sal-Operon auf dem konjugativen Plasmid pMWD-1 lokalisiert ist (Zuniga et al., 1981). Im Gegensatz dazu liegen bei Pseudomonas stutzeri AN10 alle Gene für den Naphthalinabbau (nah- und sal-Operon) auf dem Chromosom und werden vermutlich durch Transposition, Rekombination und Umlagerung rekrutiert (Bosch et al., 2000). Bei Pseudomonas sp. CSV86 sind die nah- und sal-Operons im Genom als ICE (ICECSV86) lokalisiert. Die Struktur wird durch tRNAGly geschützt, gefolgt von direkten Wiederholungen, die Rekombinations-/Anheftungsstellen (attR und attL) anzeigen, sowie einer phagenähnlichen Integrase an beiden Enden von tRNAGly. Sie weist daher strukturelle Ähnlichkeit zum ICEclc-Element auf (ICEclcB13 in Pseudomonas knackmusii für den Abbau von Chlorcatechol). Es wurde berichtet, dass Gene auf ICE durch Konjugation mit einer extrem niedrigen Transferfrequenz (10⁻⁸) übertragen werden können, wodurch Abbauprozesse auf den Empfänger übertragen werden (Basu und Phale, 2008; Phale et al., 2019).
Die meisten Gene, die für den Carbaryl-Abbau verantwortlich sind, befinden sich auf Plasmiden. Arthrobacter sp. RC100 enthält drei Plasmide (pRC1, pRC2 und pRC300), von denen zwei konjugative Plasmide, pRC1 und pRC2, die Enzyme kodieren, welche Carbaryl in Gentisat umwandeln. Die Enzyme, die an der Umwandlung von Gentisat in zentrale Kohlenstoffmetaboliten beteiligt sind, befinden sich hingegen auf dem Chromosom (Hayaatsu et al., 1999). Bakterien der Gattung Rhizobium, Stamm AC100, der für die Umwandlung von Carbaryl in 1-Naphthol verwendet wird, enthalten das Plasmid pAC200. Dieses trägt das Gen cehA, das CH als Teil des Transposons Tnceh kodiert und von insertionselementähnlichen Sequenzen (istA und istB) umgeben ist (Hashimoto et al., 2002). Im Sphingomonas-Stamm CF06 befindet sich das Gen für den Carbaryl-Abbau vermutlich auf fünf Plasmiden: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 und pCF05. Die hohe DNA-Homologie dieser Plasmide deutet auf eine Genduplikation hin (Feng et al., 1997). In einem Carbaryl-abbauenden Symbionten aus zwei Pseudomonas-Arten enthält der Stamm 50581 ein konjugatives Plasmid pCD1 (50 kb), das für die mcd-Carbarylhydrolase kodiert, während das konjugative Plasmid im Stamm 50552 für ein 1-Naphthol-abbauendes Enzym kodiert (Chapalamadugu und Chaudhry, 1991). Im Achromobacter-Stamm WM111 befindet sich das Gen für die Furadanhydrolase mcd auf einem 100 kb großen Plasmid (pPDL11). Dieses Gen wurde in verschiedenen Bakterien aus unterschiedlichen geografischen Regionen auf verschiedenen Plasmiden (100, 105, 115 oder 124 kb) nachgewiesen (Parekh et al., 1995). In Pseudomonas sp. C5pp sind alle für den Carbarylabbau verantwortlichen Gene in einem 76,3 kb langen Genom lokalisiert (Trivedi et al., 2016). Die Genomanalyse (6,15 Mb) ergab das Vorhandensein von 42 mobilen genetischen Elementen (MGEs) und 36 genetischen Elementen (GEIs), von denen 17 im Supercontig A (76,3 kb) mit einem durchschnittlichen asymmetrischen G+C-Gehalt (54–60 Mol-%) lokalisiert waren, was auf mögliche horizontale Gentransferereignisse hindeutet (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 weist eine ähnliche Anordnung von Carbaryl-abbauenden Genen auf, diese befinden sich jedoch auf einem Plasmid (Zhu et al., 2019).
Neben der metabolischen Effizienz auf biochemischer und genomischer Ebene weisen Mikroorganismen auch andere Eigenschaften oder Reaktionen auf, wie Chemotaxis, Eigenschaften der Zelloberflächenmodifikation, Kompartimentierung, bevorzugte Nutzung, Biosurfactant-Produktion usw., die ihnen helfen, aromatische Schadstoffe in kontaminierten Umgebungen effizienter zu metabolisieren (Abbildung 7).
Abbildung 7. Verschiedene zelluläre Reaktionsstrategien idealer aromatischer Kohlenwasserstoff-abbauender Bakterien für den effizienten biologischen Abbau von Fremdschadstoffen.
Chemotaktische Reaktionen gelten als Faktoren, die den Abbau organischer Schadstoffe in heterogen belasteten Ökosystemen fördern. (2002) zeigten, dass die Chemotaxis von Pseudomonas sp. G7 zu Naphthalin die Abbaurate von Naphthalin in aquatischen Systemen erhöhte. Der Wildtyp-Stamm G7 baute Naphthalin deutlich schneller ab als ein chemotaxis-defizienter Mutantenstamm. Das NahY-Protein (538 Aminosäuren mit Membrantopologie) wurde zusammen mit den Genen des Metacleavage-Stoffwechselwegs auf dem NAH7-Plasmid kotranskribiert. Ähnlich wie Chemotaxis-Transduktoren scheint dieses Protein als Chemorezeptor für den Naphthalinabbau zu fungieren (Grimm und Harwood 1997). Eine weitere Studie von Hansel et al. (2009) zeigte, dass das Protein chemotaktisch ist, aber eine hohe Abbaurate aufweist. (2011) demonstrierten eine chemotaktische Reaktion von Pseudomonas (P. putida) auf gasförmiges Naphthalin. Dabei führte die Diffusion in der Gasphase zu einem stetigen Naphthalinfluss zu den Zellen, wodurch deren chemotaktische Reaktion gesteuert wurde. Die Forscher nutzten dieses chemotaktische Verhalten, um Mikroorganismen zu entwickeln, die die Abbaurate erhöhen. Studien haben gezeigt, dass chemosensorische Signalwege auch andere zelluläre Funktionen wie Zellteilung, Zellzyklusregulation und Biofilmbildung regulieren und somit zur Kontrolle der Abbaurate beitragen. Die Nutzung dieser Eigenschaft (Chemotaxis) für einen effizienten Abbau wird jedoch durch mehrere Hindernisse erschwert. Die größten Hürden sind: (a) verschiedene paraloge Rezeptoren erkennen dieselben Verbindungen/Liganden; (b) die Existenz alternativer Rezeptoren, d. h. energetischer Tropismus; (c) signifikante Sequenzunterschiede in den sensorischen Domänen derselben Rezeptorfamilie. und (d) fehlende Informationen zu den wichtigsten bakteriellen Sensorproteinen (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Der Abbau aromatischer Kohlenwasserstoffe führt mitunter zur Bildung mehrerer Metaboliten/Zwischenprodukte, die für eine Bakteriengruppe chemotaktisch, für andere jedoch abstoßend wirken und den Prozess dadurch zusätzlich verkomplizieren. Um die Wechselwirkungen von Liganden (aromatischen Kohlenwasserstoffen) mit chemischen Rezeptoren zu identifizieren, konstruierten wir hybride Sensorproteine ​​(PcaY, McfR und NahY) durch Fusion der Sensor- und Signaldomänen von Pseudomonas putida und Escherichia coli. Diese Proteine ​​binden an die Rezeptoren für aromatische Säuren, TCA-Zwischenprodukte bzw. Naphthalin (Luu et al., 2019).
Unter dem Einfluss von Naphthalin und anderen polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) verändern sich die Struktur der Bakterienmembran und die Integrität der Mikroorganismen signifikant. Studien haben gezeigt, dass Naphthalin die Wechselwirkung der Acylketten durch hydrophobe Wechselwirkungen stört und dadurch die Quellung und Fluidität der Membran erhöht (Sikkema et al., 1995). Um diesem schädlichen Effekt entgegenzuwirken, regulieren Bakterien die Membranfluidität, indem sie das Verhältnis und die Fettsäurezusammensetzung zwischen iso- und anteiso-verzweigten Fettsäuren verändern und cis-ungesättigte Fettsäuren in die entsprechenden trans-Isomere isomerisieren (Heipieper und de Bont, 1994). In Pseudomonas stutzeri, die mit Naphthalin behandelt wurden, stieg das Verhältnis von gesättigten zu ungesättigten Fettsäuren von 1,1 auf 2,1, während es in Pseudomonas JS150 von 7,5 auf 12,0 anstieg (Mrozik et al., 2004). Beim Wachstum auf Naphthalin zeigten Achromobacter KAs 3–5-Zellen eine Zellaggregation um Naphthalinkristalle und eine Abnahme der Zelloberflächenladung (von -22,5 auf -2,5 mV), begleitet von Zytoplasmakondensation und Vakuolisierung. Dies deutet auf Veränderungen der Zellstruktur und der Zelloberflächeneigenschaften hin (Mohapatra et al., 2019). Obwohl zelluläre/Oberflächenveränderungen direkt mit einer verbesserten Aufnahme aromatischer Schadstoffe zusammenhängen, sind entsprechende biotechnologische Strategien noch nicht vollständig optimiert. Die Manipulation der Zellform wurde selten zur Optimierung biologischer Prozesse eingesetzt (Volke und Nikel, 2018). Die Deletion von Genen, die die Zellteilung beeinflussen, führt zu Veränderungen der Zellmorphologie. In Bacillus subtilis wurde gezeigt, dass das Zellseptumprotein SepF an der Septumbildung beteiligt und für nachfolgende Schritte der Zellteilung erforderlich ist, jedoch kein essentielles Gen darstellt. Die Deletion von Genen, die für Peptid-Glycan-Hydrolasen in Bacillus subtilis kodieren, führte zu einer Zellverlängerung, einer erhöhten spezifischen Wachstumsrate und einer verbesserten Enzymproduktionskapazität (Cui et al., 2018).
Die Kompartimentierung des Carbaryl-Abbauwegs wurde vorgeschlagen, um einen effizienten Abbau der Pseudomonas-Stämme C5pp und C7 zu erreichen (Kamini et al., 2018). Es wird angenommen, dass Carbaryl durch das Septum der äußeren Membran und/oder durch diffusible Porine in den periplasmatischen Raum transportiert wird. CH ist ein periplasmatisches Enzym, das die Hydrolyse von Carbaryl zu 1-Naphthol katalysiert. 1-Naphthol ist stabiler, hydrophober und toxischer. CH ist im Periplasma lokalisiert und weist eine geringe Affinität zu Carbaryl auf. Dadurch wird die Bildung von 1-Naphthol kontrolliert, dessen Akkumulation in den Zellen verhindert und dessen Toxizität für die Zellen reduziert (Kamini et al., 2018). Das entstehende 1-Naphthol wird durch Verteilung und/oder Diffusion über die innere Membran in das Zytoplasma transportiert und dort anschließend durch das hochaffine Enzym 1NH zu 1,2-Dihydroxynaphthalin hydroxyliert, das dann im zentralen Kohlenstoffstoffwechsel weiter verstoffwechselt wird.
Obwohl Mikroorganismen die genetischen und metabolischen Fähigkeiten besitzen, xenobiotische Kohlenstoffquellen abzubauen, stellt die hierarchische Struktur ihrer Nutzung (d. h. die bevorzugte Verwendung einfacher gegenüber komplexen Kohlenstoffquellen) ein großes Hindernis für den biologischen Abbau dar. Die Anwesenheit und Nutzung einfacher Kohlenstoffquellen führt zur Herunterregulierung von Genen, die für Enzyme kodieren, welche komplexe/nicht bevorzugte Kohlenstoffquellen wie PAK abbauen. Ein gut untersuchtes Beispiel ist die gleichzeitige Fütterung von Glucose und Lactose an Escherichia coli, wobei Glucose effizienter verwertet wird als Lactose (Jacob und Monod, 1965). Pseudomonas ist dafür bekannt, eine Vielzahl von PAK und xenobiotischen Verbindungen als Kohlenstoffquellen abzubauen. Die Hierarchie der Kohlenstoffquellennutzung in Pseudomonas lautet: organische Säuren > Glucose > aromatische Verbindungen (Hylemon und Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Es gibt jedoch eine Ausnahme. Interessanterweise zeigt Pseudomonas sp. CSV86 weist eine einzigartige hierarchische Struktur auf, die aromatische Kohlenwasserstoffe (Benzoesäure, Naphthalin usw.) bevorzugt gegenüber Glucose nutzt und diese zusammen mit organischen Säuren verstoffwechselt (Basu et al., 2006). In diesem Bakterium werden die Gene für den Abbau und Transport aromatischer Kohlenwasserstoffe selbst in Gegenwart einer zweiten Kohlenstoffquelle wie Glucose oder organischen Säuren nicht herunterreguliert. Beim Wachstum in einem Medium mit Glucose und aromatischen Kohlenwasserstoffen wurde beobachtet, dass die Gene für den Glucosetransport und -stoffwechsel herunterreguliert waren, aromatische Kohlenwasserstoffe in der ersten logarithmischen Wachstumsphase und Glucose in der zweiten logarithmischen Wachstumsphase verbraucht wurden (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Andererseits beeinflusste die Anwesenheit organischer Säuren die Expression des Stoffwechsels aromatischer Kohlenwasserstoffe nicht, weshalb dieses Bakterium als Kandidat für Studien zur biologischen Abbaubarkeit gilt (Phale et al., 2020).
Es ist bekannt, dass die Biotransformation von Kohlenwasserstoffen oxidativen Stress und eine Hochregulierung antioxidativer Enzyme in Mikroorganismen verursachen kann. Ein ineffizienter Naphthalinabbau, sowohl in Zellen der stationären Phase als auch in Gegenwart toxischer Verbindungen, führt zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) (Kang et al. 2006). Da naphthalinabbauende Enzyme Eisen-Schwefel-Cluster enthalten, wird unter oxidativem Stress das Eisen im Häm und in Eisen-Schwefel-Proteinen oxidiert, was zur Inaktivierung der Proteine ​​führt. Ferredoxin-NADP+-Reduktase (Fpr) vermittelt zusammen mit Superoxiddismutase (SOD) die reversible Redoxreaktion zwischen NADP+/NADPH und zwei Molekülen Ferredoxin oder Flavodoxin. Dadurch werden ROS abgefangen und das Eisen-Schwefel-Zentrum unter oxidativem Stress wiederhergestellt (Li et al. 2006). Es wurde berichtet, dass sowohl Fpr als auch SodA (SOD) in Pseudomonas durch oxidativen Stress induziert werden können. Erhöhte SOD- und Katalaseaktivitäten wurden in vier Pseudomonas-Stämmen (O1, W1, As1 und G1) während des Wachstums unter Naphthalin-haltigen Bedingungen beobachtet (Kang et al., 2006). Studien haben gezeigt, dass die Zugabe von Antioxidantien wie Ascorbinsäure oder Eisen(II)-Ionen (Fe²⁺) die Wachstumsrate unter Naphthalin erhöhen kann. Beim Wachstum von Rhodococcus erythropolis in Naphthalin-haltigem Medium war die Transkription von oxidativem Stress-assoziierten Cytochrom-P450-Genen, darunter sodA (Fe/Mn-Superoxiddismutase), sodC (Cu/Zn-Superoxiddismutase) und recA, erhöht (Sazykin et al., 2019). Eine vergleichende quantitative Proteomanalyse von in Naphthalin kultivierten Pseudomonas-Zellen zeigte, dass die Hochregulierung verschiedener Proteine, die mit der oxidativen Stressreaktion in Zusammenhang stehen, eine Stressbewältigungsstrategie darstellt (Herbst et al., 2013).
Es wurde berichtet, dass Mikroorganismen unter dem Einfluss hydrophober Kohlenstoffquellen Biosurfactants produzieren. Diese Tenside sind amphiphile, oberflächenaktive Verbindungen, die an Öl-Wasser- oder Luft-Wasser-Grenzflächen Aggregate bilden können. Dies fördert die Pseudosolubilisierung und erleichtert die Adsorption aromatischer Kohlenwasserstoffe, was zu einem effizienten biologischen Abbau führt (Rahman et al., 2002). Aufgrund dieser Eigenschaften finden Biosurfactants in verschiedenen Industriezweigen breite Anwendung. Die Zugabe chemischer Tenside oder Biosurfactants zu Bakterienkulturen kann die Effizienz und Geschwindigkeit des Kohlenwasserstoffabbaus erhöhen. Unter den Biosurfactants wurden die von Pseudomonas aeruginosa produzierten Rhamnolipide eingehend untersucht und charakterisiert (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Zu den weiteren Biosurfactants zählen Lipopeptide (Mucine aus Pseudomonas fluorescens), Emulgator 378 (ebenfalls aus Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg und Ron, 1999), Trehalose-Disaccharid-Lipide aus Rhodococcus (Ramdahl, 1985), Lichenin aus Bacillus (Saraswathy und Hallberg, 2002) sowie Tenside aus Bacillus subtilis (Siegmund und Wagner, 1991) und Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Diese hochwirksamen Tenside reduzieren die Oberflächenspannung von 72 dyn/cm auf unter 30 dyn/cm und ermöglichen so eine verbesserte Absorption von Kohlenwasserstoffen. Es wurde berichtet, dass Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia und andere Bakterienarten verschiedene Rhamnolipid- und Glykolipid-basierte Biosurfactants produzieren können, wenn sie in Naphthalin- und Methylnaphthalin-Medien kultiviert werden (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 kann das extrazelluläre Biosurfactant Biosur-Pm produzieren, wenn es auf aromatischen Verbindungen wie Naphthoesäure kultiviert wird (Phale et al., 1995). Die Kinetik der Biosur-Pm-Bildung zeigte, dass die Synthese ein wachstums- und pH-abhängiger Prozess ist. Es wurde festgestellt, dass die von Zellen bei neutralem pH-Wert produzierte Menge an Biosur-Pm höher war als bei pH 8,5. Zellen, die bei pH 8,5 kultiviert wurden, waren hydrophober und wiesen eine höhere Affinität zu aromatischen und aliphatischen Verbindungen auf als Zellen, die bei pH 7,0 kultiviert wurden. Bei Rhodococcus spp. N6 stellen ein hohes Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnis (C:N) und Eisenmangel optimale Bedingungen für die Produktion extrazellulärer Biosurfactants dar (Mutalik et al., 2008). Es wurden Versuche unternommen, die Biosynthese von Biosurfactants (Surfactinen) durch Optimierung von Stämmen und Fermentation zu verbessern. Der niedrige Tensidtiter im Kulturmedium (1,0 g/L) erschwert jedoch die Produktion im großen Maßstab (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Daher wurden gentechnische Methoden zur Verbesserung der Biosynthese eingesetzt. Die Modifizierung gestaltet sich jedoch aufgrund der Größe des Operons (ca. 25 kb) und der komplexen biosynthetischen Regulation durch das Quorum-Sensing-System schwierig (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). An Bacillus-Bakterien wurden verschiedene gentechnische Modifikationen durchgeführt, hauptsächlich mit dem Ziel, die Surfactin-Produktion durch Austausch des Promotors (srfA-Operon), Überexpression des Surfactin-Exportproteins YerP sowie der regulatorischen Faktoren ComX und PhrC zu steigern (Jiao et al., 2017). Diese Methoden haben jedoch bisher nur eine oder wenige genetische Modifikationen ermöglicht und noch keine kommerzielle Produktion erreicht. Daher ist die weitere Erforschung wissensbasierter Optimierungsmethoden notwendig.
Studien zum Abbau von PAK werden hauptsächlich unter Standardlaborbedingungen durchgeführt. An kontaminierten Standorten oder in kontaminierten Umgebungen beeinflussen jedoch zahlreiche abiotische und biotische Faktoren (Temperatur, pH-Wert, Sauerstoff, Nährstoffverfügbarkeit, Substratverfügbarkeit, andere Xenobiotika, Endprodukthemmung usw.) die Abbaukapazität von Mikroorganismen.
Die Temperatur hat einen signifikanten Einfluss auf den Abbau von PAK. Mit steigender Temperatur sinkt die Konzentration an gelöstem Sauerstoff, was den Stoffwechsel aerober Mikroorganismen beeinträchtigt, da diese molekularen Sauerstoff als Substrat für Oxygenasen benötigen, die Hydroxylierungs- oder Ringöffnungsreaktionen katalysieren. Häufig wird beobachtet, dass erhöhte Temperaturen die PAK in toxischere Verbindungen umwandeln und dadurch den Abbau hemmen (Muller et al., 1998).
Es wurde festgestellt, dass viele mit polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) kontaminierte Standorte extreme pH-Werte aufweisen, beispielsweise durch saure Grubenwässer (pH 1–4) oder durch alkalische Sickerwässer kontaminierte Erdgas-/Kohlevergasungsanlagen (pH 8–12). Diese Bedingungen können den biologischen Abbauprozess erheblich beeinträchtigen. Daher wird empfohlen, vor dem Einsatz von Mikroorganismen zur Sanierung den pH-Wert durch Zugabe geeigneter Chemikalien (mit mäßigem bis sehr niedrigem Redoxpotenzial) anzupassen, beispielsweise durch Ammoniumsulfat oder Ammoniumnitrat für alkalische Böden oder durch Kalkung mit Calciumcarbonat oder Magnesiumcarbonat für saure Standorte (Bowlen et al. 1995; Gupta und Sar 2020).
Die Sauerstoffversorgung des betroffenen Gebiets ist der geschwindigkeitsbestimmende Faktor für den Abbau von PAK. Aufgrund der Redoxbedingungen der Umgebung benötigen In-situ-Bioremediationsverfahren üblicherweise die Zufuhr von Sauerstoff aus externen Quellen (Bodenbearbeitung, Belüftung und Zugabe von Chemikalien) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) zeigten, dass die Zugabe von Magnesiumperoxid (einer sauerstofffreisetzenden Verbindung) zu einem kontaminierten Grundwasserleiter BTEX-Verbindungen effektiv bioremediieren kann. Eine weitere Studie untersuchte den In-situ-Abbau von Phenol und BTEX in einem kontaminierten Grundwasserleiter durch Injektion von Natriumnitrat und den Bau von Extraktionsbrunnen, um eine effektive Bioremediation zu erreichen (Bewley und Webb, 2001).