Aktuelle Adresse: Köln 50931, Deutschland, Exzellenzcluster Köln Forschung zur zellulären Stressreaktion bei altersbedingten Erkrankungen (CECAD).
Die Neurodegeneration bei mitochondrialen Erkrankungen gilt als irreversibel, da die metabolische Plastizität von Neuronen begrenzt ist. Der Einfluss mitochondrialer Dysfunktion auf die zelluläre Autonomie des neuronalen Stoffwechsels ist jedoch noch unzureichend erforscht. Wir präsentieren hier das zellspezifische Proteom von Purkinje-Neuronen mit progressivem OXPHOS-Mangel, verursacht durch eine gestörte mitochondriale Fusionsdynamik. Unsere Ergebnisse zeigen, dass mitochondriale Dysfunktion tiefgreifende Veränderungen im Proteom auslöst, die letztendlich zur sequenziellen Aktivierung präziser Stoffwechselprogramme vor dem Zelltod führen. Unerwarteterweise konnten wir eine deutliche Induktion der Pyruvatcarboxylase (PCx) und anderer Anti-Aging-Enzyme feststellen, die Zwischenprodukte des Citratzyklus bereitstellen. Die Hemmung von PCx verstärkte oxidativen Stress und Neurodegeneration, was darauf hindeutet, dass Atherosklerose in Neuronen mit OXPHOS-Mangel eine Schutzwirkung besitzt. Die Wiederherstellung der mitochondrialen Fusion in terminal degenerierten Neuronen kehrt diese metabolischen Veränderungen vollständig um und verhindert so den Zelltod. Unsere Ergebnisse identifizieren bisher unbekannte Signalwege, die Widerstandsfähigkeit gegenüber mitochondrialer Dysfunktion verleihen, und zeigen, dass die Neurodegeneration selbst in späten Stadien der Erkrankung rückgängig gemacht werden kann.
Die zentrale Rolle der Mitochondrien im neuronalen Energiestoffwechsel wird durch die vielfältigen neurologischen Symptome menschlicher Mitochondriopathien unterstrichen. Die meisten dieser Erkrankungen werden durch Genmutationen verursacht, die die mitochondriale Genexpression regulieren (1, 2), oder durch die Zerstörung von Genen, die mit der mitochondrialen Dynamik zusammenhängen und indirekt die Stabilität der mitochondrialen DNA (mtDNA) beeinflussen (3, 4). Studien an Tiermodellen haben gezeigt, dass als Reaktion auf mitochondriale Dysfunktion im umliegenden Gewebe konservative Stoffwechselwege aktiviert werden können (5–7). Dies liefert wichtige Erkenntnisse für ein tieferes Verständnis der Pathogenese dieser komplexen Erkrankungen. Im Gegensatz dazu ist unser Verständnis der Stoffwechselveränderungen spezifischer Zelltypen, die durch das allgemeine Versagen der mitochondrialen ATP-Produktion im Gehirn verursacht werden, grundlegend (8). Dies unterstreicht die Notwendigkeit, therapeutische Zielstrukturen zu identifizieren, die zur Prävention oder Verhinderung von Neurodegeneration eingesetzt werden können (9). Der Informationsmangel beruht darauf, dass Nervenzellen im Vergleich zu den Zelltypen des umliegenden Gewebes als metabolisch sehr flexibel gelten (10). Da diese Zellen eine zentrale Rolle bei der Koordination der Metabolitenversorgung von Neuronen spielen, um die synaptische Übertragung zu fördern und auf Verletzungen und Krankheiten zu reagieren, ist die Fähigkeit, den Zellstoffwechsel an die anspruchsvollen Bedingungen des Hirngewebes anzupassen, nahezu auf Gliazellen beschränkt (11–14). Darüber hinaus erschwert die inhärente zelluläre Heterogenität des Hirngewebes die Untersuchung metabolischer Veränderungen in spezifischen neuronalen Subgruppen erheblich. Daher ist wenig über die genauen zellulären und metabolischen Folgen mitochondrialer Dysfunktion in Neuronen bekannt.
Um die metabolischen Folgen mitochondrialer Dysfunktion zu verstehen, isolierten wir Purkinje-Neuronen (PNs) in verschiedenen Stadien der Neurodegeneration, die durch die Zerstörung der mitochondrialen Außenmembranfusion (Mfn2) verursacht wird. Obwohl Mfn2-Mutationen beim Menschen mit einer Form der erblichen motorisch-sensiblen Neuropathie, der Charcot-Marie-Tooth-Krankheit Typ 2A (15), assoziiert sind, ist die konditionelle Zerstörung von Mfn2 in Mäusen eine etablierte Methode zur Induktion von Störungen der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS). Die verschiedenen neuronalen Subtypen (16–19) und der daraus resultierende neurodegenerative Phänotyp gehen mit progressiven neurologischen Symptomen wie Bewegungsstörungen (18, 19) oder zerebellärer Ataxie (16) einher. Mithilfe einer Kombination aus markierungsfreier quantitativer (LFQ) Proteomik, Metabolomik, Bildgebung und virologischen Methoden zeigen wir, dass progressive Neurodegeneration die Expression von Pyruvatcarboxylase (PCx) und anderen an der Arteriosklerose beteiligten Faktoren in PNs in vivo stark induziert. Um die Relevanz dieses Befundes zu überprüfen, haben wir die PCx-Expression in Mfn2-defizienten PNs gezielt herunterreguliert und festgestellt, dass dies den oxidativen Stress verstärkt und die Neurodegeneration beschleunigt. Dies beweist, dass Azoospermie die metabolische Anpassungsfähigkeit von Zellen an den Zelltod erhöht. Eine starke Expression von MFN2 kann terminal degenerierte PNs mit schwerem OXPHOS-Mangel, massivem Verbrauch mitochondrialer DNA und einem offensichtlich gestörten mitochondrialen Netzwerk vollständig retten. Dies unterstreicht, dass sich diese Form der Neurodegeneration selbst im fortgeschrittenen Stadium vor dem Zelltod noch erholen kann.
Um die Mitochondrien in Mfn2-Knockout-PNs sichtbar zu machen, verwendeten wir einen Maus-Stamm, der die Cre-abhängige Expression von gelbem fluoreszierendem Protein (YFP) (mtYFP) (20) in den Mitochondrien ermöglicht, und untersuchten die mitochondriale Morphologie in vivo. Wir stellten fest, dass die Zerstörung des Mfn2-Gens in PNs zu einer allmählichen Teilung des mitochondrialen Netzwerks führt (Abbildung S1A), wobei die früheste Veränderung im Alter von 3 Wochen beobachtet wurde. Im Gegensatz dazu begann die deutliche Degeneration der PN-Zellschicht, die sich im Verlust der Calbindin-Immunfärbung zeigte, erst im Alter von 12 Wochen (Abbildung 1, A und B). Diese zeitliche Diskrepanz zwischen den frühesten Veränderungen der mitochondrialen Morphologie und dem sichtbaren Beginn des neuronalen Zelltods veranlasste uns, die durch die mitochondriale Dysfunktion ausgelösten metabolischen Veränderungen vor dem Zelltod zu untersuchen. Wir entwickelten eine Strategie mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS), um YFP (YFP+)-exprimierende PN (Abbildung 1C) und Kontrollmäuse (Mfn2+/loxP::mtYFP loxP-stop-loxP::L7-cre), im Folgenden als CTRL bezeichnet, zu isolieren (Abbildung S1B). Die Optimierung der Gating-Strategie basierend auf der relativen Intensität des YFP-Signals ermöglicht die Trennung der YFP+-Zellen (YFPhigh) von Nicht-PN (YFPneg) (Abbildung S1B) bzw. mutmaßlichen fluoreszierenden Axon-/Dendritenfragmenten (YFPlow; Abbildung S1D, links), was mittels Konfokalmikroskopie bestätigt wurde (Abbildung S1D, rechts). Zur Verifizierung der Identität der klassifizierten Zellpopulation führten wir eine LFQ-Proteomik und anschließend eine Hauptkomponentenanalyse durch. Dabei zeigte sich eine klare Trennung zwischen YFPhigh- und YFPneg-Zellen (Abbildung S1C). YFPhigh-Zellen zeigten eine Nettoanreicherung bekannter PN-Marker (z. B. Calb1, Pcp2, Grid2 und Itpr3) (21, 22), jedoch keine Anreicherung von Proteinen, die üblicherweise in Neuronen oder anderen Zelltypen exprimiert werden (Abbildung 1D). Ein Vergleich von Proben klassifizierter YFPhigh-Zellen aus unabhängigen Experimenten ergab einen Korrelationskoeffizienten > 0,9, was eine gute Reproduzierbarkeit zwischen biologischen Replikaten belegt (Abbildung S1E). Zusammenfassend bestätigen diese Daten unseren Plan zur akuten und spezifischen Isolierung geeigneter PN. Da das verwendete L7-cre-Treibersystem in der ersten Woche nach der Verabreichung eine Mosaikrekombination induziert (23), begannen wir, Mäuse aus der Kontrollgruppe (CTRL) und der Gruppe der konditionalen (Mfn2^loxP/loxP::mtYFP^{loxP-stop-loxP::L7-cre) Mäuse zu selektieren, um Neuronen zu gewinnen. Nach Abschluss der Rekombination werden die Mäuse im Alter von 4 Wochen als Mfn2cKO bezeichnet. Als Endpunkt wählten wir ein Alter von 8 Wochen, da die PN-Schicht zu diesem Zeitpunkt trotz der deutlichen mitochondrialen Fragmentierung intakt war (Abb. 1B und Abb. S1A). Insgesamt quantifizierten wir 3013 Proteine, von denen etwa 22 % auf MitoCarta 2.0-Annotationen basierten, die das mitochondriale Proteom als Mitochondrien definierten (Abb. 1E) (24). Die in Woche 8 durchgeführte Analyse der differentiellen Genexpression zeigte, dass nur 10,5 % aller Proteine ​​signifikante Veränderungen aufwiesen (Abb. 1F und Abb. S1F), davon waren 195 Proteine ​​herunterreguliert und 120 Proteine ​​hochreguliert (Abb. 1F). Die „innovative Pfadanalyse“ dieses Datensatzes zeigt, dass die differentiell exprimierten Gene hauptsächlich zu einer begrenzten Anzahl spezifischer Stoffwechselwege gehören (Abb. 1G). Interessanterweise bestätigt die Herunterregulierung von Signalwegen im Zusammenhang mit OXPHOS und Kalziumsignalisierung zwar die Induktion mitochondrialer Dysfunktion in fusionsdefizienten PNs, jedoch sind andere Kategorien, die hauptsächlich den Aminosäurestoffwechsel betreffen, signifikant hochreguliert, was mit dem Stoffwechsel übereinstimmt, der in mitochondrialer Dysfunktion auftritt.
(A) Repräsentative konfokale Aufnahmen von Kleinhirnschnitten von Kontroll- und Mfn2cKO-Mäusen zeigen den fortschreitenden Verlust von Purkinje-Zellen (Calbindin, grau); die Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt. (B) Quantifizierung von (A) (einfaktorielle Varianzanalyse, ***P<0,001; n = 4 bis 6 Kreise von drei Mäusen). (C) Experimenteller Arbeitsablauf. (D) Heatmap-Verteilung von Markern, die spezifisch für Purkinje-Zellen (oben) und andere Zelltypen (Mitte) sind. (E) Venn-Diagramm mit der Anzahl der in den klassifizierten Purkinje-Zellen identifizierten mitochondrialen Proteine. (F) Vulkanplot der differentiell exprimierten Proteine ​​in Mfn2cKO-Neuronen nach 8 Wochen (Signifikanzschwelle: 1,3). (G) Die Analyse des Kreativitätspfads zeigt die fünf wichtigsten hochregulierten (rot) und herunterregulierten (blau) Signalwege in den nach 8 Wochen klassifizierten Mfn2cKO-Purkinje-Zellen. Die durchschnittliche Expressionsstärke jedes detektierten Proteins wird dargestellt. Graustufen-Heatmap: angepasster p-Wert. ns, nicht signifikant.
Proteomische Daten zeigten, dass die Proteinexpression der Komplexe I, III und IV allmählich abnahm. Alle drei Komplexe enthielten essentielle, mtDNA-kodierte Untereinheiten, während Komplex II, der ausschließlich nukleär kodiert ist, im Wesentlichen unbeeinflusst blieb (Abbildung 2A und Abbildung S2A). Im Einklang mit den proteomischen Ergebnissen zeigte die Immunhistochemie von Kleinhirngewebeschnitten, dass der MTCO1-Untereinheit-Spiegel (mitochondriale Cytochrom-C-Oxidase-Untereinheit 1) des Komplexes IV in PN allmählich abnahm (Abbildung 2B). Die mtDNA-kodierte Untereinheit Mtatp8 war signifikant reduziert (Abbildung S2A), während der Steady-State-Spiegel der nukleär kodierten ATP-Synthase-Untereinheit unverändert blieb. Dies steht im Einklang mit der bekannten stabilen Bildung des ATP-Synthase-Subassembly-F1-Komplexes bei stabiler mtDNA-Expression. Die Auswertung des mtDNA-Gehalts in den sortierten Mfn2cKO-PNs mittels quantitativer Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qPCR) bestätigte die allmähliche Abnahme der mtDNA-Kopienzahl. Im Vergleich zur Kontrollgruppe waren im Alter von 8 Wochen nur noch etwa 20 % der mtDNA vorhanden (Abbildung 2C). Entsprechend dieser Ergebnisse wurde die DNA mittels konfokaler Mikroskopie an Mfn2cKO-PNs nachgewiesen, wobei der zeitabhängige Verbrauch mitochondrialer Nukleotide sichtbar wurde (Abbildung 2D). Wir fanden heraus, dass lediglich einige Kandidaten, die am mitochondrialen Proteinabbau und der Stressantwort beteiligt sind, hochreguliert waren, darunter Lonp1, Afg3l2 und Clpx sowie Faktoren des OXPHOS-Komplexes. Es wurden keine signifikanten Veränderungen der Spiegel von Proteinen, die an der Apoptose beteiligt sind, festgestellt (Abbildung S2B). Ebenso fanden wir nur geringfügige Veränderungen der mitochondrialen und endoplasmatischen Retikulumkanäle, die am Kalziumtransport beteiligt sind (Abbildung S2C). Die Untersuchung von Autophagie-assoziierten Proteinen ergab keine signifikanten Veränderungen, was mit der in vivo mittels Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie beobachteten Induktion von Autophagosomen übereinstimmt (Abbildung S3). Die fortschreitende OXPHOS-Dysfunktion in PNs geht jedoch mit deutlichen ultrastrukturellen Veränderungen der Mitochondrien einher. In den Zellkörpern und Dendritenbäumen von 5 und 8 Wochen alten Mfn2cKO-PNs sind Mitochondriencluster zu erkennen, und die Struktur der inneren Membran hat sich stark verändert (Abbildung S4, A und B). Entsprechend dieser ultrastrukturellen Veränderungen und einer signifikanten Abnahme der mtDNA zeigte die Analyse akuter Kleinhirnschnitte mit Tetramethylrhodaminmethylester (TMRM), dass das mitochondriale Membranpotenzial in Mfn2cKO-PNs signifikant verringert war (Abbildung S4C).
(A) Zeitverlaufsanalyse der Expressionsstärke des OXPHOS-Komplexes. Berücksichtigt wurden nur Proteine ​​mit p < 0,05 nach 8 Wochen (zweifaktorielle ANOVA). Gestrichelte Linie: Keine Anpassung im Vergleich zur Kontrollgruppe (CTRL). (B) Links: Beispiel eines Kleinhirnschnitts, markiert mit einem Anti-MTCO1-Antikörper (Maßstabsbalken: 20 μm). Der Bereich der Purkinje-Zellkörper ist gelb markiert. Rechts: Quantifizierung der MTCO1-Konzentration (einfaktorielle Varianzanalyse; n = 7–20 analysierte Zellen von drei Mäusen). (C) qPCR-Analyse der mtDNA-Kopienzahl im sortierten PN (einfaktorielle Varianzanalyse; n = 3–7 Mäuse). (D) Links: Beispiel eines Kleinhirnschnitts, markiert mit einem Anti-DNA-Antikörper (Maßstabsbalken: 20 μm). Der Bereich der Purkinje-Zellkörper ist gelb markiert. Rechts: Quantifizierung von mtDNA-Läsionen (einfaktorielle Varianzanalyse; n = 5 bis 9 Zellen von drei Mäusen). (E) Beispiel eines akuten Kleinhirnschnitts mit mitoYFP+-Purkinje-Zellen (Pfeil) in einer Ganzzell-Patch-Clamp-Ableitung. (F) Quantifizierung der Strom-Spannungs-Kennlinie. (G) Repräsentative Ableitungen von depolarisierenden Strominjektionen in Kontroll- und Mfn2cKO-Purkinje-Zellen. Obere Kurve: Der erste Impuls, der ein Aktionspotenzial auslöste. Untere Kurve: Maximale Aktionspotenzialfrequenz. (H) Quantifizierung postsynaptischer spontaner Eingänge (sPSPs). Die repräsentative Ableitung und ihr Vergrößerungsfaktor sind in (I) dargestellt. Einfaktorielle Varianzanalyse (n = 5 bis 20 Zellen von drei Mäusen). Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. (J) Repräsentative Ableitungen spontaner Aktionspotenziale, aufgezeichnet im perforierten Patch-Clamp-Modus. Obere Kurve: Maximale Aktionspotenzialfrequenz. Untere Spur: Vergrößerung eines einzelnen Aktionspotenzials. (K) Quantifizierung der durchschnittlichen und maximalen Aktionspotenzialfrequenz gemäß (J). Mann-Whitney-Test; n = 5 Zellen von vier Mäusen wurden analysiert. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben; nicht signifikant.
Deutliche Schäden an der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) wurden in den PN von 8 Wochen alten Mfn2cKO-Mäusen festgestellt, was auf eine stark beeinträchtigte physiologische Funktion der Neuronen hindeutet. Daher analysierten wir die passiven elektrischen Eigenschaften OXPHOS-defizienter Neuronen im Alter von 4–5 Wochen und 7–8 Wochen mittels Ganzzell-Patch-Clamp-Ableitungen an akuten Kleinhirnschnitten (Abbildung 2E). Unerwarteterweise ähnelten das durchschnittliche Ruhemembranpotenzial und der Eingangswiderstand der Mfn2cKO-Neuronen denen der Kontrollgruppe, obwohl geringfügige Unterschiede zwischen den Zellen bestanden (Tabelle 1). Ebenso wurden im Alter von 4–5 Wochen keine signifikanten Veränderungen in der Strom-Spannungs-Kennlinie (IV-Kurve) gefunden (Abbildung 2F). Allerdings überlebte kein einziges 7–8 Wochen altes Mfn2cKO-Neuron die intravenöse Stimulation (Hyperpolarisationsschritt), was auf eine deutliche Empfindlichkeit gegenüber dem Hyperpolarisationspotenzial in diesem späten Stadium hinweist. Im Gegensatz dazu werden in Mfn2cKO-Neuronen die depolarisierenden Ströme, die repetitive Aktionspotentiale (AP) auslösen, gut toleriert. Dies deutet darauf hin, dass sich ihre Entladungsmuster insgesamt nicht signifikant von denen 8 Wochen alter Kontrollneuronen unterscheiden (Tabelle 1 und Abbildung 2G). Auch Frequenz und Amplitude spontaner postsynaptischer Ströme (sPSCs) waren mit denen der Kontrollgruppe vergleichbar, und die Ereignisfrequenz stieg von der 4. zur 5., zur 7. und zur 8. Woche mit einem ähnlichen Anstieg (Abbildung 2, H und I). Die synaptische Reifung in PNs dauerte etwa 25 Wochen. Ähnliche Ergebnisse wurden nach Ableitung perforierter PN-Patches erzielt. Diese Konfiguration verhindert die mögliche Kompensation zellulärer ATP-Defekte, wie sie bei Ganzzell-Patch-Clamp-Ableitungen auftreten kann. Insbesondere das Ruhemembranpotential und die spontane Entladungsfrequenz von Mfn2cKO-Neuronen waren nicht beeinträchtigt (Abbildung 2, J und K). Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass PNs mit einer offensichtlichen OXPHOS-Dysfunktion gut mit hochfrequenten Entladungsmustern zurechtkommen, was darauf schließen lässt, dass es einen Kompensationsmechanismus gibt, der es ihnen ermöglicht, nahezu normale elektrophysiologische Reaktionen aufrechtzuerhalten.
Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben (einfaktorielle Varianzanalyse, Holm-Sidak-Test für Mehrfachvergleiche; *P<0,05). Die Einheitsnummer ist in Klammern angegeben.
Wir untersuchten, ob eine Kategorie im Proteomik-Datensatz (Abbildung 1G) Stoffwechselwege enthält, die einem schweren OXPHOS-Mangel entgegenwirken können und somit erklären, warum betroffene PN eine nahezu normale Elektrophysiologie aufweisen (Abbildung 2, E bis K). Die Proteomanalyse zeigte eine signifikante Hochregulation der Enzyme, die am Katabolismus verzweigtkettiger Aminosäuren (BCAA) beteiligt sind (Abbildung 3A und Abbildung S5A). Das Endprodukt Acetyl-CoA (CoA) oder Succinyl-CoA kann die Tricarboxylate im Citratzyklus (TCA-Zyklus) ergänzen. Wir stellten fest, dass sowohl der Gehalt an BCAA-Transaminase 1 (BCAT1) als auch an BCAT2 erhöht war. Diese Enzyme katalysieren den ersten Schritt des BCAA-Katabolismus, indem sie Glutamat aus α-Ketoglutarat generieren (26). Alle Untereinheiten des verzweigtkettigen Keto-Säure-Dehydrogenase-Komplexes (BCKD) sind hochreguliert (der Komplex katalysiert die anschließende und irreversible Decarboxylierung des resultierenden BCAA-Kohlenstoffgerüsts) (Abbildung 3A und Abbildung S5A). Es wurden jedoch keine offensichtlichen Veränderungen der BCAA selbst in den sortierten PN gefunden, was auf die erhöhte zelluläre Aufnahme dieser essentiellen Aminosäuren oder die Nutzung anderer Quellen (Glucose oder Milchsäure) zur Ergänzung des TCA-Zyklus zurückzuführen sein könnte (Abbildung S5B). PN ohne OXPHOS zeigten im Alter von 8 Wochen auch erhöhte Glutaminabbau- und Transaminierungsaktivitäten, was sich in der Hochregulierung der mitochondrialen Enzyme Glutaminase (GLS) und Glutamin-Pyruvat-Transaminase 2 (GPT2) widerspiegelt (Abbildung 3A und C). Es ist bemerkenswert, dass die Hochregulierung von GLS auf die gespleißte Isoform Glutaminase C (GLS-GAC) beschränkt ist (die Veränderung bei Mfn2cKO/CTRL beträgt etwa das 4,5-fache, P = 0,05), und dass ihre spezifische Hochregulierung in Krebsgewebe die mitochondriale Bioenergie unterstützen kann. (27).
(A) Die Heatmap zeigt die Veränderung des Proteinspiegels entlang des angegebenen Signalwegs nach 8 Wochen. (B) Beispiel eines mit einem Anti-PCx-Antikörper markierten Kleinhirnschnitts (Maßstabsbalken: 20 μm). Der gelbe Pfeil markiert den Purkinje-Zellkörper. (C) Zeitverlaufsanalyse der Proteinexpression, die PCx als wichtigen Kandidaten für die Atherosklerose identifizierte (multipler t-Test, *FDR < 5 %; n = 3–5 Mäuse). (D) Oben: Schematische Darstellung der verschiedenen Wege, auf denen der markierte Kohlenstoff aus dem [1-13C]Pyruvat-Tracer aufgenommen wird (z. B. über PDH oder transarteriell). Unten: Das Violin-Diagramm zeigt den prozentualen Anteil des einfach markierten Kohlenstoffs (M1), der nach Markierung akuter Kleinhirnschnitte mit [1-13C]Pyruvat in Asparaginsäure, Zitronensäure und Äpfelsäure umgewandelt wurde (gepaarter t-Test; ** P < 0,01). (E) Umfassende Analyse des zeitlichen Verlaufs entlang des angegebenen Signalwegs. Berücksichtigt wurden nur Proteine ​​mit einem p-Wert < 0,05 nach 8 Wochen. Gestrichelte Linie: kein Korrekturwert (zweifaktorielle Varianzanalyse; * p < 0,05; *** p < 0,001). Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben.
In unserer Analyse erwies sich der BCAA-Katabolismus als einer der wichtigsten hochregulierten Stoffwechselwege. Dies deutet stark darauf hin, dass das in den TCA-Zyklus einfließende Ventilationsvolumen bei PN ohne OXPHOS verändert sein könnte. Dies könnte eine bedeutende Form der neuronalen metabolischen Umstrukturierung darstellen, die sich direkt auf die neuronale Physiologie und das Überleben bei Aufrechterhaltung einer schweren OXPHOS-Dysfunktion auswirken könnte. Im Einklang mit dieser Hypothese fanden wir eine Hochregulation des wichtigsten antiatherosklerotischen Enzyms PCx (Mfn2cKO/CTRL: ca. 1,5-fache Veränderung; Abb. 3A). PCx katalysiert die Umwandlung von Pyruvat zu Oxalacetat (28), dessen Expression im Hirngewebe vermutlich auf Astrozyten beschränkt ist (29, 30). Im Einklang mit den Proteomik-Ergebnissen zeigte die Konfokalmikroskopie, dass die PCx-Expression in OXPHOS-defizienten PNs spezifisch und signifikant erhöht war, während die PCx-Reaktivität in der Kontrolle hauptsächlich auf die angrenzenden Bergmann-Gliazellen beschränkt war (Abbildung 3B). Um die beobachtete Hochregulation von PCx funktionell zu untersuchen, behandelten wir akute Kleinhirnschnitte mit dem Tracer [1-13C]Pyruvat. Bei Oxidation von Pyruvat durch Pyruvatdehydrogenase (PDH) verschwand dessen Isotopenmarkierung, wurde aber in Zwischenprodukte des Citratzyklus eingebaut, wenn Pyruvat durch vaskuläre Reaktionen metabolisiert wurde (Abbildung 3D). Unsere Proteomik-Daten wurden durch die Beobachtung einer großen Anzahl von Markern dieses Tracers in der Asparaginsäure von Mfn2cKO-Schnitten bestätigt, während Zitronensäure und Äpfelsäure ebenfalls einen moderaten, jedoch nicht signifikanten Trend zeigten (Abbildung 3D).
In den Dopaminneuronen von MitoPark-Mäusen mit mitochondrialer Dysfunktion, die durch die spezifische Zerstörung des mitochondrialen Transkriptionsfaktors A (Tfam) in Dopaminneuronen verursacht wurde (Abbildung S6B), war die PCx-Expression ebenfalls signifikant erhöht (31). Dies deutet darauf hin, dass die Entstehung der Acetonsäure-Arteriosklerose durch die Dysfunktion der neuronalen oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) reguliert wird. Bemerkenswert ist, dass spezifische Enzyme (32–34), die in Neuronen exprimiert werden und mit Arteriosklerose in Zusammenhang stehen könnten, in PNs mit OXPHOS-Defizienz signifikant hochreguliert sind. Beispiele hierfür sind die Propionyl-CoA-Carboxylase (PCC-A), die Propionyl-CoA in Succinyl-CoA umwandelt, und das mitochondriale Malatenzym 3 (ME3), dessen Hauptfunktion die Rückgewinnung von Pyruvat aus Malat ist (Abbildung 3, A und C) (33, 35). Zusätzlich fanden wir einen signifikanten Anstieg des Pdk3-Enzyms, welches PDH phosphoryliert und somit inaktiviert (36), während keine Veränderungen im Pdp1-Enzym, welches PDH aktiviert, oder im PDH-Enzymkomplex selbst festgestellt wurden (Abbildung 3A). Entsprechend war in Mern2cKO-PNs die Phosphorylierung der α1-Untereinheit (PDHE1α) der Pyruvatdehydrogenase-E1-Komponente des PDH-Komplexes an Ser293 (bekannt dafür, die Enzymaktivität von PDH zu hemmen) erhöht (Abbildung S6C). Pyruvat hat keinen vaskulären Zugang.
Schließlich stellten wir fest, dass der übergeordnete Biosyntheseweg von Serin und Glycin, der zugehörige mitochondriale Folatzyklus (1C) und die Prolinbiosynthese (Abbildung 1G und Abbildung S5C) während des Aktivierungsprozesses signifikant hochreguliert sind, wie bereits berichtet wurde. Das umliegende Gewebe wird durch mitochondriale Dysfunktion aktiviert (5–7). Konfokale Analysen, die diese Proteomikdaten stützen, zeigten, dass Kleinhirnschnitte von 8 Wochen alten Mäusen mit fehlender oxidativer Phosphorylierung (OXPHOS) eine signifikante Immunantwort aufwiesen (Abbildung S5D). In akuten Kleinhirnschnitten, die mit 13 CU-Glucose inkubiert wurden, bestätigten metabolische Tracer-Experimente die Hochregulierung der Serin- und Prolinbiosynthese, was auf einen erhöhten Fluss von Kohlenstoffisoformen in Serin und Prolin hindeutet (Abbildung S5E). Da die durch GLS und GPT2 katalysierten Reaktionen für die Glutamatsynthese aus Glutamin und die Transaminierung zwischen Glutamat und α-Ketoglutarat verantwortlich sind, deutet deren Hochregulation auf einen erhöhten Glutamatbedarf in OXPHOS-defizienten Neuronen hin. Dies könnte der Aufrechterhaltung der gesteigerten Prolinbiosynthese dienen (Abb. S5C). Im Gegensatz dazu zeigte eine proteomische Analyse von Kleinhirnastrozyten aus PN-spezifischen Mfn2cKO-Mäusen, dass sich die Expression dieser Stoffwechselwege (einschließlich aller Antiperoxidasen) nicht signifikant veränderte. Dies belegt, dass diese metabolische Umleitung selektiv für abgebautes PN ist (Abb. S6, D bis G).
Zusammenfassend zeigten diese Analysen signifikant unterschiedliche Muster der zeitlichen Aktivierung spezifischer Stoffwechselwege in neuronalen Neuronen. Obwohl eine abnorme mitochondriale Funktion zu frühzeitiger Atherosklerose und Umstrukturierung des Citratzyklus (Abb. 3E und Abb. S5C) sowie zu vorhersehbaren Veränderungen in der Expression der Komplexe I und IV führen kann, werden Veränderungen in der Serin-Neusynthese erst in späten Stadien sichtbar. Diese Ergebnisse beschreiben einen sequenziellen Prozess, in dem die stressinduzierte mitochondriale (C1-Zyklus) und zytoplasmatische (Serinbiosynthese) Reaktion synergistisch mit der Zunahme der Atherosklerose im Citratzyklus zusammenwirkt, um den neuronalen Stoffwechsel umzugestalten.
Acht Wochen alte PNs mit OXPHOS-Defizienz können eine hochfrequente Erregungsaktivität aufrechterhalten und eine signifikante metabolische Reaktivierung erfahren, um die mitochondriale Dysfunktion zu kompensieren. Diese Entdeckung eröffnet die interessante Möglichkeit, dass diese Zellen bereits jetzt therapeutisch behandelt werden könnten, um die Neurodegeneration zu verzögern oder zu verhindern. Wir haben diese Möglichkeit durch zwei unabhängige Interventionen untersucht. In der ersten Methode haben wir einen Cre-abhängigen adeno-assoziierten Virusvektor (AAV) entwickelt, um MFN2 selektiv in OXPHOS-defizienten PNs in vivo zu exprimieren (Abbildung S7A). Der AAV, der MFN2 und das fluoreszierende Reportergen mCherry kodiert (Mfn2-AAV), wurde in primären Neuronen-Kulturen in vitro verifiziert. Dies führte zu einer Cre-abhängigen Expression von MFN2 und zur Wiederherstellung der mitochondrialen Morphologie, wodurch Neuromutationen in Mfn2cKO-Neuronen verhindert wurden (Abbildung S7, B, D und E). Anschließend führten wir In-vivo-Experimente durch, um 8 Wochen altes Mfn2-AAV stereotaktisch in die Kleinhirnrinde von Mfn2cKO- und Kontrollmäusen einzubringen und 12 Wochen alte Mäuse zu analysieren (Abbildung 4A). Die behandelten Mfn2cKO-Mäuse starben (Abbildung 1, A und B) (16). Die virale Transduktion in vivo führte zu einer selektiven Expression von PN in einigen Kleinhirnkreisen (Abbildung S7, G und H). Die Injektion des Kontroll-AAV, das nur mCherry exprimierte (Ctrl-AAV), hatte keinen signifikanten Einfluss auf den Grad der Neurodegeneration in Mfn2cKO-Tieren. Im Gegensatz dazu zeigte die Analyse von mit Mfn2-AAV transduzierten Mfn2cKOs einen signifikanten Schutzeffekt der PN-Zellschicht (Abbildung 4, B und C). Insbesondere scheint die Neuronendichte nahezu identisch mit der von Kontrolltieren zu sein (Abbildung 4, B und C sowie Abbildung S7, H und I). Die Expression von MFN1, nicht aber von MFN2, ist gleichermaßen wirksam bei der Verhinderung des neuronalen Zelltods (Abb. 4C und Abb. S7, C und F), was darauf hindeutet, dass die ektopische Expression von MFN1 den Mangel an MFN2 effektiv kompensieren kann. Weitere Analysen auf Ebene einzelner PNs zeigten, dass Mfn2-AAV die Ultrastruktur der Mitochondrien weitgehend wiederherstellte, die mtDNA-Spiegel normalisierte und die hohe Expression des Anti-Angiogenese-Markers PCx umkehrte (Abb. 4, C bis E). Die visuelle Untersuchung der geretteten Mfn2cKO-Mäuse im Ruhezustand zeigte eine Verbesserung ihrer Körperhaltung und motorischen Symptome (Bewegung S1 bis S3). Zusammenfassend zeigen diese Experimente, dass die verzögerte Wiedereinführung von MFN2 in PNs mit schwerem OXPHOS-Defizit ausreicht, um den mtDNA-Verbrauch umzukehren und Atherosklerose zu induzieren, wodurch Axondegeneration und neuronaler Zelltod in vivo verhindert werden.
(A) Schema des experimentellen Ablaufs der AAV-Injektion, die MFN2 kodiert, wenn der angegebene Stoffwechselweg aktiviert ist. (B) Repräsentative konfokale Aufnahmen von Kleinhirnschnitten 12 Wochen alter Mfn2cKO-Mäuse, die in der 8. Woche transduziert und mit einem Anti-Calbindin-Antikörper markiert wurden. Rechts: Skalierung der Axonfasern. Der Maßstab der Axonvergrößerung beträgt 450 und 75 μm. (C) Links: Quantifizierung der Purkinje-Zelldichte in der AAV-Transduktionsschleife (AAV+) (einfaktorielle Varianzanalyse; n = 3 Mäuse). Rechts: Analyse des mtDNA-Fokus in transduzierten Purkinje-Zellen in Woche 12 (ungepaarter t-Test; n = 6 Zellen von drei Mäusen). * P < 0,05; ** P < 0,01. (D) Repräsentative Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von Purkinje-Zellen aus Kleinhirnschnitten von Mfn2cKO-Mäusen, die mit den angegebenen viralen Vektoren transduziert wurden. Die rosa Maske zeigt den von Dendriten eingenommenen Bereich, das gelbe gestrichelte Quadrat den rechts dargestellten Ausschnitt; n steht für den Zellkern. Maßstab: 1 μm. (E) zeigt ein Beispiel für die PCx-Färbung in PN, die in der 12. Woche transduziert wurden. Maßstab: 20 μm. OE: Überexpression; FC: relative Expressionsänderung.
Abschließend untersuchten wir die Bedeutung des Peroxidase-induzierten Zellüberlebens in PNs mit OXPHOS-Dysfunktion. Wir generierten mCherry-kodierende AAV-shRNA (kurze Haarnadel-RNA), die spezifisch auf die Maus-PCx-mRNA abzielt (AAV-shPCx), und injizierten das Virus oder seine Kontrollsequenz (AAV-scr) in das Kleinhirn von Mfn2cKO-Mäusen. Die Injektion erfolgte in der vierten Lebenswoche (Abbildung 5A), um einen effektiven PCx-Knockdown während der Phase erhöhter PCx-Expression (Abbildung 3C) und intakter PN-Zellschicht (Abbildung 1A) zu erreichen. Bemerkenswert ist, dass der PCx-Knockdown (Abbildung S8A) zu einer signifikanten Beschleunigung des PN-Zelltods führt, der auf den infizierten Bereich beschränkt ist (Abbildung 5B und 5C). Um den Mechanismus der durch die PCx-Hochregulation induzierten metabolischen Effekte zu verstehen, untersuchten wir den Redoxstatus von PNs nach PCx-Knockdown und gleichzeitiger Expression des AAV-vermittelten optischen Biosensors Grx1-roGFP2 (Abb. S8, B bis D), um die relative Veränderung des Glutathion-Redoxpotenzials zu bewerten (38). Anschließend führten wir Zwei-Photonen-Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (FLIM) an akuten Hirnschnitten von 7 Wochen alten Mfn2cKO-Mäusen oder Kontrolltieren durch, um potenzielle Veränderungen des zytoplasmatischen Redoxstatus nach Überprüfung der FLIM-Bedingungen zu detektieren (Abb. S8, E bis G). Die Analyse zeigte einen signifikanten Anstieg des Oxidationszustands einzelner Mfn2cKO-PNs ohne PCx-Expression, im Gegensatz zu Kontrollneuronen oder Mfn2cKO-PNs, die nur eine Scrambled-shRNA exprimierten (Abb. 5, D und E). Bei einer Herunterregulierung der PCx-Expression erhöhte sich der Prozentsatz der Mfn2cKO-PNs, die einen stark oxidierten Zustand aufwiesen, um mehr als das Dreifache (Abbildung 5E), was darauf hindeutet, dass die Hochregulierung von PCx die Redoxkapazität degenerierter Neuronen aufrechterhielt.
(A) Schema des Versuchsablaufs zur Injektion von AAV, das shPCx kodiert, wenn der angegebene Stoffwechselweg aktiviert ist. (B) Repräsentative konfokale Aufnahmen von Kleinhirnschnitten 8 Wochen alter Mfn2cKO-Mäuse, die in der 4. Woche transduziert und mit einem Anti-Calcineurin-Antikörper markiert wurden. Maßstabsbalken: 450 μm. (C) Quantifizierung der Purkinje-Zelldichte in AAV-transduzierten Schleifen (einfaktorielle Varianzanalyse; n = 3–4 Mäuse). Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt; ***P < 0,001. (D) Repräsentative FLIM-Aufnahme zeigt die durchschnittliche Lebensdauer 7 Wochen alter Purkinje-Zellen, die den Glutathion-Redox-Sensor Grx1-roGFP2 unter den angegebenen Versuchsbedingungen exprimieren. LUT-Verhältnis (Look-up-Tabelle): Überlebenszeitintervall (in Pikosekunden). Maßstabsbalken: 25 μm. (E) Das Histogramm zeigt die Verteilung der Lebensdauerwerte von Grx1-roGFP2 aus (D) (n = 158 bis 368 Zellen in zwei Mäusen unter jeder Bedingung). Das Kreisdiagramm über jedem Histogramm zeigt die Anzahl der Zellen mit signifikant längeren (rot, oxidiert) oder kürzeren (blau, reduziert) Lebensdauerwerten, die mehr als eine Standardabweichung über dem durchschnittlichen Lebensdauerwert in CTRL-AAV-scr liegen. (F) Das vorgeschlagene Modell zeigt die Schutzwirkung der Hochregulation von neuronalem PCx.
Zusammenfassend zeigen die hier präsentierten Daten, dass die Reexpression von MFN2 fortgeschrittene PN mit schwerem OXPHOS-Mangel, starker mtDNA-Depletion und extrem abnormaler Ista-ähnlicher Morphologie vollständig retten kann und somit selbst bei fortgeschrittenen Erkrankungen ein kontinuierliches Fortschreiten ermöglicht. Neurodegeneration liefert reversible Hinweise auf das Stadium vor dem Zelltod. Diese metabolische Flexibilität wird zusätzlich durch die Fähigkeit von Neuronen unterstrichen, Atherosklerose (eine Umstrukturierung des Citratzyklus) auszulösen, welche die PCx-Expression in PN ohne OXPHOS hemmt und den Zelltod verstärkt, wodurch eine Schutzfunktion ausgeübt wird (Abbildung 5F).
In dieser Studie lieferten wir Beweise dafür, dass die Reaktion von PNs auf OXPHOS-Dysfunktion über einen durch metabolische Programme aktivierten differentiellen Aktivierungsweg schrittweise in eine TCA-Zyklus-Atherosklerose übergeht. Wir bestätigten die proteomische Analyse mit zahlreichen komplementären Methoden und zeigten, dass Neuronen bei schwerer mitochondrialer Dysfunktion eine bisher unbekannte Form metabolischer Elastizität aufweisen. Überraschenderweise markiert der gesamte Umstrukturierungsprozess nicht zwangsläufig den terminalen metabolischen Zustand, der die Neurodegeneration allmählich und irreversibel begleitet. Unsere Daten deuten vielmehr darauf hin, dass er einen funktionellen Kompensationsmechanismus zur Erhaltung des Neurons selbst im Stadium vor dem Zelltod darstellen könnte. Dieser Befund weist auf eine beträchtliche metabolische Plastizität von Neuronen im Körper hin. Dies beweist, dass die spätere Wiedereinführung von MFN2 die Expression wichtiger metabolischer Marker umkehren und die PN-Degeneration verhindern kann. Im Gegenteil, sie hemmt die Atherosklerose und beschleunigt die Nerventransformation.
Eine der faszinierendsten Erkenntnisse unserer Forschung ist, dass periphere Neuronen (PNs) ohne oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) den Citratzyklus durch Hochregulierung von Enzymen modifizieren können, die spezifisch die Arteriosklerose fördern. Metabolische Umstrukturierungen sind ein häufiges Merkmal von Krebszellen. Einige dieser Zellen benötigen Glutamin, um Zwischenprodukte des Citratzyklus zu ergänzen und Reduktionsäquivalente zu produzieren, welche die Atmungskette antreiben und die Produktion von Vorstufen der Lipid- und Nukleotidbiosynthese aufrechterhalten (39, 40). Eine aktuelle Studie zeigte, dass in peripheren Geweben mit OXPHOS-Dysfunktion die Wiederherstellung des Glutamin/Glutamat-Stoffwechsels ebenfalls ein wichtiges Merkmal ist (5, 41). Die Richtung des Glutamineintritts in den Citratzyklus hängt dabei vom Schweregrad der OXPHOS-Schädigung ab (41). Es fehlen jedoch eindeutige Belege für eine Ähnlichkeit der neuronalen metabolischen Plastizität im Körper und deren mögliche Relevanz im Krankheitskontext. Eine kürzlich durchgeführte In-vitro-Studie zeigte, dass primäre kortikale Neuronen Glutamatpools für die Neurotransmission mobilisieren und dadurch unter metabolischem Stress den oxidativen Stoffwechsel und die Atherosklerose fördern (42). Es ist anzumerken, dass unter der pharmakologischen Hemmung des TCA-Zyklus-Enzyms Succinatdehydrogenase die Pyruvatcarboxylierung vermutlich die Oxalacetatsynthese in kultivierten Kleinhirnkörnerzellen aufrechterhält (34). Die physiologische Relevanz dieser Mechanismen für das Hirngewebe (wo die Atherosklerose vermutlich hauptsächlich auf Astrozyten beschränkt ist) ist jedoch weiterhin von großer Bedeutung (43). Unsere Daten zeigen, dass durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) geschädigte primäre Neuronen auf den Abbau verzweigtkettiger Aminosäuren (BCAA) und die Pyruvatcarboxylierung umgeschaltet werden können. Diese beiden Prozesse stellen die Hauptquellen für die Auffüllung von TCA-Zyklus-Zwischenprodukten dar. Obwohl der mögliche Beitrag des BCAA-Abbaus zum neuronalen Energiestoffwechsel – neben der Rolle von Glutamat und GABA für die Neurotransmission (44) – postuliert wurde, fehlen in vivo noch Belege für diese Mechanismen. Daher liegt die Vermutung nahe, dass dysfunktionale PNs den durch die Assimilation bedingten Verbrauch von TCA-Intermediaten durch verstärkte Atherosklerose kompensieren können. Insbesondere könnte eine Hochregulation von PCx erforderlich sein, um den erhöhten Bedarf an Asparaginsäure aufrechtzuerhalten, der in proliferierenden Zellen mit mitochondrialer Dysfunktion vermutet wird (45). Unsere Metabolomanalyse zeigte jedoch keine signifikanten Veränderungen des Asparaginsäure-Steady-State-Spiegels in Mfn2cKO-PNs (Abbildung S6A), was vermutlich die unterschiedliche metabolische Nutzung von Asparaginsäure zwischen proliferierenden Zellen und postmitotischen Neuronen widerspiegelt. Obwohl der genaue Mechanismus der PCx-Hochregulation in dysfunktionalen Neuronen in vivo noch nicht vollständig aufgeklärt ist, konnten wir zeigen, dass diese vorzeitige Reaktion eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des Redoxstatus von Neuronen spielt, was in FLIM-Experimenten an Kleinhirnschnitten nachgewiesen wurde. Insbesondere kann die Verhinderung der PCx-Hochregulation in PNs zu einem stärker oxidierten Zustand führen und den Zelltod beschleunigen. Die Aktivierung des BCAA-Abbaus und die Carboxylierung von Pyruvat eignen sich nicht zur Charakterisierung peripherer Gewebe mitochondrialer Dysfunktion (7). Daher scheinen sie ein prioritäres, wenn auch nicht das einzige Merkmal von OXPHOS-defizienten Neuronen zu sein, das für die Neurodegeneration von Bedeutung ist.
Zerebelläre Erkrankungen sind eine heterogene Form neurodegenerativer Erkrankungen, die sich üblicherweise als Ataxie manifestieren und häufig die Peritonen (PN) schädigen (46). Diese Neuronenpopulation ist besonders anfällig für mitochondriale Dysfunktion, da ihre selektive Degeneration in Mäusen ausreicht, um viele der motorischen Symptome der menschlichen spinozerebellären Ataxie zu reproduzieren (16, 47, 48). Berichten zufolge ist ein transgenes Mausmodell mit einem mutierten Gen mit der menschlichen spinozerebellären Ataxie assoziiert und weist eine mitochondriale Dysfunktion auf (49, 50), was die Bedeutung der Untersuchung der Folgen eines OXPHOS-Mangels bei PNPH unterstreicht. Daher eignet es sich besonders gut, diese einzigartige Neuronenpopulation effektiv zu isolieren und zu untersuchen. Da Peritonen jedoch sehr druckempfindlich sind und nur einen geringen Anteil der gesamten zerebellären Zellpopulation ausmachen, stellt ihre selektive Trennung als ganze Zellen für viele Omics-basierte Studien nach wie vor eine Herausforderung dar. Obwohl eine vollständige Kontaminationsfreiheit durch andere Zelltypen (insbesondere adultes Gewebe) nahezu unmöglich ist, kombinierten wir einen effektiven Dissoziationsschritt mit FACS, um eine ausreichende Anzahl lebensfähiger Neuronen für die nachfolgende Proteomanalyse zu gewinnen. Wir erzielten eine recht hohe Proteinabdeckung (ca. 3000 Proteine) im Vergleich zu bestehenden Datensätzen des gesamten Kleinhirns (51). Durch den Erhalt der Zellviabilität ermöglicht uns die hier vorgestellte Methode nicht nur die Untersuchung von Veränderungen in den Stoffwechselwegen der Mitochondrien, sondern auch in ihren zytoplasmatischen Pendants. Dies ergänzt die Verwendung von mitochondrialen Membranmarkierungen zur Anreicherung von Zelltypen und die neue Methode zur Bestimmung der Mitochondrienanzahl in komplexen Geweben (52, 53). Die beschriebene Methode ist nicht nur auf die Untersuchung von Purkinje-Zellen beschränkt, sondern lässt sich problemlos auf jeden Zelltyp anwenden, um Stoffwechselveränderungen im erkrankten Gehirn, einschließlich anderer Modelle mitochondrialer Dysfunktion, zu untersuchen.
Schließlich haben wir ein therapeutisches Zeitfenster während dieses metabolischen Umstrukturierungsprozesses identifiziert, das die wichtigsten Anzeichen zellulären Stresses vollständig umkehren und neuronale Degeneration verhindern kann. Daher könnte das Verständnis der funktionellen Auswirkungen der hier beschriebenen Umstrukturierung grundlegende Erkenntnisse für mögliche Behandlungen zur Erhaltung der neuronalen Lebensfähigkeit bei mitochondrialer Dysfunktion liefern. Zukünftige Forschung, die darauf abzielt, Veränderungen im Energiestoffwechsel in anderen Gehirnzelltypen zu untersuchen, ist erforderlich, um die Anwendbarkeit dieses Prinzips auf andere neurologische Erkrankungen vollständig aufzudecken.
MitoPark-Mäuse wurden bereits beschrieben (31). C57BL/6N-Mäuse mit loxP-flankierenden Mfn2-Genen wurden ebenfalls bereits beschrieben (18) und mit L7-Cre-Mäusen gekreuzt (23). Die resultierenden doppelheterozygoten Nachkommen wurden anschließend mit homozygoten Mfn2loxP/Mfn2loxP-Mäusen gekreuzt, um Purkinje-spezifische Gen-Knockouts für Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) zu erzeugen. In einer Untergruppe der Verpaarungen wurde das Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP-Allel (stop-mtYFP) durch weitere Kreuzungen eingeführt (20). Alle Tierversuche wurden gemäß den europäischen, nationalen und institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Deutschland, genehmigt. Die Tierversuche folgen außerdem den Richtlinien der Europäischen Föderation der Labortierkunde-Vereinigungen.
Nach der Anästhesie und Zervixluxation der Schwangeren wurde der Mausembryo (E13) isoliert. Die Hirnrinde wurde in Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) mit 10 mM HEPES präpariert und anschließend in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit Papain (20 U/ml) und Cystein (1 μg/ml) überführt. Das Gewebe wurde in DMEM inkubiert und enzymatisch dissoziiert. Anschließend wurde es 20 Minuten bei 37 °C inkubiert und in DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum mechanisch vermahlen. Die Zellen wurden auf mit Polylysin beschichtete Glasdeckgläschen mit einer Dichte von 2 × 10⁶ Zellen pro 6-cm-Kulturschale bzw. mit einer Dichte von 0,5 × 10⁵ Zellen/cm² für die Bildanalyse ausgesät. Nach 4 Stunden wurde das Medium durch serumfreies Neurobasal-Medium mit 1 % B27-Supplement und 0,5 mM GlutaMax ersetzt. Die Neuronen wurden während des gesamten Experiments bei 37 °C und 5 % CO₂ gehalten und einmal wöchentlich gefüttert. Um die Rekombination in vitro zu induzieren, wurden die Neuronen am zweiten Tag in vitro mit 3 μl (24-Well-Kulturschale) bzw. 0,5 μl (24-Well-Platte) des folgenden AAV9-Virusvektors behandelt: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, Katalognummer 105530-AAV9) und AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, Katalognummer 105545-AAV9).
Die komplementäre DNA (cDNA) der Mausgene Mfn1 und Mfn2 (aus den Addgene-Plasmiden Nr. 23212 bzw. 23213) ist am C-Terminus mit der V5-Sequenz (GKPIPNPLLGLDST) markiert und über die T2A-Sequenz in Leserahmen mit mCherry fusioniert. Grx1-roGFP2 wurde freundlicherweise vom Deutschen Krebsforschungszentrum Heidelberg (DKZ) zur Verfügung gestellt. Durch Austausch der tdTomato-Kassette mittels konventioneller Klonierungsmethoden wurde die Kassette in das pAAV-CAG-FLEX-tdTomato-Backbone (Addgene-Referenznummer 28306) subkloniert, um die Vektoren pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 und pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 zu generieren. Eine ähnliche Strategie wurde zur Generierung des Kontrollvektors pAAV-CAG-FLEX-mCherry verwendet. Für die Generierung des AAV-shPCx-Konstrukts wird ein Plasmid-AAV-Vektor (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) benötigt, der die DNA-Sequenz für die gegen Maus-PCx gerichtete shRNA (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) enthält. Unter der Kontrolle des U6-Promotors wird mCherry unter der Kontrolle des CMV-Promotors verwendet. Die Herstellung der Hilfs-AAV-Vektoren erfolgte gemäß den Anweisungen des Herstellers (Cell Biolabs). Kurz gesagt, wird ein Transferplasmid verwendet, das die Gene für mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) oder Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) sowie für das AAV1-Kapsidprotein und das zugehörige Hilfsprotein trägt. Die Transfektion erfolgt transient mit einem Calciumphosphat-Verpackungsplasmid. Der rohe Virusüberstand wird durch Einfrieren und Auftauen in einem Trockeneis/Ethanol-Bad gewonnen, und die Zellen werden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) lysiert. Der AAV-Vektor wurde mittels diskontinuierlicher Iodixanol-Gradienten-Ultrazentrifugation (24 Stunden bei 32.000 U/min und 4 °C) gereinigt und mit einem Amicon Ultra-15 Zentrifugalfilter konzentriert. Der Genomtiter von AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 (2,9 × 10¹³ Genomkopien (GC)/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 10¹² GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-MFN1-V5 (1,9 × 10¹³ GC/ml) und AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 10¹² GC/ml) wurde wie zuvor beschrieben (54) mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) bestimmt.
Primäre Neuronen wurden in eiskaltem 1x PBS abgelöst, pelletiert und anschließend in 0,5 % Triton X-100 / 0,5 % Natriumdesoxycholat/PBS-Lysepuffer mit Phosphatase- und Proteaseinhibitor (Roche) homogenisiert. Die Proteinquantifizierung erfolgte mittels Bicinchoninsäure-Assay (Thermo Fisher Scientific). Die Proteine ​​wurden anschließend mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran (GE Healthcare) transferiert. Nicht-spezifische Bindungsstellen wurden blockiert und die Membran mit dem primären Antikörper (siehe Tabelle S1 für Details) in 5 % Milch in TBST (Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween) inkubiert. Nach mehreren Waschschritten erfolgte die Inkubation mit dem sekundären Antikörper in TBST. Die Inkubation mit dem primären Antikörper erfolgte über Nacht bei +4 °C. Nach dem Waschen wurde der sekundäre Antikörper für 2 Stunden bei Raumtemperatur zugegeben. Die vollständige Beladung wurde durch Inkubation desselben Blots mit einem Anti-β-Actin-Antikörper bestätigt. Detektion durch Umwandlung in Chemilumineszenz und Verstärkung der Chemilumineszenz (GE Healthcare).
Die zuvor auf Glasdeckgläschen ausgesäten Neuronen wurden zum angegebenen Zeitpunkt 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd (PFA)/PBS fixiert. Die Deckgläschen wurden zunächst 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,1 % Triton X-100/PBS und anschließend in Blockierungspuffer (3 % Rinderserumalbumin (BSA)/PBS) permeabilisiert. Am zweiten Tag wurden die Deckgläschen mit Blockierungspuffer gewaschen und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit dem entsprechenden fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper inkubiert. Abschließend wurden die Proben gründlich in PBS gewaschen, mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gegengefärbt und mit Aqua-Poly/Mount auf einem Objektträger fixiert.
Mäuse (männlich und weiblich) wurden durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (130 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) anästhesiert und subkutan mit Carprofen (5 mg/kg) behandelt. Anschließend wurden sie in ein stereotaktisches Gerät (Kopf) mit Wärmematte eingespannt. Der Schädel wurde freigelegt und der Teil der Kleinhirnrinde, der dem Os migrans (von Lambda aus: Schwanz 1,8, lateral 1, entsprechend den Lobuli IV und V) entspricht, mit einem Dentalbohrer ausgedünnt. Mit einer gebogenen Injektionsnadel wurde vorsichtig ein kleines Loch in den Schädel gebohrt, um die darunterliegenden Blutgefäße nicht zu verletzen. Anschließend wird die dünne Glaskapillare langsam in die Mikroöffnung (von -1,3 bis -1 auf der ventralen Seite der Dura mater) eingeführt und 200 bis 300 nl AAV werden mithilfe von Handspritzen (Narishige) mehrmals unter niedrigem Druck über einen Zeitraum von 10 bis 20 Minuten in den Mikroinjektor (Narishige) injiziert. Nach der Infusion verbleibt die Kapillare weitere 10 Minuten, um eine vollständige Virusverteilung zu gewährleisten. Nach Entfernung der Kapillaren wird die Haut sorgfältig vernäht, um Wundentzündungen zu minimieren und die Genesung des Tieres zu fördern. Die Tiere wurden postoperativ mehrere Tage lang mit Schmerzmitteln (Caspofen) behandelt, ihr Allgemeinzustand wurde während dieser Zeit sorgfältig überwacht und sie wurden zum festgelegten Zeitpunkt euthanasiert. Alle Verfahren wurden gemäß den europäischen, nationalen und institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Deutschland, genehmigt.
Die Tiere wurden mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) anästhesiert. Das Herz wurde zunächst mit 0,1 M PBS und anschließend mit 4 % PFA in PBS perfundiert. Das Gewebe wurde präpariert und über Nacht bei 4 °C in 4 % PFA/PBS fixiert. Mit einem Vibrationsmesser (Leica Microsystems GmbH, Wien, Österreich) wurden Sagittalschnitte (50 μm dick) aus dem fixierten Gehirn in PBS angefertigt. Sofern nicht anders angegeben, erfolgte die Färbung der freischwimmenden Schnitte wie oben beschrieben (13) bei Raumtemperatur unter Rühren. Kurz gesagt, wurden die Schnitte zunächst 15 Minuten lang mit 0,5 % Triton X-100/PBS bei Raumtemperatur permeabilisiert; für einige Epitope (Pcx und Shmt2) wurden die Schnitte stattdessen 25 Minuten lang in Tris-EDTA-Puffer bei 80 °C (pH 9) erhitzt. Anschließend wurden die Schnitte über Nacht bei 4 °C unter Rühren in Blockierungspuffer (3 % BSA/PBS) mit dem primären Antikörper (siehe Tabelle S1) inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Schnitte mit Blockierungspuffer gewaschen und 2 Stunden bei Raumtemperatur mit dem entsprechenden fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper inkubiert. Abschließend wurden die Schnitte gründlich in PBS gewaschen, mit DAPI gegengefärbt und anschließend mit AquaPolymount auf einem Objektträger fixiert.
Zur Bildgebung der Probe wurde ein Laser-Scanning-Konfokalmikroskop (TCS SP8-X oder TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) mit Weißlichtlaser und einem 405-nm-Dioden-UV-Laser verwendet. Durch Anregung des Fluorophors und Erfassung des Signals mit dem Hybriddetektor (HyD) wurden mithilfe der LAS-X-Software gestapelte Bilder im Nyquist-Abtastmodus aufgenommen. Dies ist insbesondere für nicht-quantitative Analysen geeignet, da hochdynamische Signale (z. B. in somatischen Zellen und Dendriten) erfasst werden (mtYFP). Die Anzahl der PNs wurde im BrightR-Modus mithilfe des HyD bestimmt. Zur Reduzierung des Hintergrundrauschens wurde ein Gating von 0,3 bis 6 ns angewendet.
Echtzeit-Bildgebung sortierter Zellen. Nach der Sortierung in Neurobasal-A-Medium mit 1 % B27-Supplement und 0,5 mM GlutaMax wurden die Zellen sofort auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger (μ-Slide8 Well, Ibidi, Katalognummer 80826) ausgesät und anschließend 1 Stunde bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert, um das Anhaften der Zellen zu ermöglichen. Die Echtzeit-Bildgebung erfolgte mit einem Leica SP8 Laserscanning-Konfokalmikroskop, ausgestattet mit einem Weißlichtlaser, einem HyD-Ölimmersionsobjektiv (63×, numerische Apertur [NA] 1,4) und einem Heiztisch.
Die Maus wurde schnell mit Kohlendioxid betäubt und dekapitiert, das Gehirn wurde schnell aus dem Schädel entnommen und in 200 μm dicke (für 13C-Markierungsexperimente) bzw. 275 μm dicke (für Zwei-Photonen-Experimente) Sagittalschnitte geschnitten, die mit folgenden Materialien gefüllt waren: Das Eis (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Deutschland) ist mit folgenden Substanzen gefüllt: 125 mM eiskalte, kohlenstoffgesättigte (95 % O2 und 5 % CO2) Ca2+-arme künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF), NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM Natriumphosphatpuffer, 25 mM NaHCO3, 25 mM Glucose, 0,5 mM CaCl2 und 3,5 mM MgCl2 (osmotischer Druck von 310 bis 330 mmol). Überführen Sie die erhaltenen Hirnschnitte in eine Vorinkubationskammer mit höherer Ca2+-Konzentration in ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM Natriumphosphatpuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM D-Glucose, 1,0 mM CaCl2 und 2,0 mM MgCl2) Medium) pH 7,4 und 310 bis 320 mmol).
Während des Bildgebungsprozesses wurden die Gewebeschnitte in einen separaten Bildgebungsraum überführt und das Experiment unter kontinuierlicher ACSF-Perfusion bei einer konstanten Temperatur von 32–33 °C durchgeführt. Für die Bildgebung der Gewebeschnitte wurde ein Multiphotonen-Laserscanning-Mikroskop (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) mit einem Leica 25x-Objektiv (NA 0,95, Wasser) und einem Ti:Saphir-Laser (Chameleon Vision II, Coherent) verwendet. Zusätzlich kam ein FLIM-Modul (PicoHarp300, PicoQuant) zum Einsatz.
FLIM von Grx1-roGFP2. Die Veränderungen des zytoplasmatischen Redoxzustands von PNs wurden mittels Zwei-Photonen-FLIM in sagittalen Hirnschnitten gemessen, wobei der Grx1-roGFP2-Biosensor auf PNs abzielte. In der PN-Schicht wurde das Aufnahmefeld etwa 50 bis 80 μm unterhalb der Schnittoberfläche gewählt, um sicherzustellen, dass ein vitales PN vorhanden war (d. h. keine perlschnurartige Struktur oder neuronale morphologische Veränderungen entlang der Dendriten) und dass der doppelt positive roGFP2-Sensor und AAV, das shRNA PCx oder seine Kontrollsequenz kodiert (jeweils koexprimierend mCherry), vorhanden waren. Es wurden Einzelbildstapel mit 2-fachem Digitalzoom aufgenommen [Anregungswellenlänge: 890 nm; 512 nm 512 Pixel]. Detektion: Internes HyD, Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Filter und Bildmittelung innerhalb von 2 bis 3 Minuten gewährleisten die Erfassung einer ausreichenden Anzahl von Photonen (insgesamt 1000 Photonen) für die Kurvenanpassung. Die Sensitivität der Grx1-roGFP2-Sonde und die Überprüfung der FLIM-Bedingungen erfolgten durch Messung der Lebensdauer von roGFP2 nach Zugabe von exogenem 10 mM H₂O₂ zur Perfusions-ACSF (zur Maximierung der Oxidation und damit zur Verlängerung der Lebensdauer) und anschließender Zugabe von 2 mM Dithiothreitol (zur Minimierung der Reduktion und damit zur Verkürzung der Lebensdauer) (Abbildung S8, D bis G). Die erfassten Ergebnisse werden mit der Software FLIMfit 5.1.1 analysiert. Dabei wird die einfache exponentielle Abklingkurve des gesamten Bildes an die gemessene IRF (Instrumentenantwortfunktion) angepasst, wobei χ² ungefähr 1 beträgt. Zur Berechnung der Lebensdauer eines einzelnen PN wurde die Maske um den Nervenkörper manuell gezeichnet, und die durchschnittliche Lebensdauer in jeder Maske wurde zur Quantifizierung verwendet.
Analyse des mitochondrialen Potenzials. Nach 30-minütiger Inkubation des akuten Gewebeschnitts mit 100 nM TMRM, das direkt der perfundierten ACSF zugesetzt wurde, wurden die Veränderungen des mitochondrialen Potenzials der Purkinje-Neuronen mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie gemessen. Die TMRM-Bildgebung erfolgte durch Anregung der Sonde bei 920 nm und Verwendung von internem HyD (Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat: 585/40 nm) zur Signalerfassung. Für die Bildgebung von mtYFP wurde dieselbe Anregungswellenlänge, jedoch ein anderes internes HyD (FITC: 525/50 nm) verwendet. Mit dem ImageJ-Plugin „Image Calculator“ konnte das mitochondriale Potenzial auf Einzelzellebene ausgewertet werden. Kurz gesagt, die Plugin-Gleichung „Signal = min(mtYFP, TMRM)“ dient zur Identifizierung der mitochondrialen Region, die im Einzelbild-Konfokalmikroskopiebild des entsprechenden Kanals in Purkinje-Somali-Mäusen das TMRM-Signal zeigt. Anschließend wird die Pixelfläche in der resultierenden Maske quantifiziert und dann auf das entsprechende Schwellenwert-Einzelstapelbild des mtYFP-Kanals normalisiert, um den mitochondrialen Anteil zu erhalten, der das mitochondriale Potenzial anzeigt.
Das Bild wurde mit der Software Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) dekonvolviert. Für die gescannten Kachelbilder wurde die Montage einer einzelnen Kachel mithilfe des automatischen Stitching-Algorithmus der LAS-X-Software erstellt. Nach der Bildkalibrierung wurde das Bild mit ImageJ und Adobe Photoshop weiterbearbeitet und Helligkeit und Kontrast einheitlich angepasst. Die grafische Aufbereitung erfolgte mit Adobe Illustrator.
mtDNA-Fokusanalyse. Die Anzahl der mtDNA-Läsionen wurde in Kleinhirnschnitten, die mit Antikörpern gegen DNA markiert waren, mittels Konfokalmikroskopie quantifiziert. Für den Zellkörper und den Zellkern jeder Zelle wurde jeweils ein Zielbereich definiert und dessen Fläche mithilfe des Multi Measure-Plugins (ImageJ-Software) berechnet. Die Fläche des Zytoplasmas wurde durch Subtraktion der Kernfläche von der Zellkörperfläche ermittelt. Anschließend wurden die zytoplasmatischen DNA-Punkte, die mtDNA auf dem Schwellenwertbild anzeigen, mithilfe des Analyze Particles-Plugins (ImageJ-Software) automatisch quantifiziert. Die Ergebnisse wurden auf den PN-Mittelwert von Kontrollmäusen (CTRL) normiert und als durchschnittliche Anzahl von Nukleosiden pro Zelle angegeben.
Proteinexpressionsanalyse. Verwenden Sie das ImageJ-Plugin „Image Calculator“, um die Proteinexpression in Purkinje-Zellen auf Einzelzellebene zu analysieren. Kurz gesagt: Im konfokalen Einzelbild des entsprechenden Kanals wird mithilfe der Gleichung Signal = min(mtYFP, Antikörper) die mitochondriale Region identifiziert, die in Purkinje-Zellen Immunreaktivität gegenüber einem bestimmten Antikörper zeigt. Anschließend wird die Pixelfläche in der resultierenden Maske quantifiziert und auf das entsprechende Schwellenwert-Einzelbild des mtYFP-Kanals normalisiert, um den mitochondrialen Anteil des dargestellten Proteins zu erhalten.
Analyse der Purkinje-Zelldichte. Zur Bestimmung der Purkinje-Zelldichte wurde das Cell Counter-Plugin von ImageJ verwendet, indem die Anzahl der gezählten Purkinje-Zellen durch die Länge des von den gezählten Zellen eingenommenen Kleinhirnrings dividiert wurde.
Probenpräparation und -gewinnung. Die Gehirne der Kontrollgruppe und der Mfn2cKO-Mäuse wurden in 2 % PFA/2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) fixiert. Anschließend wurden mit Hilfe von Ciliaten (Leica Mikrosysteme GmbH, Wien, Österreich) koronale Schnitte (50–60 μm Dicke) angefertigt. Diese wurden in PB-Puffer mit 1 % Tetraoxid und 1,5 % Kaliumhexacyanoferrat(II) bei Raumtemperatur für eine Stunde fixiert. Die Schnitte wurden dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend 20 Minuten lang mit 70 % Ethanol, das 1 % Uranylacetat enthielt, gefärbt. Danach wurden die Schnitte in aufsteigenden Alkoholkonzentrationen entwässert und zwischen silikonbeschichteten Objektträgern in Durcupan ACM (Araldit-Gießharz M) Epoxidharz (Electron Microscopy Sciences, Katalognummer 14040) eingebettet. Abschließend erfolgte die Polymerisation im Ofen bei 60 °C für 48 Stunden. Der Bereich der Kleinhirnrinde wurde ausgewählt und 50 nm dünne Ultradünnschnitte mit einem Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wien, Österreich) angefertigt und auf einem 2 × 1 mm Kupferschlitzgitter, beschichtet mit Polystyrolfilm, aufgefangen. Die Schnitte wurden 10 Minuten lang mit einer 4%igen Uranylacetat-Lösung in H₂O gefärbt, mehrmals mit H₂O gewaschen, dann 10 Minuten lang mit Reynolds-Bleicitrat in H₂O gefärbt und anschließend erneut mehrmals mit H₂O gewaschen. Die Aufnahmen wurden mit einem Transmissionselektronenmikroskop Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) und einer digitalen Kamera TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA) angefertigt.
Bei mit AAV infizierten Mäusen wurde das Gehirn entnommen und in 1 mm dicke Sagittalschnitte zerlegt. Das Kleinhirn wurde anschließend fluoreszenzmikroskopisch untersucht, um den AAV-infizierten Ring (d. h. mCherry-exprimierend) zu identifizieren. Nur Experimente, bei denen die AAV-Injektion zu einer sehr hohen Transduktionseffizienz der Purkinje-Zellschicht (d. h. nahezu der gesamten Schicht) in mindestens zwei aufeinanderfolgenden Kleinhirnringen führte, wurden berücksichtigt. Die AAV-transduzierte Schleife wurde mikrodisseziert und über Nacht in 4 % PFA und 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Cocoate-Puffer nachfixiert und weiterverarbeitet. Für die EPON-Einbettung wurde das fixierte Gewebe mit 0,1 M Natriumcocoat-Puffer (Applichem) gewaschen und 4 Stunden lang mit 2 % OsO₄ (os, Science Services; Caco) in 0,1 M Natriumcocoat-Puffer (Applichem) inkubiert. Anschließend wurde erneut 2 Stunden gewaschen. Dieser Vorgang wurde dreimal mit 0,1 M Cocamid-Puffer wiederholt. Anschließend wurde das Gewebe in einer aufsteigenden Ethanolreihe jeweils 15 Minuten bei 4 °C inkubiert, um es zu dehydrieren. Das Gewebe wurde in Propylenoxid überführt und über Nacht in EPON (Sigma-Aldrich) bei 4 °C inkubiert. Danach wurde das Gewebe 2 Stunden bei Raumtemperatur in frischem EPON inkubiert und anschließend 72 Stunden bei 62 °C eingebettet. Mit einem Ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) und einem Diamantmesser (Diatome, Biel, Schweiz) wurden 70 nm dünne Ultradünnschnitte angefertigt und 15 Minuten bei 37 °C mit 1,5 % Uranylacetat und anschließend 4 Minuten mit Bleicitratlösung gefärbt. Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden mit einem JEM-2100 Plus Transmissionselektronenmikroskop (JEOL) mit Camera OneView 4K 16-Bit (Gatan) und der Software DigitalMicrograph (Gatan) angefertigt. Zur Analyse wurden Elektronenmikroskopaufnahmen mit 5000-facher bzw. 10.000-facher digitaler Vergrößerung angefertigt.
Morphologische Analyse der Mitochondrien. Für alle Analysen wurden die Konturen einzelner Mitochondrien in digitalen Bildern mithilfe der Software ImageJ manuell nachgezeichnet. Verschiedene morphologische Parameter wurden analysiert. Die mitochondriale Dichte wurde als Prozentsatz angegeben, der sich aus der Division der gesamten mitochondrialen Fläche jeder Zelle durch die Zytoplasmafläche (Zytoplasmafläche = Zellfläche – Zellkernfläche) × 100 ergibt. Die Rundheit der Mitochondrien wurde mit der Formel [4π∙(Fläche/Umfang²)] berechnet. Die Hauptmorphologie der Mitochondrien wurde analysiert und anhand ihrer Hauptformen in zwei Kategorien („tubulär“ und „bläschenförmig“) unterteilt.
Analyse der Anzahl und Dichte von Autophagosomen/Lysosomen. Verwenden Sie die Software ImageJ, um die Konturen jedes Autophagosoms/Lysosoms im digitalen Bild manuell nachzuzeichnen. Die Fläche der Autophagosomen/Lysosomen wird als Prozentsatz angegeben, indem die Gesamtfläche der Autophagosomen/Lysosomen jeder Zelle durch die Zytoplasmafläche (Zytoplasmafläche = Zellfläche – Kernfläche) × 100 dividiert wird. Die Dichte der Autophagosomen/Lysosomen wird berechnet, indem die Gesamtzahl durch die Anzahl der Autophagosomen/Lysosomen pro Zelle (bezogen auf die Zytoplasmafläche) (Zytoplasmafläche = Zellfläche – Kernfläche) dividiert wird.
Markierung für akute Schnittpräparation und Probenvorbereitung. Für Experimente, die eine Glucosemarkierung erfordern, werden die akuten Hirnschnitte in eine Präinkubationskammer überführt. Diese enthält gesättigten Kohlenstoff (95 % O₂ und 5 % CO₂), eine Ca²⁺-reiche ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM Natriumphosphatpuffer, 25,0 mM NaHCO₃, 25,0 mM D-Glucose, 1,0 mM CaCl₂ und 2,0 mM MgCl₂, pH 7,4 und 310–320 mOsm), in der Glucose als ¹³C⁶-Glucose-Substitutionsmarker (Eurisotop, Katalognummer CLM-1396) vorliegt. Für Experimente, die eine Pyruvatmarkierung erfordern, werden die akuten Hirnschnitte in eine ACSF-Lösung mit erhöhtem Ca²⁺-Gehalt (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM Natriumphosphatpuffer, 25,0 mM NaHCO₃, 25,0 mM D-Glucose, 1,0 mM CaCl₂ und 2,0 mM MgCl₂, pH 7,4 und 310–320 mOsm) überführt und mit 1 mM 1-[1-¹³C]Pyruvat (Eurisotop, Katalognummer CLM-1082) versetzt. Die Schnitte werden 90 Minuten bei 37 °C inkubiert. Am Ende des Experiments wurden die Schnitte rasch mit einer wässrigen Lösung (pH 7,4) mit 75 mM Ammoniumcarbonat gewaschen und anschließend in einem Gemisch aus Acetonitril (ACN), Methanol und Wasser (40:40:20, v/v/v) homogenisiert. Nach 30-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Proben 10 Minuten bei 4 °C und 21.000 g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde in einem SpeedVac-Konzentrator getrocknet. Das resultierende getrocknete Metabolitenpellet wurde bis zur Analyse bei -80 °C gelagert.
Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse von ¹³C-markierten Aminosäuren. Für die Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)-Analyse wurde das Metabolit-Pellet in 75 µl LC-MS-Wasser (Honeywell) resuspendiert. Nach Zentrifugation bei 21.000 g für 5 Minuten bei 4 °C wurden 20 µl des geklärten Überstands für die Aminosäure-Flux-Analyse verwendet, während der Rest des Extrakts sofort für die Anionenanalyse eingesetzt wurde (siehe unten). Die Aminosäureanalyse erfolgte nach dem zuvor beschriebenen Benzoylchlorid-Derivatisierungsprotokoll (55, 56). Im ersten Schritt wurden 10 µl 100 mM Natriumcarbonat (Sigma-Aldrich) zu 20 µl Metabolit-Extrakt gegeben, anschließend wurden 10 µl 2%iges Benzoylchlorid (Sigma-Aldrich) zu LC-MS-Wasser (Acetonitril) hinzugefügt. Die Probe wurde kurz vortexiert und anschließend 5 Minuten bei 21.000 g und 20 °C zentrifugiert. Der klare Überstand wurde in ein 2-ml-Autosampler-Vial mit konischem Glaseinsatz (200 μl Volumen) überführt. Die Proben wurden mit dem Ultrahochleistungs-LC-System Acquity iClass (Waters) analysiert, das mit dem hochauflösenden Präzisions-Massenspektrometer Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific) verbunden war. Für die Analyse wurden 2 μl der derivatisierten Probe in eine 100 × 1,0 mm hochfeste Silica-T3-Säule (Waters) mit 1,8 μm Partikelgröße injiziert. Die Flussrate betrug 100 μl/min, und das Puffersystem bestand aus Puffer A (10 mM Ammoniumformiat und 0,15 % Ameisensäure in Wasser) und Puffer B (Acetonitril). Der Gradient verlief wie folgt: 0 % B bei 0 Minuten; 0 % B. 0 bis 15 % B in 0 bis 0,1 Minuten; 15 bis 17 % B in 0,1 bis 0,5 Minuten; B bei 17 bis 55 % in 0,5 bis 14 Minuten; B bei 55 bis 70 % in 14 bis 14,5 Minuten; bei 14,5 bis 70 bis 100 % B in 18 Minuten; 100 % B in 18 bis 19 Minuten; 100 bis 0 % B in 19 bis 19,1 Minuten; 0 % B in 19,1 bis 28 Minuten (55, 56). Das QE-HF-Massenspektrometer arbeitet im positiven Ionisationsmodus mit einem Massenbereich von m/z (Masse-Ladungs-Verhältnis) von 50 bis 750. Die angewandte Auflösung beträgt 60.000, das Ionenziel (Gain Control, AGC) liegt bei 3 × 10⁶ und die maximale Ionenzeit bei 100 Millisekunden. Die beheizte Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) arbeitet mit einer Sprühspannung von 3,5 kV, einer Kapillartemperatur von 250 °C, einem Mantelstrom von 60 AU (willkürliche Einheiten) und einem Hilfsstrom von 20 AU. Die S-Linse ist auf 60 AU eingestellt.
Anionenchromatographie-MS-Analyse von 13C-markierten organischen Säuren. Der verbleibende Metabolitenniederschlag (55 μl) wurde mit einem Dionex-Ionenchromatographiesystem (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific), gekoppelt mit einem QE-HF-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific), analysiert. Kurz gesagt, wurden 5 μl des Metabolitenextrakts in eine Dionex IonPac AS11-HC-Säule (2 mm × 250 mm, Partikelgröße 4 μm, Thermo Fisher Scientific) im Push-in-Partial-Loop-Modus mit einem Füllverhältnis von 1 injiziert. Anschließend wurde eine Dionex IonPac AG11-HC-Vorsäule (2 mm × 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific) verwendet. Die Säulentemperatur wurde auf 30 °C und die Temperatur des Autosamplers auf 6 °C eingestellt. Mithilfe einer Kaliumhydroxid-Kartusche, die mit deionisiertem Wasser befüllt war, wurde ein Kaliumhydroxid-Gradient durch den Eluentengenerator erzeugt. Die Trennung der Metaboliten erfolgte bei einer Flussrate von 380 μl/min mit folgendem Gradienten: 0 bis 3 Minuten, 10 mM KOH; 3 bis 12 Minuten, 10 bis 50 mM KOH; 12 bis 19 Minuten, 50 bis 100 mM KOH; 19 bis 21 Minuten, 100 mM KOH; 21 bis 21,5 Minuten, 100 bis 10 mM KOH. Die Säule wurde anschließend 8,5 Minuten lang mit 10 mM KOH reäquilibriert.
Die eluierten Metaboliten werden nach der Säule mit einem Isopropanol-Zusatzstrom von 150 μl/min versetzt und anschließend einem hochauflösenden Massenspektrometer im Negativionisationsmodus zugeführt. Das MS überwacht den Massenbereich von m/z 50 bis 750 mit einer Auflösung von 60.000. Die automatische Verstärkungsregelung (AGC) ist auf 1 × 10⁶ eingestellt, und die maximale Ionenlaufzeit beträgt 100 ms. Die beheizte ESI-Quelle wurde mit einer Sprühspannung von 3,5 kV betrieben. Die weiteren Einstellungen der Ionenquelle sind: Kapillartemperatur 275 °C; Mantelgasfluss 60 AU; Hilfsgasfluss 20 AU bei 300 °C; S-Linsen-Einstellung 60 AU.
Datenanalyse von 13C-markierten Metaboliten. Die Isotopenverhältnisanalyse erfolgte mit der Software TraceFinder (Version 4.2, Thermo Fisher Scientific). Die Identität jeder Verbindung wurde anhand einer zuverlässigen Referenzverbindung verifiziert und unabhängig analysiert. Zur Durchführung der Isotopenanreicherungsanalyse wurde die Fläche des extrahierten Ionenchromatogramms (XIC) jedes 13C-Isotops (Mn) aus [M + H]+ extrahiert, wobei n die Kohlenstoffzahl der Zielverbindung ist (zur Analyse von Aminosäuren), bzw. aus [MH]+ (zur Analyse von Anionen). Die Massengenauigkeit des XIC liegt unter fünf ppm, die Genauigkeit der Retentionszeit (RT) bei 0,05 Minuten. Die Anreicherungsanalyse erfolgte durch Berechnung des Verhältnisses jedes detektierten Isotops zur Summe aller Isotope der entsprechenden Verbindung. Diese Verhältnisse werden als Prozentwerte für jedes Isotop angegeben, und die Ergebnisse werden als molare prozentuale Anreicherung (MPE) ausgedrückt, wie bereits beschrieben (42).
Das gefrorene Neuronenpellet wurde in eiskaltem 80%igem Methanol (v/v) homogenisiert, vortexiert und 30 Minuten bei -20 °C inkubiert. Anschließend wurde die Probe erneut vortexiert und 30 Minuten bei +4 °C gerührt. Die Probe wurde 5 Minuten bei 4 °C und 21.000 g zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde abgenommen und mittels SpeedVac-Konzentrator bei 25 °C für die nachfolgende Analyse getrocknet. Wie oben beschrieben, wurde eine LC-MS-Analyse der Aminosäuren der sortierten Zellen durchgeführt. Die Datenanalyse erfolgte mit TraceFinder (Version 4.2, Thermo Fisher Scientific) anhand der monoisotopischen Masse jeder Verbindung. Die Quantilnormalisierung der Metabolitendaten wurde mit dem Softwarepaket preprocessCore (57) durchgeführt.
Präparation der Hirnschnitte. Die Maus wurde schnell mit Kohlendioxid anästhesiert und dekapitiert. Das Gehirn wurde schnell aus dem Schädel entnommen und mit einem eisgefüllten Vibrationsmesser (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Deutschland) in 300 bis 375 μm dicke Sagittalschnitte geschnitten. Kaltkohlenstoffbegasung (95 % O2 und 5 % CO2). Kalziumarme ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM Natriumphosphatpuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM D-Glucose, 1,0 mM CaCl2 und 6,0 ​​mM MgCl2, pH 7,4 und 310 bis 330 mOsm). Überführen Sie die gewonnenen Hirnschnitte in eine Kammer mit erhöhter Ca²⁺-Konzentration in ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM Natriumphosphatpuffer, 25,0 mM NaHCO₃, 25,0 mM D-Glucose, 4,0 mM CaCl₂ und 3,5 mM MgCl₂; pH 7,4; 310–320 mOsm). Die Schnitte werden 20–30 Minuten lang gelagert, um sich vor der Messung zu regenerieren.
Für alle Aufnahmen wurde ein Mikroskoptisch mit fester Aufnahmekammer und einem 20-fachen Wasserimmersionsobjektiv (Scientifica) verwendet. Die mutmaßlichen Purkinje-Zellen wurden anhand ihrer Körpergröße, ihrer anatomischen Lage im Kleinhirn und der Expression des fluoreszierenden Reportergens mtYFP identifiziert. Die Patch-Pipette mit einem Spitzenwiderstand von 5 bis 11 Megaohm wurde mithilfe einer Borosilikatglaskapillare (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Deutschland) und einer horizontalen Pipette (P-1000, Sutter Instruments, Novato, CA, USA) herausgezogen. Alle Aufnahmen wurden mit einem ELC-03XS npi Patch-Clamp-Verstärker (npi electronic GmbH, Tam, Deutschland) durchgeführt, der von der Software Signal (Version 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK) gesteuert wurde. Die Aufzeichnung erfolgte mit einer Abtastrate von 12,5 kHz. Das Signal wird mit zwei Bessel-Kurzpassfiltern mit Grenzfrequenzen von 1,3 bzw. 10 kHz gefiltert. Die Kapazität der Membran und der Pipette wird mittels Kompensationsschaltung und Verstärker kompensiert. Alle Experimente wurden mit einer Orca-Flash 4.0-Kamera (Hamamatsu, Gerden, Deutschland) durchgeführt, die von der Hokawo-Software (Version 2.8, Hamamatsu, Gerden, Deutschland) gesteuert wurde.
Routinemäßige Ganzzell-Konfiguration und -Analyse. Unmittelbar vor der Messung wird die Pipette mit der internen Lösung gefüllt, die folgende Substanzen enthält: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM Kaliumgluconat, 10,0 mM HEPES, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM Guanosintriphosphat (GTP) (Na) und 10,0 mM Kreatinphosphat. Der pH-Wert wurde auf 7,25 eingestellt, der osmotische Druck betrug 290 mOsm (Saccharose). Unmittelbar nach Anlegen einer Kraft von 0 pA zur Membranruptur wurde das Ruhemembranpotenzial gemessen. Der Eingangswiderstand wurde durch Anlegen hyperpolarisierter Ströme von -40, -30, -20 und -10 pA bestimmt. Die Größe der Spannungsantwort wurde gemessen und der Eingangswiderstand mithilfe des Ohmschen Gesetzes berechnet. Die Spontanaktivität wurde 5 Minuten lang in einer Spannungsklemme aufgezeichnet. Spontane postsynaptische Ströme (sPSC) wurden mit Hilfe eines halbautomatischen Erkennungsskripts in Igor Pro (Version 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) identifiziert und gemessen. Die Strom-Spannungs-Kennlinie (IV-Kurve) und der stationäre Strom wurden durch Klemmen der Batterie auf verschiedene Potenziale (beginnend bei -110 mV) und anschließendes Erhöhen der Spannung in 5-mV-Schritten gemessen. Die Aktionspotenzialauslösung (AP) wurde durch Anlegen eines depolarisierenden Stroms untersucht. Die Zelle wurde bei -70 mV geklemmt, während ein depolarisierender Stromimpuls angelegt wurde. Die Schrittweite jeder Aufzeichnungseinheit wurde separat eingestellt (10 bis 60 pA). Die maximale AP-Frequenz wurde durch manuelles Zählen der Impulsspitzen berechnet, die die höchste AP-Frequenz verursachten. Die AP-Schwelle wurde anhand der zweiten Ableitung des Depolarisationsimpulses analysiert, der als erstes ein oder mehrere APs auslöste.
Perforierte Patch-Clamp-Konfiguration und -Analyse. Führen Sie perforierte Patch-Clamp-Ableitungen gemäß Standardprotokollen durch. Verwenden Sie eine ATP- und GTP-freie Pipette, die folgende Bestandteile nicht enthält: 128 mM Kaliumgluconat, 10 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,1 mM EGTA und 2 mM MgCl₂. Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 7,2 ein. ATP und GTP werden der intrazellulären Lösung weggelassen, um eine unkontrollierte Permeabilität der Zellmembran zu verhindern. Die Patch-Pipette wird mit einer Amphotericin-haltigen internen Lösung (ca. 200–250 µg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) gefüllt, um eine gestanzte Patch-Clamp-Ableitung zu erhalten. Amphotericin wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO; D8418, Sigma-Aldrich) gelöst (Endkonzentration: 0,1–0,3 %). Die verwendete DMSO-Konzentration hatte keinen signifikanten Einfluss auf die untersuchten Neuronen. Während des Stanzvorgangs wurde der Kanalwiderstand (Ra) kontinuierlich überwacht. Das Experiment wurde gestartet, nachdem sich die Amplitude von Ra und Aktionspotenzial (AP) stabilisiert hatte (20–40 Minuten). Spontane Aktivität wurde 2–5 Minuten lang mittels Spannungs- und/oder Stromklemme gemessen. Die Datenanalyse erfolgte mit Igor Pro (Version 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (Version 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) und GraphPad Prism (Version 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Zur Identifizierung spontaner Aktionspotenziale wurde das NeuroMatic v3.0c-Plugin von Igor Pro verwendet. Aktionspotenziale werden automatisch anhand eines für jede Aufzeichnung individuell angepassten Schwellenwerts identifiziert. Aus dem Spike-Intervall wird die Spike-Frequenz mit der maximalen momentanen und der durchschnittlichen Spike-Frequenz bestimmt.
PN-Isolierung. Durch Anpassung des zuvor veröffentlichten Protokolls wurden PNs aus dem Kleinhirn der Maus in einem bestimmten Entwicklungsstadium isoliert (58). Kurz gesagt, das Kleinhirn wurde präpariert und in eiskaltem Dissoziationsmedium [ohne HBSS, Ca²⁺ und Mg²⁺, ergänzt mit 20 mM Glucose, Penicillin (50 U/ml) und Streptomycin (0,05 mg/ml)] zerkleinert. Anschließend wurde das Medium in Papain [HBSS, ergänzt mit 1-Cystein·HCl (1 mg/ml), Papain (16 U/ml) und Desoxyribonuklease I (DNase I; 0,1 mg/ml)] verdaut und 30 Minuten bei 30 °C inkubiert. Zuerst werden die Gewebeproben in HBSS-Medium mit Eischleim (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) und DNase (0,1 mg/ml) bei Raumtemperatur gewaschen, um eine enzymatische Verdauung zu verhindern. Anschließend werden sie in HBSS-Medium mit 20 mM Glucose versetzt. Durch vorsichtiges Verreiben in HBSS mit Penicillin (50 U/ml), Streptomycin (0,05 mg/ml) und DNase (0,1 mg/ml) werden Einzelzellen freigesetzt. Die resultierende Zellsuspension wird durch einen 70-µm-Zellfilter filtriert, die Zellen werden durch Zentrifugation (1110 U/min, 5 Minuten, 4 °C) pelletiert und in Sortiermedium [HBSS, ergänzt mit 20 mM Glucose, 20 % fötalem Kälberserum, Penicillin (50 U/ml) und Streptomycin (0,05 mg/ml)] resuspendiert. Die Zellviabilität wurde mit Propidiumiodid bestimmt und die Zelldichte auf 1×10⁶ bis 2×10⁶ Zellen/ml eingestellt. Vor der Durchflusszytometrie wurde die Suspension durch einen 50-µm-Zellfilter filtriert.
Durchflusszytometrie. Die Zellsortierung erfolgte bei 4 °C mit einem FACSAria III-Gerät (BD Biosciences) und der Software FACSDiva (BD Biosciences, Version 8.0.1). Die Zellsuspension wurde mit einer 100-µm-Düse unter einem Druck von 20 psi mit einer Rate von ca. 2800 Ereignissen/s sortiert. Da herkömmliche Gating-Kriterien (Zellgröße, bimodale Diskriminierung und Streueigenschaften) die korrekte Isolierung von PN von anderen Zelltypen nicht gewährleisten können, basiert die Gating-Strategie auf dem direkten Vergleich der YFP-Intensität und Autofluoreszenz in mitoYFP+- und Kontrollmäusen (mitoYFP−). YFP wird durch Bestrahlung der Probe mit einer 488-nm-Laserlinie angeregt, und das Signal wird mit einem 530/30-nm-Bandpassfilter detektiert. In mitoYFP+-Mäusen wird zusätzlich die relative Stärke des Rosa26-mitoYFP-Reportergens verwendet, um neuronale Zellkörper und Axonfragmente zu unterscheiden. 7-AAD wird mit einem gelben Laser (561 nm) angeregt und mit einem 675/20-nm-Bandpassfilter detektiert, um tote Zellen auszuschließen. Zur gleichzeitigen Trennung von Astrozyten wurde die Zellsuspension mit ACSA-2-APC angefärbt, anschließend mit einer 640-nm-Laserlinie bestrahlt und das Signal mit einem 660/20-nm-Bandpassfilter detektiert.
Die gesammelten Zellen wurden durch Zentrifugation (1110 U/min, 5 Minuten, 4 °C) pelletiert und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert. Mfn2cKO-Mäuse und ihre Nachkommen wurden am selben Tag klassifiziert, um die Verfahrensvariabilität zu minimieren. Die FACS-Daten wurden mit der Software FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) präsentiert und analysiert.
Wie bereits erwähnt (59), wird die Echtzeit-PCR zur Isolierung von DNA aus den sortierten Neuronen für die anschließende mtDNA-Quantifizierung eingesetzt. Linearität und Nachweisgrenze wurden zunächst durch qPCR-Analysen mit unterschiedlichen Zellzahlen getestet. Dazu wurden 300 PN in einem Lysepuffer aus 50 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5 % Tween 20 und Proteinase K (200 ng/ml) aufgenommen und 120 Minuten bei 55 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen weitere 10 Minuten bei 95 °C inkubiert, um die vollständige Inaktivierung der Proteinase K zu gewährleisten. Die mtDNA-Menge wurde mittels semiquantitativer PCR im 7900HT Echtzeit-PCR-System (Thermo Fisher Scientific) unter Verwendung einer TaqMan-Sonde (Thermo Fisher), spezifisch für mt-Nd1, bestimmt. Science, Katalognummer Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, Katalognummer AIVI3E8) und 18S (Thermo Fisher Scientific, Katalognummer Hs99999901_s1) Gene.
Proteomprobenpräparation. Die Lösung wurde in Lysepuffer [6 M Guanidiniumchlorid, 10 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid, 10 mM Chloracetamid und 100 mM Tris-HCl] gegeben und 10 Minuten lang auf einem Bioruptor (Diagenode) sonifiziert (30 Sekunden Puls / 30 Sekunden Pause). Anschließend wurde die Probe 1:10 in 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) verdünnt, mit 300 ng Trypsin Gold (Promega) versetzt und über Nacht bei 37 °C inkubiert, um eine vollständige Verdauung zu gewährleisten. Am zweiten Tag wurde die Probe 20 Minuten lang bei 20.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 0,1%iger Ameisensäure verdünnt und die Lösung mit selbst hergestellten StageTips entsalzt. Die Probe wurde in einem SpeedVac (Eppendorf Concentrator Plus 5305) bei 45 °C getrocknet und anschließend das Peptid in 0,1%iger Ameisensäure suspendiert. Alle Proben wurden gleichzeitig von derselben Person präpariert. Zur Analyse von Astrozytenproben wurden 4 μg entsalzte Peptide mit einem Tandem-Massentag (TMT10plex, Katalognummer 90110, Thermo Fisher Scientific) im Verhältnis 1:20 (Peptid:TMT-Reagenz) markiert. Für die TMT-Markierung wurden 0,8 mg TMT-Reagenz in 70 μl wasserfreiem Acetonitril (ACN) resuspendiert und das getrocknete Peptid in 9 μl 0,1 M TEAB (Triethylammoniumbicarbonat) gelöst. Anschließend wurden 7 μl TMT-Reagenz in ACN hinzugegeben. Die Konzentration betrug 43,75 %. Nach 60 Minuten Inkubation wurde die Reaktion mit 2 μl 5%iger Hydroxylaminlösung gestoppt. Die markierten Peptide wurden gesammelt, getrocknet, in 200 μl 0,1%iger Ameisensäure (FA) resuspendiert, halbiert und anschließend mit selbst hergestellten StageTips entsalzt. Eine der beiden Hälften wurde mittels Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UltiMate 3000) an einer 1 mm × 150 mm Acquity-Chromatographiesäule mit 130 Å 1,7 μm C18-Partikeln (Waters, Katalognr. SKU: 186006935; Thermo Fisher Scientific) fraktioniert. Die Peptide werden bei einer Flussrate von 30 μl/min getrennt. Die Trennung erfolgt durch eine stufenweise Gradientenelution von 1 % auf 50 % Puffer B über 85 Minuten, gefolgt von einer Gradientenelution von 50 % auf 95 % Puffer B über 3 Minuten und anschließend 8 Minuten mit 95 % Puffer B. Puffer A besteht aus 5 % Acetonitril (ACN) und 10 mM Ammoniumbicarbonat (ABC), Puffer B aus 80 % ACN und 10 mM ABC. Die Fraktionen werden alle 3 Minuten gesammelt, zu zwei Gruppen zusammengefasst (1 + 17, 2 + 18 usw.) und in einer Vakuumzentrifuge getrocknet.
LC-MS/MS-Analyse. Für die Massenspektrometrie wurden die Peptide (Nr. r119.aq) auf einer 25 cm langen PicoFrit-Analysensäule mit 75 μm Innendurchmesser (neues Objektiv, Teilenummer PF7508250) mit 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ-Medium (Dr. Maisch, mat) getrennt. Die Analyse erfolgte mit einem EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Deutschland). Die Säule wurde auf 50 °C temperiert. Als Puffer A und B dienten 0,1 % Ameisensäure in Wasser bzw. 0,1 % Ameisensäure in 80 % Acetonitril. Die Peptide wurden mit einem Gradienten von 200 nl/min 65 Minuten lang von 6 % auf 31 % Puffer B und anschließend 5 Minuten lang von 31 % auf 50 % Puffer B eluiert. Die eluierten Peptide wurden mit einem Orbitrap Fusion Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) analysiert. Die m/z-Messung der Peptidvorläufer erfolgte mit einer Auflösung von 120.000 im Bereich von 350 bis 1500 m/z. Unter Verwendung einer normierten Kollisionsenergie von 27 % wurde der stärkste Vorläufer mit einer Ladung von 2 bis 6 für die hochenergetische C-Trap-Dissoziation (HCD) ausgewählt. Die Zykluszeit betrug 1 s. Der m/z-Wert des Peptidfragments wurde in der Ionenfalle mit dem kleinsten AGC-Zielwert von 5 × 10⁴ und einer maximalen Injektionszeit von 86 ms gemessen. Nach der Fragmentierung wurde der Vorläufer für 45 s auf die dynamische Ausschlussliste gesetzt. TMT-markierte Peptide wurden auf einer 50 cm langen, 75 μm Acclaim PepMap-Säule (Thermo Fisher Scientific, Katalognummer 164942) getrennt und die Migrationsspektren mit einem Orbitrap Lumos Tribrid Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) analysiert, das mit einem High-Field Asymmetric Waveform Ions (FAIMS)-System (Thermo Fisher Scientific) ausgestattet ist und mit zwei Kompensationsspannungen von −50 V und −70 V arbeitet. Für die Messung des TMT-Reportionensignals wurde MS3 anhand des Synchronisationsvorläuferions ausgewählt. Die Peptidtrennung erfolgte auf einer EASY-nLC 1200-Säule mit einem linearen Gradienten von 90 % und einer Pufferkonzentration von 6 % bis 31 %. Puffer A bestand aus 0,1 % Ameisensäure (FA), Puffer B aus 0,1 % FA und 80 % Acetonitril (ACN). Die analytische Säule wurde bei 50 °C betrieben. Verwenden Sie FreeStyle (Version 1.6, Thermo Fisher Scientific), um die Originaldatei entsprechend der FAIMS-Kompensationsspannung aufzuteilen.
Proteinidentifizierung und -quantifizierung. Die Originaldaten wurden mithilfe der integrierten Andromeda-Suchmaschine und MaxQuant Version 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) analysiert. Zusätzlich zu den aus Aequorea victoria gewonnenen Cre-Rekombinase- und YFP-Sequenzen wurden Peptidfragmentspektren der kanonischen Sequenz und der Isoformsequenz des Maus-Referenzproteoms (Proteom-ID UP000000589, heruntergeladen von UniProt im Mai 2017) durchsucht. Methioninoxidation und N-terminale Acetylierung von Proteinen wurden als variable Modifikationen, Cystein-Carbamoylmethylierung als fixe Modifikation definiert. Die Verdauungsparameter waren auf „Spezifität“ und „Trypsin/P“ eingestellt. Die Mindestanzahl an Peptiden und Razor-Peptiden für die Proteinidentifizierung betrug 1, die Mindestanzahl an eindeutigen Peptiden 0. Unter den Bedingungen des Peptid-Map-Matchings lag die Proteinidentifizierungsrate bei 0,01. Die Option „Zweites Peptid“ war aktiviert. Verwenden Sie die Option „Übereinstimmung zwischen Läufen“, um erfolgreiche Identifizierungen zwischen verschiedenen Originaldateien zu übertragen. Verwenden Sie für die label-freie Quantifizierung (LFQ) ein minimales Verhältnis von 1 (60). Die LFQ-Intensität wird so gefiltert, dass in mindestens einer Genotypgruppe zu jedem Zeitpunkt mindestens zwei gültige Werte vorliegen. Die Extrapolation erfolgt aus einer Normalverteilung mit einer Breite von 0,3 und einem Abstand von 1,8 nach unten. Analysieren Sie die LFQ-Ergebnisse mit der Perseus-Plattform (https://maxquant.net/perseus/) und R (https://r-project.org/). Für die Analyse der differentiellen Genexpression wurde ein zweiseitiger t-Test mit moderaten Stichproben aus dem Softwarepaket limma verwendet (61). Die explorative Datenanalyse erfolgte mit ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally und pheatmap. Die TMT-basierten Proteomikdaten wurden mit MaxQuant Version 1.6.10.43 analysiert. Suchen Sie nach Rohdaten der Proteomik aus der UniProt-Datenbank für humane Proteomik (Stand: September 2018). Die Analyse berücksichtigt den vom Hersteller bereitgestellten Isotopenreinheitskorrekturfaktor. Verwenden Sie limma in R für die differentielle Expressionsanalyse. Die Originaldaten, die Ergebnisse der Datenbanksuche sowie der Workflow und die Ergebnisse der Datenanalyse sind im ProteomeXchange-Netzwerk über das PRIDE-Partner-Repository unter der Datensatzkennung PXD019690 gespeichert.
Funktionelle Annotationen bereichern die Analyse. Mithilfe des Tools Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) wurde die Dichte der funktionellen Annotationsbegriffe des Datensatzes nach 8 Wochen bestimmt (Abbildung 1). Kurz gesagt, die aus der LC-MS/MS-Datenanalyse (Tandem-Massenspektrometrie) gewonnene quantitative Proteinliste wurde anhand der folgenden Filterkriterien verwendet: Mus musculus wurde als Spezies und Hintergrund ausgewählt, und Kategorien mit einem nach Benjamini korrigierten p-Wert von 0,05 oder niedriger wurden als signifikant betrachtet. In dieser Abbildung sind die fünf häufigsten Kategorien jedes Clusters basierend auf dem korrigierten p-Wert dargestellt. Mithilfe eines multiplen t-Tests und des zweistufigen linearen Boost-Programms von Benjamini, Krieger und Yekutieli (Q = 5 %) wurde eine zeitliche Analyse der Proteinexpression der in jeder Kategorie identifizierten wichtigen Kandidaten durchgeführt, wobei jede Zeile separat analysiert wurde. Eine einheitliche Standardabweichung (SD) ist nicht erforderlich.
Um die Ergebnisse dieser Studie mit veröffentlichten Datenbanken zu vergleichen und ein Venn-Diagramm in Abbildung 1 zu erstellen, kombinierten wir die quantitative Proteinliste mit den MitoCarta 2.0-Annotationen (24). Verwenden Sie das Online-Tool „Venn-Diagramm zeichnen“ (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/), um das Diagramm zu erstellen.
Detaillierte Informationen zu den statistischen Verfahren der Proteomanalyse finden Sie im entsprechenden Abschnitt „Material und Methoden“. Alle anderen Experimente sind in der jeweiligen Legende detailliert beschrieben. Sofern nicht anders angegeben, sind alle Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Alle statistischen Analysen wurden mit der Software GraphPad Prism 8.1.2 durchgeführt.
Ergänzendes Material zu diesem Artikel finden Sie unter http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
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Von E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Die proteomische Analyse dysfunktionaler Neuronen ergab, dass Stoffwechselprogramme aktiviert werden, um der Neurodegeneration entgegenzuwirken.
Von E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Die proteomische Analyse dysfunktionaler Neuronen ergab, dass Stoffwechselprogramme aktiviert werden, um der Neurodegeneration entgegenzuwirken.
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