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Propionsäure (PPA) wird zur Untersuchung der Rolle mitochondrialer Dysfunktion bei neurologischen Entwicklungsstörungen wie Autismus-Spektrum-Störungen eingesetzt. PPA ist dafür bekannt, die mitochondriale Biogenese, den Stoffwechsel und den Umsatz zu beeinträchtigen. Die Auswirkungen von PPA auf die mitochondriale Dynamik, Fission und Fusion sind jedoch aufgrund der komplexen zeitlichen Natur dieser Mechanismen weiterhin unklar. In dieser Studie untersuchen wir mithilfe komplementärer quantitativer Bildgebungsverfahren, wie PPA die mitochondriale Ultrastruktur, Morphologie und Dynamik in neuronalen SH-SY5Y-Zellen beeinflusst. PPA (5 mM) führte zu einer signifikanten Verringerung der mitochondrialen Fläche (p < 0,01), des Feret-Durchmessers und -Umfangs (p < 0,05) sowie der Fläche 2 (p < 0,01). Die Analyse mittels Mitochondrial Event Locator (MELO) zeigte einen signifikanten Anstieg (p < 0,05) der Fissions- und Fusionsereignisse, wodurch die Integrität des mitochondrialen Netzwerks unter Stressbedingungen erhalten bleibt. Darüber hinaus war die mRNA-Expression von cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) und OPA1 (p < 0,05) signifikant reduziert. Dies verdeutlicht die Umstrukturierung der mitochondrialen Morphologie, Biogenese und Dynamik zur Aufrechterhaltung der Funktion unter Stressbedingungen. Unsere Daten liefern neue Erkenntnisse über die Auswirkungen von PPA auf die mitochondriale Dynamik und unterstreichen den Nutzen von Bildgebungsverfahren zur Untersuchung der komplexen Regulationsmechanismen, die an mitochondrialen Stressreaktionen beteiligt sind.
Mitochondrien sind über ihre typischen Rollen in der Energieproduktion und Biosynthese hinaus an einer Vielzahl zellulärer Funktionen beteiligt. Der mitochondriale Stoffwechsel reguliert maßgeblich die Kalziumsignalübertragung, die metabolische und Redox-Homöostase, Entzündungssignale, epigenetische Modifikationen, Zellproliferation, Zelldifferenzierung und den programmierten Zelltod¹. Insbesondere ist der mitochondriale Stoffwechsel entscheidend für die neuronale Entwicklung, das Überleben und die Funktion von Neuronen und spielt eine wichtige Rolle bei verschiedenen neuropathologischen Manifestationen^2,3,4.
Im letzten Jahrzehnt hat sich der Stoffwechselstatus als zentraler Regulator der Neurogenese, Differenzierung, Reifung und Plastizität herausgestellt^5,6. Mitochondrienmorphologie und -dynamik sind in jüngster Zeit zu besonders wichtigen Bestandteilen der Mitose geworden, einem dynamischen Prozess, der einen Pool gesunder Mitochondrien in den Zellen aufrechterhält. Die mitochondriale Dynamik wird durch komplexe, voneinander abhängige Signalwege reguliert, die von der mitochondrialen Biogenese und Bioenergetik bis hin zu mitochondrialer Fission, Fusion, Transport und Clearance reichen^7,8. Die Störung eines dieser integrativen Mechanismen beeinträchtigt die Aufrechterhaltung gesunder mitochondrialer Netzwerke und hat tiefgreifende funktionelle Konsequenzen für die neuronale Entwicklung^9,10. Tatsächlich wird eine Dysregulation der mitochondrialen Dynamik bei vielen psychiatrischen, neurodegenerativen und neurokognitiven Störungen beobachtet, einschließlich Autismus-Spektrum-Störungen (ASS)^11,12.
Autismus-Spektrum-Störungen (ASS) sind heterogene neurologische Entwicklungsstörungen mit einer komplexen genetischen und epigenetischen Architektur. Die Erblichkeit von ASS ist unbestritten, die zugrundeliegende molekulare Ätiologie jedoch weiterhin unzureichend verstanden. Zunehmende Daten aus präklinischen Modellen, klinischen Studien und Multi-Omics-Datensätzen liefern immer mehr Hinweise auf mitochondriale Dysfunktion bei ASS^13,14. Wir führten zuvor ein genomweites DNA-Methylierungs-Screening in einer Kohorte von Patienten mit ASS durch und identifizierten differentiell methylierte Gene, die entlang mitochondrialer Stoffwechselwege geclustert sind¹⁵. Anschließend berichteten wir über eine differentielle Methylierung zentraler Regulatoren der mitochondrialen Biogenese und Dynamik, die mit einer erhöhten mtDNA-Kopienzahl und einem veränderten Harnstoffwechselprofil bei ASS assoziiert war¹⁶. Unsere Daten liefern zunehmend Hinweise darauf, dass die mitochondriale Dynamik und Homöostase eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie von ASS spielen. Daher ist die Verbesserung des mechanistischen Verständnisses des Zusammenhangs zwischen mitochondrialer Dynamik, Morphologie und Funktion ein zentrales Ziel der laufenden Forschung zu neurologischen Erkrankungen, die durch sekundäre mitochondriale Dysfunktion gekennzeichnet sind.
Molekularbiologische Techniken werden häufig eingesetzt, um die Rolle spezifischer Gene bei mitochondrialen Stressreaktionen zu untersuchen. Dieser Ansatz kann jedoch durch die Vielschichtigkeit und zeitliche Dynamik mitotischer Kontrollmechanismen eingeschränkt sein. Darüber hinaus ist die differentielle Expression mitochondrialer Gene ein indirekter Indikator für funktionelle Veränderungen, insbesondere da typischerweise nur eine begrenzte Anzahl von Genen analysiert wird. Daher wurden direktere Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Funktion und Bioenergetik vorgeschlagen¹⁷. Die mitochondriale Morphologie ist eng mit der mitochondrialen Dynamik verknüpft. Form, Konnektivität und Struktur der Mitochondrien sind entscheidend für die Energieproduktion sowie das Überleben von Mitochondrien und Zellen^5,18. Die verschiedenen Phasen der Mitose zielen zudem auf Veränderungen der mitochondrialen Morphologie ab, die als nützliche Endpunkte mitochondrialer Dysfunktion dienen und eine Grundlage für nachfolgende mechanistische Studien bilden können.
Die Morphologie von Mitochondrien lässt sich mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) direkt beobachten und ermöglicht so die detaillierte Untersuchung der zellulären Ultrastruktur. TEM visualisiert Morphologie, Form und Struktur der Mitochondrien-Cristae auf der Ebene einzelner Mitochondrien und ist damit nicht allein auf Gentranskription, Proteinexpression oder mitochondriale Funktionsparameter in Zellpopulationen angewiesen^17,19,20. Darüber hinaus erleichtert TEM die Untersuchung von Interaktionen zwischen Mitochondrien und anderen Organellen wie dem endoplasmatischen Retikulum und Autophagosomen, die eine Schlüsselrolle in der mitochondrialen Funktion und Homöostase spielen^21,22. Daher eignet sich TEM hervorragend als Ausgangspunkt für die Untersuchung mitochondrialer Dysfunktion, bevor man sich auf spezifische Signalwege oder Gene konzentriert. Da die mitochondriale Funktion in der Neuropathologie zunehmend an Bedeutung gewinnt, besteht ein dringender Bedarf, die mitochondriale Morphologie und Dynamik in neuronalen In-vitro-Modellen direkt und quantitativ untersuchen zu können.
In diesem Artikel untersuchen wir die mitochondriale Dynamik in einem neuronalen Modell mitochondrialer Dysfunktion bei Autismus-Spektrum-Störungen. Wir berichteten bereits über eine differentielle Methylierung der Propionyl-CoA-Carboxylase beta (PCCB) bei ASD15, einer Untereinheit des mitochondrialen Enzyms Propionyl-CoA-Carboxylase PCC. Eine Dysregulation von PCC führt bekanntermaßen zur toxischen Akkumulation von Propionylderivaten, darunter Propionsäure (PPA)23,24,25. PPA stört nachweislich den neuronalen Stoffwechsel und verändert das Verhalten in vivo und ist ein etabliertes Tiermodell zur Untersuchung neuroentwicklungsbedingter Mechanismen bei ASD26,27,28. Darüber hinaus wurde berichtet, dass PPA das mitochondriale Membranpotenzial, die Biogenese und die Atmung in vitro beeinträchtigt und häufig zur Modellierung mitochondrialer Dysfunktion in Neuronen verwendet wird29,30. Die Auswirkungen der durch PPA hervorgerufenen mitochondrialen Dysfunktion auf die mitochondriale Morphologie und Dynamik sind jedoch noch unzureichend erforscht.
Diese Studie quantifiziert mithilfe komplementärer Bildgebungsverfahren die Auswirkungen von PPA auf die mitochondriale Morphologie, Dynamik und Funktion in SH-SY5Y-Zellen. Zunächst entwickelten wir eine TEM-Methode zur Visualisierung von Veränderungen der mitochondrialen Morphologie und Ultrastruktur^17,31,32. Aufgrund der dynamischen Natur der Mitochondrien³³ quantifizierten wir zudem mittels MEL-Analyse (Mitochondrial Event Localizer) Veränderungen im Gleichgewicht zwischen Fission und Fusion sowie in der Anzahl und dem Volumen der Mitochondrien unter PPA-Stress. Abschließend untersuchten wir, ob mitochondriale Morphologie und Dynamik mit Veränderungen in der Expression von Genen assoziiert sind, die an Biogenese, Fission und Fusion beteiligt sind. Zusammenfassend verdeutlichen unsere Daten die Herausforderung, die Komplexität der Mechanismen, die die mitochondriale Dynamik regulieren, aufzuklären. Wir heben den Nutzen der TEM für die Untersuchung der mitochondrialen Morphologie als messbaren, konvergenten Endpunkt der Mitose in SH-SY5Y-Zellen hervor. Zudem heben wir hervor, dass TEM-Daten die umfassendsten Informationen liefern, wenn sie mit bildgebenden Verfahren kombiniert werden, die auch dynamische Vorgänge als Reaktion auf metabolischen Stress erfassen. Die weitere Charakterisierung der molekularen Regulationsmechanismen, die die neuronale Zellmitose unterstützen, könnte wichtige Einblicke in die mitochondriale Komponente des Nervensystems und in neurodegenerative Erkrankungen ermöglichen.
Um mitochondrialen Stress zu induzieren, wurden SH-SY5Y-Zellen mit PPA unter Verwendung von 3 mM und 5 mM Natriumpropionat (NaP) behandelt. Vor der TEM-Analyse wurden die Proben mittels Hochdruckgefrieren kryogen präpariert (Abb. 1a). Wir entwickelten eine automatisierte Pipeline zur Bildanalyse von Mitochondrien, um acht morphologische Parameter von Mitochondrienpopulationen in drei biologischen Replikaten zu messen. Wir stellten fest, dass die PPA-Behandlung vier Parameter signifikant veränderte: Fläche², Fläche, Umfang und Feret-Durchmesser (Abb. 1b–e). Die Fläche² nahm sowohl bei 3 mM als auch bei 5 mM PPA signifikant ab (p = 0,0183 bzw. p = 0,002) (Abb. 1b), während Fläche (p = 0,003), Umfang (p = 0,0106) und Feret-Durchmesser ebenfalls signifikant abnahmen. In der 5 mM-Behandlungsgruppe zeigte sich im Vergleich zur Kontrollgruppe eine signifikante Reduktion (p = 0,0172) (Abb. 1c–e). Signifikante Reduktionen von Fläche und Umfang wiesen darauf hin, dass die mit 5 mM PPA behandelten Zellen kleinere, rundere Mitochondrien aufwiesen und diese weniger elongiert waren als die der Kontrollzellen. Dies korreliert mit einer signifikanten Abnahme des Feret-Durchmessers, einem unabhängigen Parameter, der die Verringerung des größten Abstands zwischen den Partikelrändern anzeigt. Es wurden Veränderungen in der Ultrastruktur der Cristae beobachtet: Unter dem Einfluss von PPA-Stress traten die Cristae weniger deutlich hervor (Abb. 1a, Panel B). Da jedoch nicht alle Bilder die Ultrastruktur der Cristae klar darstellten, wurde keine quantitative Analyse dieser Veränderungen durchgeführt. Diese TEM-Daten lassen drei mögliche Szenarien zu: (1) PPA verstärkt die Fission oder hemmt die Fusion, wodurch die vorhandenen Mitochondrien schrumpfen; (2) Eine verstärkte Biogenese führt zur Bildung neuer, kleinerer Mitochondrien oder (3) beide Mechanismen werden gleichzeitig induziert. Obwohl diese Zustände mittels TEM nicht unterschieden werden können, deuten signifikante morphologische Veränderungen auf Veränderungen der mitochondrialen Homöostase und Dynamik unter PPA-Stress hin. Anschließend untersuchten wir weitere Parameter, um diese Dynamiken und die zugrunde liegenden Mechanismen genauer zu charakterisieren.
Propionsäure (PPA) verändert die Mitochondrienmorphologie. (a) Repräsentative Transmissionselektronenmikroskopie-Aufnahmen (TEM) zeigen, dass die Mitochondriengröße mit zunehmender PPA-Konzentration abnimmt und die Mitochondrien kleiner und runder werden; 0 mM (unbehandelt), 3 mM bzw. 5 mM. Rote Pfeile markieren die Mitochondrien. (b–e) SH-SY5Y-Zellen wurden 24 h lang mit PPA behandelt und für die TEM-Analyse präpariert. Die Ergebnisse wurden mit Fiji/ImageJ analysiert. Vier der acht Parameter zeigten signifikante Unterschiede zwischen Kontrollzellen (unbehandelt, 0 mM PPA) und behandelten Zellen (3 mM und 5 mM PPA). (b) Region 2, (c) Fläche, (d) Umfang, (e) Feret-Durchmesser. Signifikante Unterschiede wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse (Kontrolle vs. Behandlung) und dem Dunnett-Test für Mehrfachvergleiche ermittelt (p < 0,05). Die Datenpunkte repräsentieren den durchschnittlichen Mitochondrienwert jeder einzelnen Zelle, die Fehlerbalken den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Die dargestellten Daten basieren auf n = 3, mindestens 24 Zellen pro Replikation; insgesamt wurden 266 Bilder analysiert; * kennzeichnet p < 0,05, ** kennzeichnet p < 0,01.
Um die Reaktion der Mitochondriendynamik auf PPA genauer zu charakterisieren, färbten wir Mitochondrien mit Tetramethylrhodaminethylester (TMRE) an und lokalisierten und quantifizierten sie nach 24 Stunden bei 3 und 5 mM PPA mittels Zeitraffer-Mikroskopie und MEL-Analyse. Die Behandlung von Fissions- und Fusionsereignissen ist in Abb. 2a dargestellt. Nach der MEL-Analyse wurden die Mitochondrien weiter analysiert, um die Anzahl der mitochondrialen Strukturen und ihr durchschnittliches Volumen zu quantifizieren. Wir beobachteten einen geringen, aber signifikanten Anstieg der Anzahl an Fissionsereignissen bei 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] im Vergleich zu Fissionsereignissen [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] und Fusionsereignissen [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] bei 5 mM im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 3b). Die Anzahl der Mitochondrien nahm sowohl bei 3 mM [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] als auch bei 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] signifikant zu (Abb. 3c), während das durchschnittliche Volumen der einzelnen Mitochondrienstrukturen unverändert blieb (Abb. 3c). 3d). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Umstrukturierung der mitochondrialen Dynamik als kompensatorische Reaktion dient, die die Integrität des mitochondrialen Netzwerks erfolgreich aufrechterhält. Die Zunahme der Fissionsereignisse bei 3 mM PPA legt nahe, dass die Zunahme der Mitochondrienzahl teilweise auf mitochondriale Fission zurückzuführen ist. Da das durchschnittliche Mitochondrienvolumen jedoch im Wesentlichen unverändert bleibt, kann die Biogenese als zusätzliche kompensatorische Reaktion nicht ausgeschlossen werden. Diese Daten stimmen jedoch mit den mittels TEM beobachteten kleineren, runden Mitochondrienstrukturen überein und belegen zudem signifikante, durch PPA induzierte Veränderungen der mitochondrialen Dynamik.
Propionsäure (PPA) induziert dynamische mitochondriale Umstrukturierungen zur Aufrechterhaltung der Netzwerkstruktur. SH-SY5Y-Zellen wurden kultiviert, 24 Stunden lang mit 3 und 5 mM PPA behandelt und anschließend mit TMRE und Hoechst 33342 gefärbt. Darauf folgte eine MEL-Analyse. (a) Repräsentative Zeitraffer-Mikroskopiebilder zeigen farbige und binäre Maximum-Intensitäts-Projektionen zum Zeitpunkt t2 für jede Bedingung. Ausgewählte Bereiche in jedem Binärbild sind vergrößert dargestellt und in 3D zu drei verschiedenen Zeitpunkten (t1–t3) visualisiert, um die zeitliche Dynamik zu veranschaulichen. Fusionsereignisse sind grün hervorgehoben. Fissionsereignisse sind rot dargestellt. (b) Durchschnittliche Anzahl dynamischer Ereignisse pro Bedingung. (c) Durchschnittliche Anzahl mitochondrialer Strukturen pro Zelle. (d) Durchschnittliches Volumen (µm³) jeder mitochondrialen Struktur pro Zelle. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für n = 15 Zellen pro Behandlungsgruppe. Die dargestellten Fehlerbalken repräsentieren den Mittelwert ± SEM, Maßstabsbalken = 10 μm, * p < 0,05.
Propionsäure (PPA) unterdrückt die Transkription von Genen, die mit der mitochondrialen Dynamik assoziiert sind. SH-SY5Y-Zellen wurden 24 h lang mit 3 und 5 mM PPA behandelt. Die relative Genquantifizierung erfolgte mittels RT-qPCR und wurde auf B2M normalisiert. Gene der mitochondrialen Biogenese: (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 und (d) NFE2L2. Gene der mitochondrialen Fusion und Fission: (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 und (i) DRP1. Signifikante Unterschiede (p < 0,05) wurden mittels einfaktorieller ANOVA (Kontrolle vs. Behandlung) und dem Dunnett-Test für Mehrfachvergleiche geprüft: * kennzeichnet p < 0,05, ** kennzeichnet p < 0,01 und **** kennzeichnet p < 0,0001. Die Balken stellen die mittlere Expression ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar. Die dargestellten Daten repräsentieren n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) und n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) biologische Replikate.
Daten aus TEM- und MEL-Analysen deuten darauf hin, dass PPA die Morphologie und Dynamik der Mitochondrien verändert. Diese bildgebenden Verfahren geben jedoch keinen Aufschluss über die zugrundeliegenden Mechanismen dieser Prozesse. Daher untersuchten wir die mRNA-Expression von neun Schlüsselregulatoren der mitochondrialen Dynamik, Biogenese und Mitose nach PPA-Behandlung. Wir quantifizierten das Zellmyelom-Onkogen (cMYC), den nukleären respiratorischen Faktor (NRF1), den mitochondrialen Transkriptionsfaktor 1 (TFAM), den NFE2-ähnlichen Transkriptionsfaktor BZIP (NFE2L2), das Gastrin-ähnliche Protein 2 (STOML2), das Optikusatrophie-Protein 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) und das Dynamin-verwandte Protein 1 (DRP1) nach 24-stündiger Behandlung mit 3 mM und 5 mM PPA. Wir beobachteten eine Behandlung mit 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 bzw. p < 0,0001) und 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233 bzw. p < 0,0001) PPA (Abb. 3a–c). Die Abnahme der mRNA-Expression war dosisabhängig: Die Expression von cMYC, NRF1 und TFAM sank bei 3 mM um das 5,7-, 2,6- bzw. 1,9-Fache und bei 5 mM um das 11,2-, 3- bzw. 2,2-Fache. Im Gegensatz dazu blieb das zentrale Redox-Biogenese-Gen NFE2L2 bei keiner PPA-Konzentration verändert, obwohl ein ähnlicher dosisabhängiger Trend der abnehmenden Expression beobachtet wurde (Abb. 3d).
Wir untersuchten auch die Expression klassischer Gene, die an der Regulation von Fission und Fusion beteiligt sind. STOML2 ist vermutlich an Fusion, Mitophagie und Biogenese beteiligt, und seine Expression war durch 3 mM (2,4-fache Änderung) und 5 mM (2,8-fache Änderung) PPA signifikant reduziert (p < 0,0001) (Abb. 1). 3d). Ebenso war die Expression des Fusionsgens OPA1 bei 3 mM (1,6-fache Änderung) und 5 mM (1,9-fache Änderung) PPA verringert (p = 0,006 bzw. p = 0,0024) (Abb. 3f). Wir fanden jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Expression der Fusionsgene MFN1 und MFN2 oder des Fissionsgens DRP1 unter 24-stündigem PPA-Stress (Abb. 3g–i). Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Konzentrationen von vier Fusions- und Fissionsproteinen (OPA1, MFN1, MFN2 und DRP1) unter denselben Bedingungen unverändert blieben (Abb. 4a–d). Es ist wichtig zu beachten, dass diese Daten eine Momentaufnahme darstellen und möglicherweise keine Veränderungen der Proteinexpression oder -aktivität in den frühen Stadien des PPA-Stress widerspiegeln. Signifikante Reduktionen der Expression von cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 und OPA1 deuten jedoch auf eine signifikante transkriptionelle Dysregulation des mitochondrialen Metabolismus, der Biogenese und der Dynamik hin. Zudem unterstreichen diese Daten den Nutzen von Bildgebungsverfahren zur direkten Untersuchung von Endzustandsveränderungen der mitochondrialen Funktion.
Die Proteinspiegel der Fusions- und Fissionsfaktoren blieben nach Behandlung mit Propionsäure (PPA) unverändert. SH-SY5Y-Zellen wurden 24 h lang mit 3 und 5 mM PPA behandelt. Die Proteinspiegel wurden mittels Western-Blot-Analyse quantifiziert und auf das Gesamtprotein normiert. Die durchschnittliche Proteinexpression sowie repräsentative Western-Blots der Zielproteine ​​und des Gesamtproteins sind dargestellt. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Die Balken zeigen den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Die dargestellten Daten sind repräsentativ für n = 3 biologische Replikate. Mehrfachvergleiche (p < 0,05) wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse und Dunnett-Test durchgeführt. Das Originalgel und der Western-Blot sind in Abbildung S1 dargestellt.
Mitochondriale Dysfunktion ist mit einer Vielzahl von Multisystemerkrankungen assoziiert, die von Stoffwechsel-, Herz-Kreislauf- und Muskelerkrankungen bis hin zu neurologischen Erkrankungen reichen^1,10. Viele neurodegenerative Erkrankungen gehen mit mitochondrialer Dysfunktion einher, was die Bedeutung dieser Organellen für das Gehirn während seiner gesamten Lebensspanne unterstreicht. Zu diesen Erkrankungen zählen Morbus Parkinson, Morbus Alzheimer und Autismus-Spektrum-Störungen (ASS)^3,4,18. Der Zugang zu Hirngewebe für die Erforschung dieser Erkrankungen ist jedoch schwierig, insbesondere auf mechanistischer Ebene, weshalb zelluläre Modellsysteme eine notwendige Alternative darstellen. In dieser Studie verwenden wir ein zelluläres Modellsystem mit PPA-behandelten SH-SY5Y-Zellen, um die bei neuronalen Erkrankungen, insbesondere Autismus-Spektrum-Störungen, beobachtete mitochondriale Dysfunktion nachzubilden. Die Anwendung dieses PPA-Modells zur Untersuchung der mitochondrialen Dynamik in Neuronen könnte Einblicke in die Ätiologie von ASS ermöglichen.
Wir untersuchten die Möglichkeit, Veränderungen der Mitochondrienmorphologie mittels TEM zu visualisieren. Wichtig ist die korrekte Anwendung der TEM, um ihre Effektivität zu maximieren. Die Präparation von Kryopräparaten ermöglicht eine bessere Erhaltung neuronaler Strukturen, indem zelluläre Komponenten fixiert und die Bildung von Artefakten reduziert werden³⁴. Dementsprechend beobachteten wir, dass neuronale SH-SY5Y-Zellen intakte subzelluläre Organellen und elongierte Mitochondrien aufwiesen (Abb. 1a). Dies unterstreicht den Nutzen kryogener Präparationstechniken für die Untersuchung der Mitochondrienmorphologie in neuronalen Zellmodellen. Obwohl quantitative Messungen für die objektive Analyse von TEM-Daten unerlässlich sind, besteht weiterhin kein Konsens darüber, welche spezifischen Parameter zur Bestätigung morphologischer Veränderungen der Mitochondrien gemessen werden sollten. Auf der Grundlage zahlreicher Studien, die die Morphologie der Mitochondrien quantitativ untersucht haben17,31,32, haben wir eine automatisierte Pipeline zur Analyse von Mitochondrienbildern entwickelt, die acht morphologische Parameter misst, nämlich: Fläche, Fläche², Aspektverhältnis, Umfang, Zirkularität, Grad, Feret-Durchmesser und Rundheit.
Unter anderem reduzierte PPA signifikant die Fläche², die Fläche, den Umfang und den Feret-Durchmesser (Abb. 1b–e). Dies deutet darauf hin, dass die Mitochondrien kleiner und runder wurden, was mit früheren Studien übereinstimmt, die eine Verringerung der Mitochondrienfläche nach 72 Stunden PPA30-induziertem mitochondrialem Stress zeigten. Diese morphologischen Merkmale könnten auf mitochondriale Fission hindeuten, einen notwendigen Prozess, um beschädigte Komponenten aus dem mitochondrialen Netzwerk zu entfernen und deren Abbau durch Mitophagie zu fördern35,36,37. Andererseits könnte die Verringerung der durchschnittlichen Mitochondriengröße mit einer erhöhten Biogenese zusammenhängen, die zur Bildung kleiner, neu entstehender Mitochondrien führt. Eine erhöhte Fission oder Biogenese stellt eine kompensatorische Reaktion dar, um die Mitose trotz mitochondrialem Stress aufrechtzuerhalten. Ein verringertes mitochondriales Wachstum, eine beeinträchtigte Fusion oder andere Faktoren können jedoch nicht ausgeschlossen werden.
Obwohl die hochauflösenden TEM-Bilder die Bestimmung morphologischer Merkmale einzelner Mitochondrien ermöglichen, liefert diese Methode zweidimensionale Momentaufnahmen. Um dynamische Reaktionen auf metabolischen Stress zu untersuchen, färbten wir Mitochondrien mit TMRE und nutzten Zeitraffer-Mikroskopie mit MEL-Analyse, die eine hochauflösende 3D-Visualisierung von Veränderungen im mitochondrialen Netzwerk über die Zeit ermöglicht^33,38. Wir beobachteten subtile, aber signifikante Veränderungen der mitochondrialen Dynamik unter PPA-Stress (Abb. 2). Bei 3 mM PPA stieg die Anzahl der Fissionsereignisse signifikant an, während die Fusionsereignisse im Vergleich zur Kontrolle unverändert blieben. Bei 5 mM PPA wurde ein Anstieg sowohl der Fissions- als auch der Fusionsereignisse beobachtet, wobei diese Veränderungen annähernd proportional waren. Dies deutet darauf hin, dass die Kinetik von Fission und Fusion bei höheren Konzentrationen ein Gleichgewicht erreicht (Abb. 2b). Das durchschnittliche mitochondriale Volumen blieb sowohl bei 3 als auch bei 5 mM PPA unverändert, was darauf hindeutet, dass die Integrität des mitochondrialen Netzwerks erhalten blieb (Abb. 2d). Dies spiegelt die Fähigkeit dynamischer mitochondrialer Netzwerke wider, auf leichten metabolischen Stress zu reagieren und die Homöostase effektiv aufrechtzuerhalten, ohne dass es zu einer Netzwerkfragmentierung kommt. Bei 3 mM PPA reicht die erhöhte Fission aus, um den Übergang zu einem neuen Gleichgewicht zu fördern; für Stress, der durch höhere PPA-Konzentrationen induziert wird, ist jedoch eine tiefgreifendere kinetische Umstrukturierung erforderlich.
Die Anzahl der Mitochondrien nahm bei beiden PPA-Stresskonzentrationen zu, das durchschnittliche Mitochondrienvolumen veränderte sich jedoch nicht signifikant (Abb. 2c). Dies könnte auf eine gesteigerte Biogenese oder Teilung zurückzuführen sein; da das mittlere Mitochondrienvolumen jedoch nicht signifikant abnahm, ist eine Steigerung der Biosynthese wahrscheinlicher. Die Daten in Abbildung 2 stützen die Existenz zweier kompensatorischer Mechanismen: eine Zunahme der Fissionsereignisse, was mit einer Hochregulierung der mitochondrialen Fission übereinstimmt, und eine Zunahme der Ereignisanzahl, was mit einer mitochondrialen Biogenese übereinstimmt. Letztendlich könnte die dynamische Kompensation von leichtem Stress aus simultanen Prozessen bestehen, die Fission, Fusion, Biogenese und Mitophagie umfassen. Obwohl frühere Studien gezeigt haben, dass PPA die Mitose^30,39 und die Mitophagie²⁹ verstärkt, liefern wir Hinweise auf eine Umstrukturierung der mitochondrialen Fissions- und Fusionsdynamik als Reaktion auf PPA. Diese Daten bestätigen die mittels TEM beobachteten morphologischen Veränderungen und liefern weitere Einblicke in die Mechanismen, die mit der durch PPA induzierten mitochondrialen Dysfunktion verbunden sind.
Da weder TEM- noch MEL-Analysen direkte Hinweise auf die den beobachteten morphologischen Veränderungen zugrunde liegenden Genregulationsmechanismen lieferten, untersuchten wir die RNA-Expression von Genen, die am mitochondrialen Stoffwechsel, der Biogenese und der Dynamik beteiligt sind. Das Protoonkogen cMYC ist ein Transkriptionsfaktor, der an der Regulation von Mitochondrien, Glykolyse sowie Aminosäure- und Fettsäurestoffwechsel beteiligt ist⁴⁰. Darüber hinaus ist bekannt, dass cMYC die Expression von fast 600 mitochondrialen Genen reguliert, die an der mitochondrialen Transkription, Translation und dem Aufbau mitochondrialer Komplexe beteiligt sind, darunter NRF1 und TFAM⁴¹. NRF1 und TFAM sind zwei zentrale Regulatoren der Mitose, die nachgeschaltet von PGC-1α wirken und die mtDNA-Replikation aktivieren. Dieser Signalweg wird durch cAMP- und AMPK-Signale aktiviert und reagiert empfindlich auf Energieverbrauch und metabolischen Stress. Wir untersuchten außerdem NFE2L2, einen Redoxregulator der mitochondrialen Biogenese, um festzustellen, ob die Effekte von PPA durch oxidativen Stress vermittelt werden könnten.
Obwohl die NFE2L2-Expression unverändert blieb, beobachteten wir nach 24-stündiger Behandlung mit 3 mM und 5 mM PPA eine konsistente, dosisabhängige Abnahme der Expression von cMYC, NRF1 und TFAM (Abb. 3a–c). Eine Herunterregulierung der cMYC-Expression wurde bereits als Reaktion auf mitochondrialen Stress beschrieben⁴². Umgekehrt kann eine Herunterregulierung der cMYC-Expression durch Umstrukturierung des mitochondrialen Metabolismus, der Netzwerkverbindungen und der Membranpolarisation zu mitochondrialen Dysfunktionen führen⁴³. Interessanterweise ist cMYC auch an der Regulation der mitochondrialen Fission und Fusion beteiligt^42,43 und erhöht bekanntermaßen die DRP1-Phosphorylierung und die mitochondriale Lokalisation während der Zellteilung⁴⁴. Zudem vermittelt es die morphologische Umstrukturierung der Mitochondrien in neuronalen Stammzellen⁴⁵. Tatsächlich weisen cMYC-defiziente Fibroblasten eine reduzierte Mitochondriengröße auf, was mit den durch PPA-Stress induzierten Veränderungen übereinstimmt⁴³. Diese Daten veranschaulichen einen interessanten, aber noch unklaren Zusammenhang zwischen cMYC und der mitochondrialen Dynamik und bieten damit ein interessantes Ziel für zukünftige Studien zur PPA-stressinduzierten Umstrukturierung.
Die Reduktion von NRF1 und TFAM steht im Einklang mit der Rolle von cMYC als wichtigem Transkriptionsaktivator. Diese Daten stimmen auch mit früheren Studien an menschlichen Darmkrebszellen überein, die zeigten, dass PPA die NRF1-mRNA-Expression nach 22 Stunden reduzierte, was mit einem ATP-Mangel und einem Anstieg von ROS46 einherging. Die Autoren berichteten zudem, dass die TFAM-Expression nach 8,5 Stunden anstieg, nach 22 Stunden aber wieder auf den Ausgangswert zurückkehrte. Im Gegensatz dazu zeigten Kim et al. (2019), dass die TFAM-mRNA-Expression nach 4 Stunden PPA-Stress in SH-SY5Y-Zellen signifikant abnahm; nach 72 Stunden war die TFAM-Protein-Expression jedoch signifikant erhöht, ebenso wie die mtDNA-Kopienzahl. Daher schließt die von uns nach 24 Stunden beobachtete Abnahme der Anzahl mitochondrialer Biogenese-Gene nicht aus, dass der Anstieg der Mitochondrienzahl mit einer Aktivierung der Biogenese zu früheren Zeitpunkten zusammenhängt. Frühere Studien haben gezeigt, dass PPA die PGC-1α-mRNA und das Protein in SH-SY5Y-Zellen nach 4 Stunden und 30 Minuten signifikant hochreguliert, während Propionsäure die mitochondriale Biogenese in Kälberhepatozyten über PGC-1α nach 12 Stunden und 39 Minuten verstärkt. Interessanterweise ist PGC-1α nicht nur ein direkter Transkriptionsregulator von NRF1 und TFAM, sondern reguliert auch die Aktivität von MFN2 und DRP1 durch die Steuerung von Fission und Fusion⁴⁷. Zusammengenommen verdeutlichen diese Ergebnisse die enge Verknüpfung der Mechanismen, die die durch PPA induzierten mitochondrialen Kompensationsreaktionen regulieren. Darüber hinaus zeigen unsere Daten eine signifikante Dysregulation der Transkriptionsregulation von Biogenese und Metabolismus unter PPA-Stress.
Die Gene STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 und DRP1 gehören zu den zentralen Regulatoren der mitochondrialen Fission, Fusion und Dynamik^37,48,49. Zahlreiche weitere Gene sind an der mitochondrialen Dynamik beteiligt. STOML2, OPA1 und MFN2 zeigten jedoch in früheren Studien eine differentielle Methylierung in Kohorten mit Autismus-Spektrum-Störung (ASS)¹⁶, und mehrere unabhängige Studien berichteten über Veränderungen dieser Transkriptionsfaktoren als Reaktion auf mitochondrialen Stress^50,51,52. Die Expression von OPA1 und STOML2 wurde durch die Behandlung mit 3 mM und 5 mM PPA signifikant reduziert (Abb. 3e, f). OPA1 ist einer der klassischen Regulatoren der mitochondrialen Fusion durch direkte Interaktion mit MFN1 und MFN2 und spielt eine Rolle bei der Cristae-Remodellierung und der mitochondrialen Morphologie⁵³. Die genaue Rolle von STOML2 in der mitochondrialen Dynamik ist noch unklar, aber es gibt Hinweise darauf, dass es eine Rolle bei der mitochondrialen Fusion, der Biogenese und der Mitophagie spielt.
STOML2 ist an der Aufrechterhaltung der mitochondrialen Atmungskopplung und der Bildung von Atmungskettenkomplexen beteiligt^54,55 und verändert nachweislich die metabolischen Eigenschaften von Krebszellen erheblich⁵⁶. Studien haben gezeigt, dass STOML2 das mitochondriale Membranpotenzial und die Biogenese durch Interaktion mit BAN und Cardiolipin fördert^55,57,58. Unabhängige Studien belegen zudem, dass die Interaktion zwischen STOML2 und PINK1 die Mitophagie reguliert^59,60. STOML2 interagiert direkt mit MFN2, stabilisiert dieses und spielt eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung langer OPA1-Isoformen durch Hemmung der für den OPA1-Abbau verantwortlichen Protease^53,61,62. Die in PPA-Reaktionen beobachtete Reduktion der STOML2-Expression könnte diese Fusionsproteine ​​anfälliger für den Abbau über Ubiquitin- und Proteasom-abhängige Wege machen⁴⁸. Obwohl die genaue Rolle von STOML2 und OPA1 in der dynamischen Reaktion auf PPA unklar ist, kann eine verminderte Expression dieser Fusionsgene (Abbildung 3) das Gleichgewicht zwischen Fission und Fusion stören und zu einer Verringerung der Mitochondriengröße führen (Abbildung 3). 1).
Andererseits blieb die OPA1-Protein-Expression nach 24 h unverändert, während sich die mRNA- und Proteinspiegel von MFN1, MFN2 und DRP1 nach PPA-Behandlung nicht signifikant veränderten (Abb. 3g–i, Abb. 4). Dies deutet darauf hin, dass die Regulation dieser an der mitochondrialen Fusion und Fission beteiligten Faktoren unverändert ist. Es ist jedoch anzumerken, dass jedes dieser vier Gene auch durch posttranskriptionelle Modifikationen (PTMs) reguliert wird, welche die Proteinaktivität steuern. OPA1 besitzt acht alternative Spleißvarianten, die in den Mitochondrien proteolytisch gespalten werden und zwei unterschiedliche Isoformen erzeugen⁶³. Das Verhältnis zwischen langen und kurzen Isoformen bestimmt letztendlich die Rolle von OPA1 bei der mitochondrialen Fusion und der Aufrechterhaltung des mitochondrialen Netzwerks⁶⁴. Die Aktivität von DRP1 wird durch Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII)-Phosphorylierung reguliert, während der Abbau von DRP1 durch Ubiquitinierung und SUMOylierung reguliert wird⁶⁵. Da sowohl DRP1 als auch MFN1/2 GTPasen sind, kann ihre Aktivität durch die GTP-Produktionsrate in den Mitochondrien beeinflusst werden⁶⁶. Obwohl die Expression dieser Proteine ​​konstant bleibt, spiegelt dies daher möglicherweise keine unveränderte Proteinaktivität oder -lokalisation wider^67,68. Tatsächlich dienen bestehende PTM-Proteinrepertoires häufig als erste Verteidigungslinie und sind für die Vermittlung akuter Stressreaktionen verantwortlich. Unter moderatem metabolischem Stress in unserem Modell ist es wahrscheinlich, dass PTM die Aktivität von Fusions- und Fissionsproteinen erhöht, um die mitochondriale Integrität ausreichend wiederherzustellen, ohne dass eine zusätzliche Aktivierung dieser Gene auf mRNA- oder Proteinebene erforderlich ist.
Zusammengenommen verdeutlichen die obigen Daten die komplexe und zeitabhängige Regulation der mitochondrialen Morphologie sowie die Herausforderungen bei der Aufklärung dieser Mechanismen. Für die Untersuchung der Genexpression ist es zunächst notwendig, spezifische Zielgene im jeweiligen Signalweg zu identifizieren. Unsere Daten zeigen jedoch, dass Gene desselben Signalwegs nicht gleich auf denselben Stress reagieren. Tatsächlich haben frühere Studien gezeigt, dass verschiedene Gene desselben Signalwegs unterschiedliche zeitliche Reaktionsprofile aufweisen können^30,46. Darüber hinaus existieren komplexe posttranskriptionelle Mechanismen, die die Beziehung zwischen Transkription und Genfunktion stören. Proteomstudien können Einblicke in die Auswirkungen von PTMs auf die Proteinfunktion liefern, stellen aber auch Herausforderungen dar, darunter Methoden mit geringem Durchsatz, hohe Signal-Rausch-Verhältnisse und geringe Auflösung.
In diesem Kontext birgt die Untersuchung der mitochondrialen Morphologie mittels TEM und MEL großes Potenzial zur Beantwortung grundlegender Fragen zum Zusammenhang zwischen mitochondrialer Dynamik und Funktion sowie deren Einfluss auf Krankheiten. Besonders wichtig ist, dass TEM eine direkte Methode zur Messung der mitochondrialen Morphologie als konvergenten Endpunkt mitochondrialer Dysfunktion und Dynamik bietet⁵¹. MEL ermöglicht zudem die direkte Visualisierung von Fissions- und Fusionsereignissen in einer dreidimensionalen zellulären Umgebung und damit die Quantifizierung dynamischer mitochondrialer Umstrukturierungen selbst bei fehlenden Veränderungen der Genexpression³³. Wir heben hier den Nutzen mitochondrialer Bildgebungsverfahren bei sekundären mitochondrialen Erkrankungen hervor. Diese Erkrankungen sind typischerweise durch chronischen, milden metabolischen Stress gekennzeichnet, der sich durch subtile Umstrukturierungen mitochondrialer Netzwerke und nicht durch akute mitochondriale Schäden äußert. Die zur Aufrechterhaltung der Mitose unter chronischem Stress notwendige mitochondriale Kompensation hat jedoch tiefgreifende funktionelle Konsequenzen. Im Kontext der Neurowissenschaften könnte ein besseres Verständnis dieser Kompensationsmechanismen wichtige Informationen über die pleiotrope Neuropathologie liefern, die mit mitochondrialer Dysfunktion einhergeht.
Unsere Daten unterstreichen letztlich den Nutzen von Bildgebungsverfahren für das Verständnis der funktionellen Konsequenzen der komplexen Wechselwirkungen zwischen Genexpression, Proteinmodifikationen und Proteinaktivität, die die mitochondriale Dynamik neuronaler Zellen steuern. Wir nutzten PPA, um mitochondriale Dysfunktion in einem neuronalen Zellmodell zu modellieren und so Einblicke in die mitochondriale Komponente von Autismus-Spektrum-Störungen (ASS) zu gewinnen. SH-SY5Y-Zellen, die mit PPA behandelt wurden, zeigten Veränderungen der mitochondrialen Morphologie: Die Mitochondrien wurden klein und rund, und die Cristae waren im Transmissionselektronenmikroskop (TEM) nur noch schlecht definiert. Die MEL-Analyse zeigt, dass diese Veränderungen mit einer Zunahme von Fissions- und Fusionsereignissen einhergehen, um das mitochondriale Netzwerk als Reaktion auf leichten metabolischen Stress aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus stört PPA die transkriptionelle Regulation des mitochondrialen Stoffwechsels und der Homöostase signifikant. Wir identifizierten cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 und OPA1 als wichtige mitochondriale Regulatoren, deren Funktion durch PPA-Stress beeinträchtigt wird und die möglicherweise an der Vermittlung PPA-induzierter Veränderungen der mitochondrialen Morphologie und Funktion beteiligt sind. Zukünftige Studien sind erforderlich, um die PPA-induzierten zeitlichen Veränderungen der Genexpression und Proteinaktivität, der Lokalisation und der posttranslationalen Modifikationen genauer zu charakterisieren. Unsere Daten verdeutlichen die Komplexität und Interdependenz der regulatorischen Mechanismen, die die mitochondriale Stressantwort vermitteln, und demonstrieren den Nutzen von TEM und anderen bildgebenden Verfahren für gezieltere mechanistische Studien.
Die SH-SY5Y-Zelllinie (ECACC, 94030304-1VL) wurde von Sigma-Aldrich bezogen. SH-SY5Y-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium/F-12-Nährstoffmischung (DMEM/F-12) und L-Glutamin (SC09411, ScienCell) in 25 cm²-Kulturflaschen mit 20 % fötalem Kälberserum (FBS) (10493106, Thermo Fisher Scientific) und 1 % Penicillin-Streptomycin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) bei 37 °C und 5 % CO₂ kultiviert. Die Zellen wurden mit 0,05 % Trypsin-EDTA (15400054, Thermo Fisher Scientific) bis zu einer Konfluenz von 80 % subkultiviert, bei 300 g zentrifugiert und mit einer Dichte von ca. 7 × 10⁵ Zellen/ml ausgesät. Alle Experimente wurden mit undifferenzierten SH-SY5Y-Zellen der Passagen 19–22 durchgeführt. PPA wird als NaP verabreicht. NaP-Pulver (CAS-Nr. 137-40-6, Summenformel C₃H₅NaO₂, P5436-100G, Sigma-Aldrich) wird in warmem MilliQ-Wasser zu einer Konzentration von 1 M gelöst und bei 4 °C gelagert. Am Behandlungstag wird diese Lösung mit 1 M PPA auf 3 mM bzw. 5 mM PPA in serumfreiem Medium (DMEM/F-12 mit L-Glutamin) verdünnt. Die Behandlungskonzentrationen für alle Experimente betrugen kein PPA (0 mM, Kontrolle), 3 mM und 5 mM PPA. Die Experimente wurden in mindestens drei biologischen Replikaten durchgeführt.
SH-SY5Y-Zellen wurden in 25-cm³-Kulturflaschen mit einer Dichte von 5,5 × 10⁵ Zellen/ml ausgesät und 24 Stunden lang kultiviert. Die PPA-Behandlung wurde vor Ablauf der 24-stündigen Inkubation zugegeben. Die Zellpellets wurden gemäß den üblichen Subkulturprotokollen für Säugetiergewebe (siehe oben) gewonnen. Das Zellpellet wurde in 100 µl 2,5% Glutaraldehyd, 1× PBS resuspendiert und bis zur Weiterverarbeitung bei 4 °C gelagert. Die SH-SY5Y-Zellen wurden kurz zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren und die 2,5% Glutaraldehyd, 1× PBS-Lösung zu entfernen. Das Sediment wurde in einem 4%igen Agarosegel, hergestellt in destilliertem Wasser (Volumenverhältnis Agarose zu Sediment 1:1), resuspendiert. Die Agarosestücke wurden auf Gitter auf flachen Platten platziert und vor dem Hochdruckgefrieren mit 1-Hexadecen beschichtet. Die Proben wurden 24 Stunden lang in 100 % trockenem Aceton bei -90 °C eingefroren. Anschließend wurde die Temperatur auf -80 °C erhöht und eine Lösung aus 1 % Osmiumtetroxid und 0,1 % Glutaraldehyd zugegeben. Die Proben wurden weitere 24 Stunden bei -80 °C gelagert. Danach wurde die Temperatur über mehrere Tage schrittweise auf Raumtemperatur erhöht: von -80 °C auf -50 °C (24 Stunden), auf -30 °C (24 Stunden), auf -10 °C (24 Stunden) und schließlich auf Raumtemperatur.
Nach der kryogenen Präparation wurden die Proben mit Harz imprägniert und mit einem Leica Reichert UltracutS Ultramikrotom (Leica Microsystems) in ultradünne Schnitte (ca. 100 nm) zerlegt. Die Schnitte wurden mit 2% Uranylacetat und Bleicitrat kontrastiert. Die Untersuchungen erfolgten mit einem FEI Tecnai 20 Transmissionselektronenmikroskop (ThermoFisher (ehemals FEI), Eindhoven, Niederlande) bei 200 kV (Lab6-Sender) und einer Gatan CCD-Kamera (Gatan, Großbritannien) mit Tridiem-Energiefilter.
In jeder technischen Replikation wurden mindestens 24 Einzelzellbilder aufgenommen, insgesamt also 266 Bilder. Alle Bilder wurden mithilfe des ROI-Makros (Region of Interest) und des Mitochondrien-Makros analysiert. Das Mitochondrien-Makro basiert auf publizierten Methoden^17,31,32 und ermöglicht die halbautomatische Stapelverarbeitung von TEM-Bildern in Fiji/ImageJ⁶⁹. Kurz gesagt: Das Bild wird invertiert und anschließend mit einer Rolling-Ball-Hintergrundsubtraktion (Radius 60 Pixel) und einem FFT-Bandpassfilter (mit oberen und unteren Grenzen von 60 bzw. 8 Pixeln) sowie einer vertikalen Linienunterdrückung mit einer Orientierungstoleranz von 5 % gefiltert. Das verarbeitete Bild wird automatisch mittels eines Maximum-Entropie-Algorithmus schwellwertbasiert segmentiert und eine Binärmaske generiert. Bildbereiche, die manuell ausgewählten ROIs in den Roh-TEM-Bildern zugeordnet sind, wurden extrahiert, um Mitochondrien zu charakterisieren und die Plasmamembran sowie andere kontrastreiche Bereiche auszuschließen. Für jede extrahierte ROI wurden binäre Partikel mit einer Größe von über 600 Pixeln analysiert. Partikelfläche, Umfang, Haupt- und Nebenachse, Feret-Durchmesser, Rundheit und Zirkularität wurden mithilfe der integrierten Messfunktionen von Fiji/ImageJ bestimmt. In Anlehnung an Merrill, Flippo und Strack (2017) wurden Fläche², das Partikel-Seitenverhältnis (Verhältnis von Haupt- zu Nebenachse) und der Formfaktor (FF) aus diesen Daten berechnet, wobei FF = Umfang²/4π × Fläche. Die Definition der parametrischen Formel findet sich in Merrill, Flippo und Strack (2017). Die erwähnten Makros sind auf GitHub verfügbar (siehe Datenverfügbarkeitserklärung). Im Durchschnitt wurden pro PPA-Behandlung ca. 5.600 Partikel analysiert, insgesamt also ca. 17.000 Partikel (Daten nicht dargestellt).
SH-SH5Y-Zellen wurden in 8-Kammer-Kulturschalen (ThermoFisher, Nr. 155411) über Nacht zur Adhäsion gegeben und anschließend mit TMRE 1:1000 (ThermoFisher, Nr. T669) und Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) inkubiert. Die Bildgebung erfolgte mit 405-nm- und 561-nm-Lasern über einen Zeitraum von 10 Minuten. Die Rohbilder wurden als Z-Stapel mit jeweils 10 Einzelbildern und einem Az-Schritt von 0,2 μm zwischen den Bildern zu 12 aufeinanderfolgenden Zeitpunkten aufgenommen. Die Bildaufnahme erfolgte mit einem Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 Superresolutionsmikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland) und einem LCI Planapochromate 100x/1,4 Öl-DIC-Objektiv M27. Die Bilder wurden mit ImageJ unter Verwendung einer zuvor beschriebenen Pipeline und des ImageJ-Plugins analysiert, um Fusions- und Fissionsereignisse, die durchschnittliche Anzahl mitochondrialer Strukturen und das durchschnittliche mitochondriale Volumen pro Zelle zu messen.33 MEL-Makros sind auf GitHub verfügbar (siehe Datenverfügbarkeitserklärung).
SH-SY5Y-Zellen wurden in 6-Well-Platten mit einer Zelldichte von 0,3 × 10⁶ Zellen/ml für 24 Stunden vor der Behandlung kultiviert. Die RNA-Extraktion erfolgte nach dem Quick-RNA™ Miniprep-Protokoll (ZR R1055, Zymo Research) mit leichten Modifikationen: Vor der Entnahme wurden 300 μl RNA-Lysepuffer zu jedem Well gegeben und die Proben abschließend mit 30 μl DNase/RNase-freiem Elutionsmittel lysiert. Alle Proben wurden mittels NanoDrop ND-1000 UV-Vis-Spektrophotometer auf Quantität und Qualität geprüft. Das Gesamtprotein der Zelllysate wurde mit 200 μl RIPA-Lysepuffer extrahiert und die Proteinkonzentration mittels Bradford-Proteinassay bestimmt.
Die cDNA-Synthese erfolgte mit dem Tetro™ cDNA-Synthese-Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) gemäß den Herstellerangaben mit einigen Modifikationen. Die cDNA-Synthese wurde in 20-µl-Reaktionen mit 0,7 bis 1 µg Gesamt-RNA durchgeführt. Die Primer wurden aus zuvor veröffentlichten Arbeiten^{42, 71–78} (Tabelle S1) ausgewählt, und die zugehörigen Sonden wurden mit dem PrimerQuest-Tool von Integrated DNA Technologies entworfen. Alle Zielgene wurden auf das nukleäre B2M-Gen normalisiert. Die Genexpression von STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC und OPA1 wurde mittels RT-qPCR gemessen. Die Mastermix-Lösung enthielt LUNA Taq-Polymerase (M3003L, New England Biolabs), 10 μM Vorwärts- und Rückwärtsprimer, cDNA und PCR-Wasser, sodass sich ein Endvolumen von 10 μL pro Reaktion ergab. Die Expression von Teilungs- und Fissionsgenen (DRP1, MFN1/2) wurde mittels TaqMan-Multiplex-Assays gemessen. Die Luna Universal Probe qPCR Mastermix-Lösung (M3004S, New England Biolabs) wurde gemäß den Herstellerangaben mit geringfügigen Modifikationen verwendet. Die Multiplex-RT-qPCR-Mastermix-Lösung enthielt 1× LUNA Taq-Polymerase, 10 μM Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 10 μM Sonde, cDNA und PCR-Wasser, was zu einem Endvolumen von 20 μL pro Reaktion führte. Die RT-qPCR wurde mit dem Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG – Seriennummer: R0618110) durchgeführt. Die PCR-Bedingungen sind in Tabelle S1 dargestellt. Alle cDNA-Proben wurden in Dreifachbestimmung amplifiziert und eine Standardkurve anhand einer zehnfachen Verdünnungsreihe erstellt. Ausreißer in den Dreifachbestimmungen mit einer Standardabweichung des Schwellenwerts (Ct) > 0,5 wurden von der Analyse ausgeschlossen, um die Reproduzierbarkeit der Daten zu gewährleisten^30,72. Die relative Genexpression wurde mit der 2^-ΔΔCt-Methode berechnet⁷⁹.
Proteinproben (60 μg) wurden im Verhältnis 2:1 mit Laemmli-Probenpuffer gemischt und auf einem 12%igen farblosen Proteingel (Bio-Rad #1610184) aufgetrennt. Die Proteine ​​wurden mithilfe des Trans-Blot Turbo Systems (#170-4155, Bio-Rad) auf eine PVDF-Membran (Polyvinylidenfluorid, #170-84156, Bio-Rad) transferiert. Die Membran wurde blockiert und 48 Stunden lang mit den entsprechenden primären Antikörpern (OPA1, MFN1, MFN2 und DRP1) (1:1000 verdünnt) inkubiert, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit sekundären Antikörpern (1:10.000). Die Membranen wurden anschließend mit Clarity Western ECL Substrat (#170-5061, Bio-Rad) visualisiert und mit einem Bio-Rad ChemiDoc MP System dokumentiert. Die Western-Blot-Analyse erfolgte mit ImageLab Version 6.1. Das Originalgel und der Blot sind in Abbildung S1 dargestellt. Informationen zu den Antikörpern finden sich in Tabelle S2.
Die Datensätze werden als Mittelwert und Standardfehler des Mittelwerts (SEM) von mindestens drei unabhängigen Stichproben dargestellt. Die Daten wurden (sofern nicht anders angegeben) vor der Analyse mittels Shapiro-Wilk-Test auf Normalverteilung geprüft. Dabei wurde von einer Gaußverteilung und gleichen Standardabweichungen ausgegangen. Zusätzlich wurden die Datensätze mit dem Fisher-MEL-LSD-Test (p < 0,05), einer einfaktoriellen ANOVA (Mittelwert der Behandlungsgruppe vs. Kontrollgruppe) und dem Dunnett-Test für Mehrfachvergleiche analysiert, um die Signifikanz zu bestimmen (p < 0,05). Signifikante p-Werte sind in der Grafik wie folgt gekennzeichnet: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Alle statistischen Analysen und Grafiken wurden mit GraphPad Prism 9.4.0 erstellt.
Fiji/ImageJ-Makros zur TEM-Bildanalyse sind öffentlich auf GitHub verfügbar: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Das Makro zur Lokalisierung mitochondrialer Ereignisse (MEL) ist ebenfalls öffentlich auf GitHub verfügbar: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM und Vijaya A. Mitochondrien: zentrale Regulatoren von Stoffwechsel, Homöostase, Stress, Alterung und Epigenetik. Indonesian. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Vielschichtige mitochondriale Dysfunktion bei Schizophrenie, Komplex I als mögliches pathologisches Ziel. Schizophrenia. resource. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. und Beal, MF Mitochondriale Dysfunktion bei Morbus Parkinson. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG und Mehta V. Gestresste Mitochondrien: Ziele der Invasion bei der Alzheimer-Krankheit. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF und Ferreira GK Mitochondrien und das Gehirn: Bioenergetik und mehr. Neurotoxins. resource. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Pleiotrope Mitochondrien: Der Einfluss von Mitochondrien auf die neuronale Entwicklung und Erkrankung. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. und Morais, VA Mitochondriale Biogenese in Neuronen: Wie und wo? Internationality. J. Mohr. the science. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. und Zhao, J. Regulation der mitochondrialen Dynamik von Säugetieren: Möglichkeiten und Herausforderungen. front. endocrine. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. und Slack, RS Mitochondriale Dynamik in der Regulation der Neurogenese: vom sich entwickelnden zum erwachsenen Gehirn. Entwicklung. Dynamik. 247, 47–53 (2018).