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Hochbeladene Insulin-Nanopartikel (NPs) finden vielfältige Anwendung in verschiedenen Darreichungsformen. Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung des Einflusses von Gefriertrocknung und Sprühtrocknung auf die Struktur insulinbeladener Chitosan-Nanopartikel, mit und ohne Mannitol als Kryoprotektivum. Die Qualität der Nanopartikel wurde durch Wiederauflösen überprüft. Vor der Dehydratisierung wurde die Partikelgröße der vernetzten Chitosan/Natriumtripolyphosphat/Insulin-Nanopartikel auf 318 nm optimiert. Der Polydispersitätsindex (PDI) betrug 0,18, die Verkapselungseffizienz 99,4 % und die Beladung 25,01 %. Nach der Rekonstitution behielten alle Nanopartikel, mit Ausnahme derjenigen, die durch Gefriertrocknung ohne Mannitol hergestellt wurden, ihre sphärische Partikelstruktur. Im Vergleich zu den mannitolhaltigen, sprühgetrockneten Nanopartikeln wiesen die mannitolfreien, sprühgetrockneten Nanopartikel die kleinste mittlere Partikelgröße auf. (376 nm) und der höchste Beladungsgehalt (25,02 %) bei ähnlicher Verkapselungsrate (98,7 %) und ähnlichem PDI (0,20) wurden durch Trocknung oder Gefriertrocknung erzielt. Die mittels Sprühtrocknung ohne Mannitol getrockneten Nanopartikel führten zudem zur schnellsten Insulinfreisetzung und zur höchsten Effizienz der zellulären Aufnahme. Diese Arbeit zeigt, dass die Sprühtrocknung Insulin-Nanopartikel im Vergleich zu herkömmlichen Gefriertrocknungsverfahren ohne Kryoprotektiva dehydrieren kann, was eine höhere Beladungskapazität, einen geringeren Bedarf an Additiven und niedrigere Betriebskosten zur Folge hat.
Seit seiner Entdeckung im Jahr 1922^1,2,3 haben Insulin und seine Arzneimittelpräparate das Leben von Patienten mit Typ-1-Diabetes (T1DM) und Typ-2-Diabetes (T2DM) gerettet. Aufgrund seiner Eigenschaften als hochmolekulares Protein aggregiert Insulin jedoch leicht, wird durch proteolytische Enzyme abgebaut und durch den First-Pass-Effekt eliminiert. Menschen mit Typ-1-Diabetes benötigen lebenslang Insulininjektionen. Auch viele Patienten mit Typ-2-Diabetes benötigen langfristig Insulin. Die täglichen Insulininjektionen sind für diese Menschen eine erhebliche Belastung und verursachen starke Schmerzen und Beschwerden, die sich negativ auf ihre psychische Gesundheit auswirken. Daher werden andere, weniger belastende Formen der Insulinverabreichung, wie beispielsweise die orale Insulintherapie, intensiv erforscht⁵, da sie das Potenzial haben, die Lebensqualität von weltweit etwa 5 Milliarden Menschen mit Diabetes zu verbessern.
Die Nanopartikeltechnologie hat einen bedeutenden Fortschritt bei der oralen Insulinverabreichung ermöglicht^4,6,7. Sie verkapselt Insulin effektiv und schützt es vor Abbau, um es gezielt an bestimmte Körperstellen abzugeben. Die Verwendung von Nanopartikelformulierungen ist jedoch mit einigen Einschränkungen verbunden, hauptsächlich aufgrund von Stabilitätsproblemen der Partikelsuspensionen. Während der Lagerung kann es zu Aggregationen kommen, wodurch die Bioverfügbarkeit der insulinbeladenen Nanopartikel reduziert wird⁸. Darüber hinaus muss die chemische Stabilität der Polymermatrix der Nanopartikel und des Insulins berücksichtigt werden, um die Stabilität der Insulin-Nanopartikel (NPs) zu gewährleisten. Derzeit gilt die Gefriertrocknung als Goldstandard für die Herstellung stabiler NPs und die Vermeidung unerwünschter Veränderungen während der Lagerung⁹.
Die Gefriertrocknung erfordert jedoch die Zugabe von Kryoprotektiva, um zu verhindern, dass die sphärische Struktur der Nanopartikel durch die mechanische Spannung der Eiskristalle beeinträchtigt wird. Dies reduziert die Beladung mit Insulin-Nanopartikeln nach der Lyophilisierung erheblich, da das Kryoprotektivum den größten Gewichtsanteil ausmacht. Daher sind die hergestellten Insulin-Nanopartikel aufgrund des Bedarfs an großen Mengen trockener Nanopartikel zur Erreichung des therapeutischen Fensters von Insulin häufig ungeeignet für die Herstellung von Trockenpulverformulierungen wie Tabletten und Filmen zur oralen Einnahme.
Die Sprühtrocknung ist ein bekanntes und kostengünstiges Verfahren zur Herstellung von Trockenpulvern aus flüssigen Phasen in der pharmazeutischen Industrie^10,11. Die Kontrolle über die Partikelbildung ermöglicht die gezielte Verkapselung verschiedener bioaktiver Verbindungen^12,13. Darüber hinaus hat sie sich als effektive Technik zur Herstellung verkapselter Proteine ​​für die orale Verabreichung etabliert. Während der Sprühtrocknung verdunstet das Wasser sehr schnell, wodurch die Temperatur im Partikelkern niedrig gehalten wird^11,14. Dies ermöglicht die Anwendung des Verfahrens zur Verkapselung wärmeempfindlicher Komponenten. Vor der Sprühtrocknung muss das Beschichtungsmaterial gründlich mit der Lösung, die die zu verkapselnden Inhaltsstoffe enthält, homogenisiert werden^11,14. Im Gegensatz zur Gefriertrocknung verbessert die Homogenisierung vor der Verkapselung bei der Sprühtrocknung die Verkapselungseffizienz während der Dehydratisierung. Da die Sprühtrocknung keine Kryoprotektiva benötigt, eignet sie sich zur Herstellung von getrockneten Nanopartikeln mit hoher Wirkstoffbeladung.
Diese Studie beschreibt die Herstellung von insulinbeladenen Nanopartikeln (NPs) durch Vernetzung von Chitosan und Natriumtripolyphosphat mittels Ionengelierung. Die Ionengelierung ist ein Herstellungsverfahren, das die Produktion von Nanopartikeln durch elektrostatische Wechselwirkungen zwischen zwei oder mehr ionischen Spezies unter bestimmten Bedingungen ermöglicht. Die optimierten, vernetzten Chitosan/Natriumtripolyphosphat/Insulin-Nanopartikel wurden mittels Gefriertrocknung und Sprühtrocknung dehydriert. Nach der Dehydratisierung wurde ihre Morphologie mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) analysiert. Ihre Rekombinationsfähigkeit wurde durch Messung der Größenverteilung, Oberflächenladung, des Polydispersitätsindex (PDI), der Verkapselungseffizienz und des Beladungsgehalts bewertet. Die Qualität der mittels verschiedener Dehydratisierungsmethoden resolubilisierten Nanopartikel wurde durch Vergleich ihres Insulinschutzes, ihres Freisetzungsverhaltens und ihrer zellulären Aufnahmeeffizienz evaluiert.
Der pH-Wert der Mischlösung und das Verhältnis von Chitosan zu Insulin sind zwei Schlüsselfaktoren, die die Partikelgröße und die Verkapselungseffizienz (EE) der resultierenden Nanopartikel beeinflussen, da sie den ionotropen Gelierungsprozess direkt beeinflussen. Der pH-Wert der Mischlösung korreliert stark mit der Partikelgröße und der Verkapselungseffizienz (Abb. 1a). Wie in Abb. 1a dargestellt, nahm die durchschnittliche Partikelgröße (nm) mit steigendem pH-Wert von 4,0 auf 6,0 ab, während die EE signifikant zunahm. Bei einem pH-Wert von 6,5 begann die durchschnittliche Partikelgröße wieder zuzunehmen, die EE blieb jedoch unverändert. Mit steigendem Verhältnis von Chitosan zu Insulin nimmt auch die durchschnittliche Partikelgröße zu. Des Weiteren wurde keine Änderung der EE beobachtet, wenn die Nanopartikel mit einem Massenverhältnis von Chitosan zu Insulin von über 2,5:1 (w/w) hergestellt wurden (Abb. 1b). Daher sind die optimalen Herstellungsbedingungen in dieser Studie (pH 6,0, Massenverhältnis Chitosan zu Insulin von …) … Zur Herstellung von Insulin-beladenen Nanopartikeln für weitere Untersuchungen wurde ein Mischungsverhältnis von 2,5:1 verwendet. Unter diesen Herstellungsbedingungen wurde die durchschnittliche Partikelgröße der Insulin-Nanopartikel auf 318 nm optimiert (Abb. 1c). Der Polydispersitätsindex (PDI) betrug 0,18, die Einbettungseffizienz 99,4 %, das Zeta-Potential 9,8 mV und die Insulinbeladung 25,01 % (m/m). Transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Aufnahmen zeigten, dass die optimierten Nanopartikel annähernd kugelförmig und diskret mit relativ einheitlicher Größe waren (Abb. 1d).
Parameteroptimierung von Insulin-Nanopartikeln: (a) Einfluss des pH-Werts auf den mittleren Durchmesser und die Verkapselungseffizienz (EE) von Insulin-Nanopartikeln (hergestellt im Massenverhältnis 5:1 von Chitosan und Insulin); (b) Einfluss des Massenverhältnisses von Chitosan und Insulin auf den mittleren Durchmesser und die Verkapselungseffizienz (EE) von Insulin-NPs (hergestellt bei pH 6); (c) Partikelgrößenverteilung optimierter Insulin-Nanopartikel; (d) TEM-Mikrographie optimierter Insulin-NPs.
Es ist bekannt, dass Chitosan ein schwaches Polyelektrolyt mit einem pKa-Wert von 6,5 ist. In saurem Milieu ist es positiv geladen, da seine Hauptaminogruppe durch Wasserstoffionen protoniert wird¹⁵. Daher wird es häufig als Träger zur Verkapselung negativ geladener Makromoleküle verwendet. In dieser Studie wurde Chitosan zur Verkapselung von Insulin mit einem isoelektrischen Punkt von 5,3 eingesetzt. Da Chitosan als Beschichtungsmaterial dient, nimmt mit steigendem Anteil die Dicke der äußeren Schicht der Nanopartikel entsprechend zu, was zu einer größeren durchschnittlichen Partikelgröße führt. Zudem kann mit höheren Chitosan-Konzentrationen mehr Insulin verkapselt werden. In unserem Fall war die Verkapselungseffizienz (EE) am höchsten, als das Verhältnis von Chitosan zu Insulin 2,5:1 erreichte. Eine weitere Erhöhung des Verhältnisses führte zu keiner signifikanten Änderung der EE.
Neben dem Verhältnis von Chitosan und Insulin spielte auch der pH-Wert eine entscheidende Rolle bei der Herstellung der Nanopartikel. Gan et al.¹⁷ untersuchten den Einfluss des pH-Werts auf die Partikelgröße von Chitosan-Nanopartikeln. Sie stellten eine kontinuierliche Abnahme der Partikelgröße bis zu einem pH-Wert von 6,0 fest und beobachteten bei pH-Werten > 6,0 einen signifikanten Anstieg, was mit unseren Beobachtungen übereinstimmt. Dieses Phänomen ist darauf zurückzuführen, dass das Insulinmolekül mit steigendem pH-Wert eine negative Oberflächenladung annimmt. Dies begünstigt elektrostatische Wechselwirkungen mit dem Chitosan/Natriumtripolyphosphat (TPP)-Komplex, was zu einer kleinen Partikelgröße und einer hohen Verkapselungseffizienz (EE) führt. Bei einem pH-Wert von 6,5 wurden die Aminogruppen des Chitosans jedoch deprotoniert, was zu einer Faltung des Chitosans führte. Ein hoher pH-Wert bewirkt somit eine geringere Exposition der Aminoionen gegenüber TPP und Insulin, was eine geringere Vernetzung, eine größere durchschnittliche Endpartikelgröße und eine niedrigere EE zur Folge hat.
Die Analyse der morphologischen Eigenschaften gefriergetrockneter und sprühgetrockneter Nanopartikel (NPs) kann die Auswahl geeigneterer Dehydratisierungs- und Pulverbildungsverfahren erleichtern. Das bevorzugte Verfahren sollte Wirkstoffstabilität, einheitliche Partikelform, hohe Wirkstoffbeladung und gute Löslichkeit in der Ausgangslösung gewährleisten. In dieser Studie wurden Insulin-NPs mit und ohne 1 % Mannitol während der Dehydratisierung verwendet, um die beiden Verfahren besser vergleichen zu können. Mannitol dient in verschiedenen Trockenpulverformulierungen für die Gefriertrocknung und Sprühtrocknung als Füllstoff oder Kryoprotektivum. Bei den lyophilisierten Insulin-Nanopartikeln ohne Mannitol (Abb. 2a) wurde unter dem Rasterelektronenmikroskop (REM) eine hochporöse Pulverstruktur mit großen, unregelmäßigen und rauen Oberflächen beobachtet. Nach der Dehydratisierung waren im Pulver nur wenige einzelne Partikel nachweisbar (Abb. 2e). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich die meisten NPs während der Gefriertrocknung ohne Kryoprotektivum zersetzten. Bei den gefriergetrockneten und sprühgetrockneten Insulin-Nanopartikeln mit 1 % Mannitol wurden sphärische Nanopartikel mit glatten Oberflächen beobachtet. Die beobachteten Strukturen sind in Abb. 2b, d, f und h dargestellt. Insulin-Nanopartikel, die ohne Mannitol sprühgetrocknet wurden, blieben kugelförmig, wiesen jedoch eine runzelige Oberfläche auf (Abb. 2c). Die kugelförmigen und runzeligen Oberflächen werden im Folgenden im Zusammenhang mit dem Freisetzungsverhalten und den zellulären Aufnahmetests näher erläutert. Sowohl die sprühgetrockneten als auch die gefriergetrockneten und sprühgetrockneten Nanopartikel mit Mannitol ergaben, basierend auf dem Erscheinungsbild der getrockneten Nanopartikel, feine Pulver (Abb. 2f, g und h). Je größer die Oberfläche zwischen den Partikeln ist, desto höher ist die Löslichkeit und somit die Freisetzungsrate.
Morphologie verschiedener dehydrierter Insulin-Nanopartikel: (a) REM-Aufnahme von lyophilisierten Insulin-Nanopartikeln ohne Mannitol; (b) REM-Aufnahme von lyophilisierten Insulin-Nanopartikeln mit Mannitol; (c) REM-Aufnahme von sprühgetrockneten Insulin-Nanopartikeln ohne Mannitol; (d) REM-Aufnahme von mit Mannitol sprühgetrockneten Insulin-Nanopartikeln; (e) REM-Aufnahme von lyophilisiertem Insulin-Nanopartikelpulver ohne Mannitol; (f) REM-Aufnahme von lyophilisierten Insulin-Nanopartikeln mit Mannitol; (g) REM-Aufnahme von sprühgetrocknetem Insulin-Nanopartikelpulver ohne Mannitol; (h) REM-Aufnahme von sprühgetrocknetem Insulin-Nanopartikelpulver mit Mannitol.
Bei der Gefriertrocknung wirkt Mannitol als Kryoprotektivum, das die Nanopartikel (NPs) in amorpher Form hält und Schäden durch Eiskristalle verhindert¹⁹. Im Gegensatz dazu findet bei der Sprühtrocknung kein Gefrierschritt statt. Daher ist Mannitol bei dieser Methode nicht erforderlich. Tatsächlich ergaben sprühgetrocknete NPs ohne Mannitol, wie bereits beschrieben, feinere Partikel. Mannitol kann jedoch auch im Sprühtrocknungsprozess als Füllstoff dienen und den NPs eine kugelförmigere Struktur verleihen²⁰ (Abb. 2d), was zu einem gleichmäßigen Freisetzungsverhalten der verkapselten NPs beiträgt. Darüber hinaus sind sowohl in gefriergetrockneten als auch in sprühgetrockneten Insulin-NPs mit Mannitol einige größere Partikel nachweisbar (Abb. 2b,d). Dies könnte auf die Anreicherung von Mannitol im Partikelkern zusammen mit dem verkapselten Insulin zurückzuführen sein. Zur Chitosanschicht. Es ist erwähnenswert, dass in dieser Studie das Verhältnis von Mannitol zu Chitosan bei 5:1 gehalten wurde, um sicherzustellen, dass die sphärische Struktur nach der Dehydratisierung intakt bleibt, sodass eine große Menge Füllstoff auch die Partikelgröße der getrockneten NPs vergrößern kann.
Die physikalische Mischung aus freiem Insulin, Chitosan, Chitosan, TPP und Insulin wurde mittels Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie mit abgeschwächter Totalreflexion (FTIR-ATR) charakterisiert. Alle dehydrierten Nanopartikel (NPs) wurden mittels FTIR-ATR-Spektroskopie charakterisiert. Insbesondere wurden Bandenintensitäten bei 1641, 1543 und 1412 cm⁻¹ in verkapselten, mit Mannitol gefriergetrockneten NPs sowie in sprühgetrockneten NPs mit und ohne Mannitol beobachtet (Abb. 3). Wie bereits berichtet, waren diese Intensitätszunahmen mit der Vernetzung zwischen Chitosan, TPP und Insulin verbunden. Untersuchungen der Wechselwirkung zwischen Chitosan und Insulin zeigten, dass sich in den FTIR-Spektren von insulinbeladenen Chitosan-Nanopartikeln die Chitosan-Bande mit der von Insulin überlagerte, wodurch die Intensität der Carbonyl- (1641 cm⁻¹) und Amin-Bande (1543 cm⁻¹) zunahm. Die Tripolyphosphatgruppen von TPP sind an Ammoniumgruppen im Chitosan gebunden und bilden eine Bande bei 1412 cm-1.
FTIR-ATR-Spektren von freiem Insulin, Chitosan, physikalischen Mischungen aus Chitosan/TPP/Insulin und NPs, die mit verschiedenen Methoden dehydriert wurden.
Des Weiteren stimmen diese Ergebnisse mit den SEM-Aufnahmen überein, die zeigten, dass die verkapselten NPs sowohl beim Besprühen als auch beim Gefriertrocknen mit Mannitol intakt blieben. Ohne Mannitol entstanden jedoch nur durch Sprühtrocknung verkapselte Partikel. Im Gegensatz dazu ähnelten die FTIR-ATR-Spektren der ohne Mannitol gefriergetrockneten NPs stark denen einer physikalischen Mischung aus Chitosan, TPP und Insulin. Dies deutet darauf hin, dass die Vernetzungen zwischen Chitosan, TPP und Insulin in den ohne Mannitol gefriergetrockneten NPs nicht mehr vorhanden sind. Die NP-Struktur wurde während der Gefriertrocknung ohne Kryoprotektivum zerstört, was in den SEM-Aufnahmen (Abb. 2a) zu sehen ist. Aufgrund der Morphologie und der FTIR-Ergebnisse der dehydrierten Insulin-NPs wurden für die Rekonstitutionsexperimente nur lyophilisierte, sprühgetrocknete und mannitolfreie NPs verwendet. Mannitolfreie NPs wurden aufgrund der Zersetzung von mannitolfreiem Material nicht weiter untersucht. NPs während der Dehydratation. Diskussion.
Die Dehydratisierung dient der Langzeitlagerung und Weiterverarbeitung zu anderen Formulierungen. Die Rekonstitutionsfähigkeit trockener Nanopartikel (NPs) nach der Lagerung ist entscheidend für deren Verwendung in verschiedenen Formulierungen wie Tabletten und Filmen. Wir beobachteten, dass die durchschnittliche Partikelgröße der sprühgetrockneten Insulin-NPs ohne Mannitol nach der Rekonstitution nur geringfügig zunahm. Im Gegensatz dazu erhöhte sich die Partikelgröße der sprüh- und gefriergetrockneten Insulin-Nanopartikel mit Mannitol signifikant (Tabelle 1). PDI und EE veränderten sich nach der Rekombination aller in dieser Studie untersuchten NPs nicht signifikant (p > 0,05) (Tabelle 1). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die meisten Partikel nach dem Wiederauflösen intakt blieben. Die Zugabe von Mannitol führte jedoch zu einer stark reduzierten Insulinbeladung der lyophilisierten und sprühgetrockneten Mannitol-Nanopartikel (Tabelle 1). Im Gegensatz dazu blieb der Insulingehalt der ohne Mannitol sprühgetrockneten NPs unverändert (Tabelle 1).
Es ist bekannt, dass die Beladung von Nanopartikeln für die Arzneimittelverabreichung entscheidend ist. Bei Nanopartikeln mit geringer Beladung sind sehr große Materialmengen erforderlich, um die therapeutische Schwelle zu erreichen. Die hohe Viskosität solcher hoher Nanopartikelkonzentrationen führt jedoch zu Unannehmlichkeiten und Schwierigkeiten bei der oralen Verabreichung bzw. der Herstellung injizierbarer Formulierungen²². Darüber hinaus können Insulin-Nanopartikel auch zur Herstellung von Tabletten und viskosen Biofilmen verwendet werden^23,24, was den Einsatz großer Mengen von Nanopartikeln bei geringer Beladung erfordert und zu großen Tabletten bzw. dicken Biofilmen führt, die für die orale Anwendung ungeeignet sind. Daher sind dehydrierte Nanopartikel mit hoher Insulinbeladung äußerst wünschenswert. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die hohe Insulinbeladung von mannitolfreien, sprühgetrockneten Nanopartikeln viele attraktive Vorteile für diese alternativen Verabreichungsmethoden bietet.
Alle dehydrierten Nanopartikel wurden drei Monate lang im Kühlschrank aufbewahrt. SEM-Aufnahmen zeigten, dass sich die Morphologie der dehydrierten Nanopartikel während der dreimonatigen Lagerung nicht signifikant veränderte (Abb. 4). Nach der Rekonstitution in Wasser wiesen alle Nanopartikel einen leichten Rückgang der Verkapselungseffizienz (EE) auf und setzten während der dreimonatigen Lagerung eine geringe Menge (~5 %) Insulin frei (Tabelle 2). Die durchschnittliche Partikelgröße aller Nanopartikel nahm jedoch zu. Die Partikelgröße der ohne Mannitol sprühgetrockneten Nanopartikel stieg auf 525 nm, während die der mit Mannitol sprühgetrockneten und gefriergetrockneten Nanopartikel auf 872 bzw. 921 nm anstieg (Tabelle 2).
Morphologie verschiedener dehydrierter Insulin-NPs nach dreimonatiger Lagerung: (a) REM-Aufnahme von lyophilisierten Insulin-NPs mit Mannitol; (b) REM-Aufnahme von sprühgetrockneten Insulin-Nanopartikeln ohne Mannitol; (c) REM-Aufnahmen von sprühgetrockneten Insulin-NPs ohne Mannitol.
Des Weiteren wurden in den mit Mannitol sprühgetrockneten und gefriergetrockneten rekonstituierten Insulin-Nanopartikeln Ausfällungen beobachtet (Abb. S2). Dies könnte auf größere Partikel zurückzuführen sein, die sich nicht ausreichend im Wasser suspendieren. Alle oben genannten Ergebnisse zeigen, dass die Sprühtrocknungstechnik Insulin-Nanopartikel vor Austrocknung schützt und dass hohe Beladungen mit Insulin-Nanopartikeln ohne Füllstoffe oder Kryoprotektiva erzielt werden können.
Die Insulinretention wurde in einem Medium mit pH = 2,5 mit Pepsin, Trypsin und α-Chymotrypsin getestet, um die Schutzwirkung der Nanopartikel (NPs) gegen enzymatische Verdauung nach Dehydratisierung zu demonstrieren. Die Insulinretention dehydratisierter NPs wurde mit der von frisch hergestellten NPs verglichen, wobei freies Insulin als Negativkontrolle diente. In dieser Studie zeigte freies Insulin in allen drei enzymatischen Behandlungen eine schnelle Insulinelimination innerhalb von 4 Stunden (Abb. 5a–c). Im Gegensatz dazu zeigte die Insulineliminationsprüfung von mit Mannitol gefriergetrockneten NPs sowie von mit und ohne Mannitol sprühgetrockneten NPs einen signifikant höheren Schutz dieser NPs gegen enzymatische Verdauung, vergleichbar mit dem von frisch hergestellten Insulin-NPs (Abb. 1). Mithilfe der Nanopartikel in Pepsin, Trypsin und α-Chymotrypsin konnten innerhalb von 4 Stunden mehr als 50 %, 60 % bzw. 75 % des Insulins geschützt werden (Abb. 5a–c). 5a–c). Diese insulinprotektive Fähigkeit kann die Wahrscheinlichkeit einer höheren Insulinaufnahme in den Blutkreislauf erhöhen25. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Sprühtrocknung mit oder ohne Mannitol und Gefriertrocknung mit Mannitol die insulinprotektive Fähigkeit von NPs nach der Dehydratisierung erhalten können.
Schutz- und Freisetzungsverhalten dehydrierter Insulin-Nanopartikel: (a) Schutz von Insulin in Pepsinlösung; (b) Schutz von Insulin in Trypsinlösung; (c) Schutz von Insulin durch α-Chymotrypsinlösung; (d) Freisetzungsverhalten dehydrierter Nanopartikel in Lösung mit pH = 2,5; (e) Freisetzungsverhalten dehydrierter Nanopartikel in Lösung mit pH = 6,6; (f) Freisetzungsverhalten dehydrierter Nanopartikel in Lösung mit pH = 7,0.
Frisch hergestellte und rekonstituierte trockene Insulin-Nanopartikel wurden in verschiedenen Puffern (pH = 2,5, 6,6, 7,0) bei 37 °C inkubiert, um die pH-Milieu von Magen, Zwölffingerdarm und oberem Dünndarm zu simulieren und so die Wirkung von Insulin auf die Insulinresistenz zu untersuchen. Freisetzungsverhalten in verschiedenen Umgebungen. Fragment des Magen-Darm-Trakts. Bei pH = 2,5 zeigten insulinbeladene NPs und resolubilisierte trockene Insulin-NPs eine anfängliche, schnelle Freisetzung innerhalb der ersten Stunde, gefolgt von einer langsamen Freisetzung über die nächsten 5 Stunden (Abb. 5d). Diese schnelle Freisetzung zu Beginn ist höchstwahrscheinlich auf die rasche Desorption von Proteinmolekülen von der Oberfläche zurückzuführen, die nicht vollständig in der inneren Struktur des Partikels immobilisiert sind. Bei pH = 6,5 zeigten insulinbeladene NPs und rekonstituierte trockene Insulin-NPs eine gleichmäßige und langsame Freisetzung über 6 Stunden, da der pH-Wert der Testlösung dem der NP-Herstellungslösung ähnelte (Abb. 5e). Bei pH = 7 waren die NPs instabil und zersetzten sich innerhalb der ersten zwei Stunden nahezu vollständig (Abb. 5f). Dies liegt daran, dass bei höherem pH-Wert eine Deprotonierung von Chitosan stattfindet, was zu einem weniger kompakten Polymernetzwerk und zur Freisetzung des geladenen Insulins führt.
Des Weiteren zeigten die ohne Mannitol sprühgetrockneten Insulin-Nanopartikel ein schnelleres Freisetzungsprofil als die anderen dehydrierten Nanopartikel (Abb. 5d–f). Wie bereits beschrieben, wiesen die ohne Mannitol getrockneten, rekonstituierten Insulin-Nanopartikel die kleinste Partikelgröße auf. Kleine Partikel bieten eine größere Oberfläche, sodass sich der größte Teil des Wirkstoffs an oder nahe der Partikeloberfläche befindet, was zu einer schnellen Wirkstofffreisetzung führt.²⁶
Die Zytotoxizität der NPs wurde mittels MTT-Assay untersucht. Wie in Abbildung S4 dargestellt, hatten alle dehydrierten NPs bei Konzentrationen von 50–500 μg/ml keinen signifikanten Einfluss auf die Zellviabilität, was darauf hindeutet, dass alle dehydrierten NPs sicher verwendet werden können, um das therapeutische Fenster zu erreichen.
Die Leber ist das Hauptorgan, über das Insulin seine physiologischen Funktionen ausübt. HepG2-Zellen sind eine humane Hepatomzelllinie, die häufig als In-vitro-Modell für die Aufnahme in Hepatozyten verwendet wird. Hier wurden HepG2-Zellen eingesetzt, um die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln (NPs) zu untersuchen, die mittels Gefriertrocknung und Sprühtrocknung dehydriert wurden. Die zelluläre Aufnahme wurde mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) mit Durchflusszytometrie und Bildgebung nach mehrstündiger Inkubation mit freiem FITC-Insulin (25 μg/ml), frisch hergestellten und dehydrierten FITC-Insulin-beladenen NPs (jeweils in gleicher Insulinkonzentration) analysiert. Zusätzlich wurden quantitative CLSM-Untersuchungen durchgeführt. Lyophilisierte NPs ohne Mannitol wurden während der Dehydratisierung zerstört und daher nicht berücksichtigt. Die intrazellulären Fluoreszenzintensitäten von frisch hergestellten, Insulin-beladenen NPs, lyophilisierten NPs mit Mannitol sowie sprühgetrockneten NPs mit und ohne Mannitol sind in Abb. 1 dargestellt. 6a) waren 4,3-, 2,6-, 2,4- bzw. 4,1-mal höher als die der freien FITC-Insulin-Gruppe (Abb. 6b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass verkapseltes Insulin eine höhere zelluläre Aufnahmerate aufweist als freies Insulin, was hauptsächlich auf die geringere Größe der in dieser Studie hergestellten insulinbeladenen Nanopartikel zurückzuführen ist.
Aufnahme von FITC-Insulin durch HepG2-Zellen nach 4-stündiger Inkubation mit frisch hergestellten und dehydrierten NPs: (a) Verteilung der FITC-Insulin-Aufnahme durch HepG2-Zellen. (b) Geometrisches Mittel der Fluoreszenzintensitäten, analysiert mittels Durchflusszytometrie (n = 3), *P < 0,05 im Vergleich zu freiem Insulin.
Die CLSM-Bilder zeigten, dass die FITC-Fluoreszenzintensitäten frisch hergestellter FITC-Insulin-beladener NPs und sprühgetrockneter FITC-Insulin-beladener NPs (ohne Mannitol) deutlich höher waren als die der anderen Proben (Abb. 6a). Durch die Zugabe von Mannitol erhöhte sich die Viskosität der Lösung, was die zelluläre Aufnahme erschwerte und somit die Insulinvermehrung verringerte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass mannitolfreie, sprühgetrocknete NPs die höchste zelluläre Aufnahmeeffizienz aufwiesen, da ihre Partikelgröße nach der Wiederauflösung kleiner war als die von gefriergetrockneten NPs.
Chitosan (mittleres Molekulargewicht 100 kDa, 75–85 % deacetyliert) wurde von Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada) bezogen. Natriumtripolyphosphat (TPP) wurde von VWR (Radnor, Pennsylvania, USA) bezogen. Das in dieser Studie verwendete rekombinante Humaninsulin stammte von Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-markiertes Humaninsulin und 4′,6-Diamidino-2-phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI) wurden von Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada) bezogen. Die HepG2-Zelllinie wurde von ATCC (Manassas, Virginia, USA) bezogen. Alle anderen Reagenzien waren von analytischer oder chromatographischer Reinheit.
Eine 1 mg/ml CS-Lösung wird durch Auflösen in doppelt destilliertem Wasser (DD-Wasser) mit 0,1 % Essigsäure hergestellt. TPP- und Insulinlösungen mit einer Konzentration von jeweils 1 mg/ml werden durch Auflösen in DD-Wasser bzw. 0,1 % Essigsäure hergestellt. Die Präemulsion wurde mit einem Polytron PCU-2-110 Hochgeschwindigkeitshomogenisator (Brinkmann Ind., Westbury, NY, USA) hergestellt. Die Herstellung erfolgte wie folgt: Zunächst wurden 2 ml TPP-Lösung zu 4 ml Insulinlösung gegeben und die Mischung 30 Minuten lang gerührt, bis sie vollständig vermischt war. Anschließend wurde die Mischung unter Hochgeschwindigkeitsrühren (10.000 U/min) tropfenweise mit einer Spritze zur CS-Lösung gegeben. Die Mischungen wurden 30 Minuten lang in einem Eisbad unter Hochgeschwindigkeitsrühren (15.000 U/min) gehalten und auf einen bestimmten pH-Wert eingestellt, um vernetzte Insulin-Nanopartikel zu erhalten. Zur weiteren Homogenisierung und Reduzierung der Partikelgröße der Insulin-Nanopartikel wurden diese anschließend weiter homogenisiert. wurde anschließend 30 Minuten lang in einem Eisbad mit einem Stabsonikator (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Deutschland) beschallt.
Insulin-Nanopartikel (NPs) wurden mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) mit einem Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Österreich) auf ihren Z-Mittelwert des Durchmessers, ihren Polydispersitätsindex (PDI) und ihr Zeta-Potential untersucht. Dazu wurden sie in deionisiertem Wasser bei 25 °C verdünnt. Morphologie und Größenverteilung wurden mit einem Hitachi H7600 Transmissionselektronenmikroskop (TEM) (Hitachi, Tokio, Japan) charakterisiert und die Bilder anschließend mit der Hitachi-Bildanalysesoftware (Hitachi, Tokio, Japan) analysiert. Zur Bestimmung der Verkapselungseffizienz (EE) und der Beladungskapazität (LC) der Insulin-NPs wurden diese in Ultrafiltrationsröhrchen mit einer Ausschlussgrenze von 100 kDa pipettiert und 30 min bei 500 × g zentrifugiert. Nicht verkapseltes Insulin im Filtrat wurde mit einem Agilent 1100 Series HPLC-System (Agilent, Santa Clara, Kalifornien, USA) quantifiziert, das aus einer quaternären Pumpe, einem Autosampler und einer Säule besteht. Die Insulin-Analyse erfolgte mittels einer C18-Säule (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, USA) mit einer Detektion bei 214 nm. Die mobile Phase bestand aus Acetonitril und Wasser mit 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) und wurde mit einem Gradienten von 10/90 auf 100/0 über 10 Minuten eluiert. Die Flussrate betrug 1,0 ml/min. Die Säulentemperatur war auf 20 °C eingestellt. Die prozentualen Anteile von EE und LC wurden mithilfe der Gleichungen (1) und (2) berechnet.
Zur Optimierung der Insulin-Nanopartikel wurden verschiedene CS/Insulin-Verhältnisse von 2,0 bis 4,0 getestet. Während der Herstellung wurden unterschiedliche Mengen an CS-Lösung zugegeben, während die Insulin/TPP-Mischung konstant gehalten wurde. Die Insulin-Nanopartikel wurden im pH-Bereich von 4,0 bis 6,5 hergestellt, indem der pH-Wert der Mischung nach Zugabe aller Lösungen (Insulin, TPP und CS) sorgfältig kontrolliert wurde. Die Verkapselungseffizienz (EE) und die Partikelgröße der Insulin-Nanopartikel wurden bei verschiedenen pH-Werten und CS/Insulin-Massenverhältnissen untersucht, um die Bildung der Insulin-Nanopartikel zu optimieren.
Die optimierten Insulin-Nanopartikel wurden in einen Aluminiumbehälter gegeben und mit einem mit Klebeband fixierten Gewebetuch abgedeckt. Anschließend wurden die verschlossenen Behälter in einen Labconco FreeZone Gefriertrockner (Labconco, Kansas City, MO, USA) mit Trockenkammer gestellt. Temperatur und Vakuumdruck wurden für die ersten 2 Stunden auf -10 °C und 0,350 Torr und für die verbleibenden 22 Stunden der 24-stündigen Trocknungszeit auf 0 °C und 0,120 Torr eingestellt, um trockene Insulin-Nanopartikel zu erhalten.
Zur Herstellung von verkapseltem Insulin wurde ein Buchi Mini-Sprühtrockner B-290 (BÜCHI, Flawil, Schweiz) verwendet. Die gewählten Trocknungsparameter waren: Temperatur 100 °C, Zulaufstrom 3 l/min und Gasstrom 4 l/min.
Insulin-Nanopartikel wurden vor und nach der Dehydratisierung mittels FTIR-ATR-Spektroskopie charakterisiert. Dehydratisierte Nanopartikel sowie freies Insulin und Chitosan wurden mit einem Spectrum 100 FTIR-Spektrophotometer (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) mit universellem ATR-Probenaufsatz (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) analysiert. Die Signalmittelwerte wurden aus 16 Scans bei einer Auflösung von 4 cm⁻² im Frequenzbereich von 4000–600 cm⁻¹ ermittelt.
Die Morphologie trockener Insulin-Nanopartikel wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) untersucht. Die Aufnahmen von gefriergetrockneten und sprühgetrockneten Insulin-Nanopartikeln wurden mit einem Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscope (FIB-REM) (FEI, Hillsboro, Oregon, USA) angefertigt. Die wichtigsten Parameter waren eine Spannung von 5 keV und ein Strom von 30 mA.
Alle dehydrierten Insulin-Nanopartikel wurden in deionisiertem Wasser wieder gelöst. Partikelgröße, Polydispersitätsindex (PDI), Verkapselungseffizienz (EE) und Partikelgröße (LC) wurden nach der Dehydratisierung erneut mit der zuvor beschriebenen Methode bestimmt, um die Qualität der Nanopartikel zu beurteilen. Die Stabilität der Anhydroinsulin-Nanopartikel wurde durch die Untersuchung ihrer Eigenschaften nach längerer Lagerung ermittelt. In dieser Studie wurden alle Nanopartikel nach der Dehydratisierung drei Monate lang im Kühlschrank gelagert. Nach dreimonatiger Lagerung wurden die Nanopartikel hinsichtlich ihrer morphologischen Eigenschaften (PDI, EE und LC) untersucht.
Zur Untersuchung der Wirksamkeit von Insulin beim Schutz der Nanopartikel nach Dehydratation wurden 5 ml rekonstituierte Nanopartikel in 45 ml simulierter Magensaftlösung (pH 1,2, mit 1 % Pepsin), Darmsaftlösung (pH 6,8, mit 1 % Trypsin) oder Chymotrypsinlösung (100 g/ml in Phosphatpuffer, pH 7,8) gelöst. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C und 100 U/min. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden jeweils 500 μl der Lösung entnommen und die Insulinkonzentration mittels HPLC bestimmt.
Das Freisetzungsverhalten frisch hergestellter und dehydrierter Insulin-Nanopartikel (NPs) in vitro wurde mittels Dialysebeutelmethode (Molekulargewichtsausschlussgrenze 100 kDa, Spectra Por Inc.) untersucht. Frisch hergestellte und rekonstituierte trockene NPs wurden in Flüssigkeiten mit pH 2,5, pH 6,6 und pH 7,0 (0,1 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS) dialysiert, um das pH-Milieu von Magen, Duodenum bzw. oberem Dünndarm zu simulieren. Alle Proben wurden bei 37 °C unter kontinuierlichem Schütteln (200 U/min) inkubiert. Die Flüssigkeit aus dem 5-ml-Dialysebeutel wurde nach 0,5, 1, 2, 3, 4 und 6 Stunden abgesaugt und sofort durch frisches Dialysat ersetzt. Die Insulinverunreinigung in der Flüssigkeit wurde mittels HPLC analysiert, und die Freisetzungsrate des Insulins aus den Nanopartikeln wurde aus dem Verhältnis von freiem Insulin zu dem in den Nanopartikeln verkapselten Gesamtinsulin berechnet. (Gleichung 3).
Die humane hepatozelluläre Karzinomzelllinie HepG2 wurde in 60-mm-Petrischalen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Kälberserum, 100 IE/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin kultiviert. Die Kulturen wurden bei 37 °C, 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO₂ gehalten. Für Aufnahmetests wurden HepG2-Zellen mit einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen/ml auf ein 8-Well-Nunc-Lab-Tek-Kammersystem (Thermo Fisher, NY, USA) ausgesät. Für Zytotoxizitätstests wurden sie in 96-Well-Platten (Corning, NY, USA) mit einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/ml ausgesät.
Der MTT-Assay wurde zur Bestimmung der Zytotoxizität frisch hergestellter und dehydrierter Insulin-Nanopartikel (NPs) eingesetzt.³⁰ HepG2-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/ml ausgesät und vor dem Test 7 Tage lang kultiviert. Insulin-NPs wurden in Kulturmedium auf verschiedene Konzentrationen (50 bis 500 μg/ml) verdünnt und anschließend den Zellen zugegeben. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und für weitere 4 Stunden mit Medium, das 0,5 mg/ml MTT enthielt, inkubiert. Die Zytotoxizität wurde durch Messung der enzymatischen Reduktion von gelbem Tetrazolium-MTT zu violettem Formazan bei 570 nm mit einem Tecan Infinite M200 Pro Spektralphotometer (Tecan, Männedorf, Schweiz) bestimmt.
Die zelluläre Aufnahmeeffizienz von Nanopartikeln (NPs) wurde mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie und Durchflusszytometrie untersucht. Jede Vertiefung des Nunc Lab-Tek Kammer-Objektträgersystems wurde mit freiem FITC-Insulin, FITC-Insulin-beladenen NPs und einer Lösung von 25 μg/ml dehydrierten FITC-Insulin-NPs in gleicher Konzentration behandelt und 4 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die Zellkerne wurden mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) angefärbt. Die Insulinlokalisation wurde mit einem Olympus FV1000 Laserscanning-/Zwei-Photonen-Konfokalmikroskop (Olympus, Shinjuku City, Tokio, Japan) beobachtet. Für die durchflusszytometrische Analyse wurden die gleichen Konzentrationen von 10 μg/ml freiem FITC-Insulin, FITC-Insulin-beladenen NPs und DAPI verwendet. Resolubilisierte, dehydrierte FITC-Insulin-Nanopartikel wurden zu mit HepG2-Zellen beimpften 96-Well-Platten gegeben und 4 Stunden lang inkubiert. Nach 4 Stunden Inkubation wurden die Zellen entfernt und dreimal mit FBS gewaschen. 5 × 10⁴ Zellen pro Probe wurden mit einem BD LSR II Durchflusszytometer (BD, Franklin Lakes, New Jersey, USA) analysiert.
Alle Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Vergleiche zwischen allen Gruppen wurden mittels einfaktorieller ANOVA oder t-Test mit IBM SPSS Statistics 26 für Mac (IBM, Endicott, New York, USA) durchgeführt; ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Diese Studie demonstriert die Flexibilität und Leistungsfähigkeit der Sprühtrocknung zur Dehydratisierung vernetzter Chitosan/TPP/Insulin-Nanopartikel mit verbesserter Rekonstitution im Vergleich zu Standard-Gefriertrocknungsmethoden mit Füllstoffen oder Kryoprotektiva sowie höherer Beladungskapazität. Die optimierten Insulin-Nanopartikel wiesen eine durchschnittliche Partikelgröße von 318 nm und eine Verkapselungseffizienz von 99,4 % auf. SEM- und FTIR-Ergebnisse nach der Dehydratisierung zeigten, dass die sphärische Struktur nur bei sprühgetrockneten NPs mit und ohne Mannitol sowie bei mit Mannitol lyophilisierten NPs erhalten blieb. Lyophilisierte NPs ohne Mannitol zersetzten sich hingegen während der Dehydratisierung. Im Rekonstitutionstest zeigten die ohne Mannitol sprühgetrockneten Insulin-Nanopartikel die kleinste mittlere Partikelgröße und die höchste Beladung nach der Rekonstitution. Das Freisetzungsverhalten aller dehydratisierten NPs zeigte eine schnelle Freisetzung in Lösungen mit pH 2,5 und pH 7 sowie eine hohe Stabilität in Lösungen mit pH 6,5. Von anderen wiederaufgelösten, dehydrierten NPs zeigten die ohne Mannitol sprühgetrockneten NPs die schnellste Freisetzung. Dieses Ergebnis stimmt mit den Beobachtungen im zellulären Aufnahmetest überein, da die sprühgetrockneten NPs ohne Mannitol die zelluläre Aufnahmeeffizienz frisch hergestellter NPs nahezu vollständig beibehielten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass durch mannitolfreie Sprühtrocknung hergestellte trockene Insulin-Nanopartikel am besten für die Weiterverarbeitung zu anderen wasserfreien Darreichungsformen wie Tabletten oder bioadhäsiven Filmen geeignet sind.
Aus Gründen des Urheberrechts sind die im Rahmen dieser Studie generierten und/oder analysierten Datensätze nicht öffentlich zugänglich, können aber auf begründete Anfrage bei den jeweiligen Autoren angefordert werden.
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