Der Artikel ist Teil des Forschungsthemas „Verbesserung der Resistenz von Hülsenfrüchten gegenüber Krankheitserregern und Schädlingen“. Alle 5 Artikel ansehen.
Der Erreger der Pilznekrose an Pflanzen, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, nutzt eine mehrstufige Strategie zur Infektion verschiedener Wirtspflanzen. Diese Studie schlägt die Verwendung des Diamins L-Ornithin, einer nicht-proteinogenen Aminosäure, die die Synthese anderer essentieller Aminosäuren stimuliert, als alternative Bekämpfungsstrategie vor, um die molekularen, physiologischen und biochemischen Reaktionen von Phaseolus vulgaris L. auf Weißschimmel, verursacht durch Pseudomonas sclerotiorum, zu verbessern. In-vitro-Experimente zeigten, dass L-Ornithin das Myzelwachstum von S. pyrenoidosa dosisabhängig signifikant hemmte. Darüber hinaus konnte es den Befall mit Weißschimmel unter Gewächshausbedingungen deutlich reduzieren. Weiterhin stimulierte L-Ornithin das Wachstum der behandelten Pflanzen, was darauf hindeutet, dass die getesteten Konzentrationen von L-Ornithin für die behandelten Pflanzen nicht phytotoxisch waren. Darüber hinaus steigerte L-Ornithin die Expression nicht-enzymatischer Antioxidantien (gesamte lösliche Phenole und Flavonoide) sowie enzymatischer Antioxidantien (Katalase (CAT), Peroxidase (POX) und Polyphenoloxidase (PPO)) und erhöhte die Expression dreier antioxidativer Gene (PvCAT1, PvSOD und PvGR). Weiterhin zeigte die In-silico-Analyse das Vorhandensein eines mutmaßlichen Oxalacetat-Acetylhydrolase-Proteins (SsOAH) im Genom von S. sclerotiorum, welches hinsichtlich funktioneller Analyse, konservierter Domänen und Topologie eine hohe Ähnlichkeit zu den Oxalacetat-Acetylhydrolase-Proteinen (SsOAH) von Aspergillus fijiensis (AfOAH) und Penicillium sp. (PlOAH) aufwies. Interessanterweise verringerte die Zugabe von L-Ornithin zum Kartoffel-Dextrose-Bouillon-Medium (PDB) die Expression des SsOAH-Gens im Myzel von S. sclerotiorum signifikant. Ebenso verringerte die exogene Applikation von L-Ornithin die Expression des SsOAH-Gens im Myzel des Pilzes, das von behandelten Pflanzen stammte, signifikant. Schließlich verringerte die L-Ornithin-Applikation die Oxalsäuresekretion sowohl im PDB-Medium als auch in infizierten Blättern signifikant. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass L-Ornithin eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung des Redoxstatus sowie bei der Stärkung der Abwehrreaktion infizierter Pflanzen spielt. Die Ergebnisse dieser Studie können zur Entwicklung innovativer, umweltfreundlicher Methoden zur Bekämpfung von Weißschimmel beitragen und dessen Auswirkungen auf den Bohnenanbau und andere Nutzpflanzen mindern.
Weißschimmel, verursacht durch den nekrotrophen Pilz Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, ist eine verheerende, ertragsmindernde Krankheit, die eine ernsthafte Bedrohung für den weltweiten Bohnenanbau (Phaseolus vulgaris L.) darstellt (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum zählt zu den am schwierigsten zu bekämpfenden bodenbürtigen pflanzenpathogenen Pilzen. Er befällt über 600 Pflanzenarten und kann Wirtsgewebe schnell und unspezifisch zersetzen (Liang und Rollins, 2018). Unter ungünstigen Bedingungen durchläuft er eine kritische Phase seines Lebenszyklus, in der er lange Zeit als schwarze, harte, samenartige Strukturen, sogenannte Sklerotien, im Boden oder als weiße, flaumige Beläge im Myzel oder Stammmark infizierter Pflanzen inaktiv bleibt (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum bildet Sklerotien, wodurch es auf infizierten Feldern lange überleben und während der Krankheit persistieren kann (Schwartz et al., 2005). Sklerotien sind nährstoffreich, können lange im Boden verbleiben und dienen als primäres Inokulum für nachfolgende Infektionen (Schwartz et al., 2005). Unter günstigen Bedingungen keimen die Sklerotien und produzieren luftgetragene Sporen, die alle oberirdischen Pflanzenteile, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Blüten, Stängel und Hülsen, infizieren können (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum infiziert seine Wirtspflanzen mit einer mehrstufigen Strategie, die eine Reihe koordinierter Ereignisse von der Sklerotienkeimung bis zur Symptomentwicklung umfasst. Zunächst produziert S. sclerotiorum suspendierte Sporen (Ascosporen) aus pilzartigen Strukturen, den Apothecien. Diese werden durch die Luft verbreitet und entwickeln sich auf infizierten Pflanzenresten zu unbeweglichen Sklerotien (Bolton et al., 2006). Der Pilz scheidet anschließend Oxalsäure, einen Virulenzfaktor, aus, um den pH-Wert der pflanzlichen Zellwand zu regulieren, den enzymatischen Abbau und das Eindringen in das Gewebe zu fördern (Hegedus und Rimmer, 2005) und den oxidativen Ausbruch der Wirtspflanze zu unterdrücken. Dieser Ansäuerungsprozess schwächt die pflanzliche Zellwand und schafft so ein günstiges Milieu für die normale und effiziente Funktion der zellwandabbauenden Enzyme (CWDEs) des Pilzes. Dadurch kann der Erreger die physikalische Barriere überwinden und in das Wirtsgewebe eindringen (Marciano et al., 1983). Nach dem Eindringen in die Pflanze sezerniert *S. sclerotiorum* verschiedene zellwandabbauende Enzyme (CWDEs), wie Polygalacturonase und Cellulase, die die Ausbreitung im infizierten Gewebe fördern und zu Gewebenekrosen führen. Das Fortschreiten der Läsionen und die Bildung von Hyphenmatten führen zu den charakteristischen Symptomen des Weißschimmels (Hegedus und Rimmer, 2005). Gleichzeitig erkennen Wirtspflanzen pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) über Mustererkennungsrezeptoren (PRRs), wodurch eine Reihe von Signalereignissen ausgelöst wird, die letztendlich die Abwehrreaktionen aktivieren.
Trotz jahrzehntelanger Bemühungen zur Krankheitsbekämpfung besteht, wie bei anderen Nutzpflanzen auch, weiterhin ein Mangel an ausreichend resistentem Saatgut bei Bohnen. Grund dafür sind die Resistenz, das Überleben und die Anpassungsfähigkeit des Erregers. Die Krankheitsbekämpfung ist daher äußerst anspruchsvoll und erfordert eine integrierte, vielschichtige Strategie, die Anbaumaßnahmen, biologische Bekämpfung und chemische Fungizide kombiniert (O'Sullivan et al., 2021). Die chemische Bekämpfung von Weißschimmel ist am effektivsten, da Fungizide bei korrekter und zeitgerechter Anwendung die Ausbreitung der Krankheit wirksam eindämmen, den Befall reduzieren und Ertragsverluste minimieren können. Übermäßiger Einsatz und eine zu starke Abhängigkeit von Fungiziden können jedoch zur Entstehung resistenter Stämme von S. sclerotiorum führen und Nichtzielorganismen, die Bodengesundheit und die Wasserqualität negativ beeinflussen (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Daher hat die Suche nach umweltfreundlichen Alternativen höchste Priorität.
Polyamine (PAs) wie Putrescin, Spermidin, Spermin und Cadaverin stellen vielversprechende Alternativen zur Bekämpfung bodenbürtiger Pflanzenpathogene dar und können so den Einsatz gefährlicher chemischer Fungizide ganz oder teilweise reduzieren (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). In höheren Pflanzen sind PAs an zahlreichen physiologischen Prozessen beteiligt, darunter Zellteilung, Differenzierung und die Reaktion auf abiotische und biotische Stressfaktoren (Killiny und Nehela, 2020). Sie können als Antioxidantien wirken, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) abfangen, die Redox-Homöostase aufrechterhalten (Nehela und Killiny, 2023), Abwehrgene induzieren (Romero et al., 2018), verschiedene Stoffwechselwege regulieren (Nehela und Killiny, 2023), endogene Phytohormone modulieren (Nehela und Killiny, 2019), systemische erworbene Resistenz (SAR) etablieren und die Interaktion zwischen Pflanzen und Pathogenen regulieren (Nehela und Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Es ist anzumerken, dass die spezifischen Mechanismen und Funktionen von Polyaminen (PA) in der Pflanzenabwehr je nach Pflanzenart, Pathogen und Umweltbedingungen variieren. Das am häufigsten vorkommende PA in Pflanzen wird aus dem essentiellen Polyamin L-Ornithin biosynthetisiert (Killiny und Nehela, 2020).
L-Ornithin spielt vielfältige Rollen im Pflanzenwachstum und in der Pflanzenentwicklung. So zeigten frühere Studien, dass Ornithin in Reis (Oryza sativa) mit dem Stickstoffrecycling (Liu et al., 2018), dem Reisertrag, der Qualität und dem Aroma (Lu et al., 2020) sowie der Reaktion auf Wasserstress (Yang et al., 2000) in Zusammenhang stehen kann. Darüber hinaus verbesserte die exogene Anwendung von L-Ornithin die Trockentoleranz in Zuckerrüben (Beta vulgaris) signifikant (Hussein et al., 2019) und linderte Salzstress in Zwiebeln (Allium cepa) (Çavuşoǧlu und Çavuşoǧlu, 2021) und Cashewnüssen (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Die potenzielle Rolle von L-Ornithin bei der Abwehr abiotischer Stressfaktoren könnte auf seine Beteiligung an der Prolinakkumulation in behandelten Pflanzen zurückzuführen sein. Beispielsweise wurde bereits berichtet, dass Gene des Prolinstoffwechsels, wie die Gene für Ornithin-Delta-Aminotransferase (Delta-OAT) und Prolin-Dehydrogenase (ProDH1 und ProDH2), an der Abwehr von Nicotiana benthamiana und Arabidopsis thaliana gegen nicht-wirtsspezifische Stämme von Pseudomonas syringae beteiligt sind (Senthil-Kumar und Mysore, 2012). Andererseits ist die fungale Ornithin-Decarboxylase (ODC) für das Wachstum des Pathogens erforderlich (Singh et al., 2020). Die gezielte Hemmung der ODC von Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici mittels wirtinduzierter Genstilllegung (HIGS) erhöhte die Resistenz von Tomatenpflanzen gegen Fusarium-Welke signifikant (Singh et al., 2020). Die potenzielle Rolle einer exogenen Ornithinapplikation gegen biotische Stressfaktoren wie Phytopathogene ist jedoch noch nicht ausreichend erforscht. Noch wichtiger ist, dass die Auswirkungen von Ornithin auf die Krankheitsresistenz und die damit verbundenen biochemischen und physiologischen Phänomene weitgehend unerforscht sind.
Das Verständnis der komplexen Infektion von Leguminosen durch Sclerotinia sclerotiorum ist wichtig für die Entwicklung effektiver Bekämpfungsstrategien. Ziel dieser Studie war es, die potenzielle Rolle des Diamins L-Ornithin als Schlüsselfaktor für die Stärkung der Abwehrmechanismen und die Resistenz von Leguminosen gegenüber Sclerotinia sclerotiorum zu identifizieren. Wir vermuten, dass L-Ornithin neben der Stärkung der Abwehrreaktionen infizierter Pflanzen auch eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung des Redoxstatus spielt. Wir nehmen an, dass die potenziellen Wirkungen von L-Ornithin mit der Regulation enzymatischer und nicht-enzymatischer antioxidativer Abwehrmechanismen sowie mit der Beeinflussung von Pathogenitäts-/Virulenzfaktoren und assoziierten Proteinen des Pilzes zusammenhängen. Diese duale Funktionalität macht L-Ornithin zu einem vielversprechenden Kandidaten für eine nachhaltige Strategie zur Minderung der Auswirkungen von Weißschimmel und zur Steigerung der Resistenz gängiger Leguminosenarten gegenüber diesem potenten Pilzpathogen. Die Ergebnisse dieser Studie können zur Entwicklung innovativer, umweltfreundlicher Methoden zur Bekämpfung von Weißschimmel und zur Minderung seiner Auswirkungen auf die Leguminosenproduktion beitragen.
In dieser Studie wurde die anfällige Handelssorte der Gartenbohne, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), als Versuchsmaterial verwendet. Gesundes Saatgut wurde freundlicherweise von der Abteilung für Hülsenfruchtforschung des Instituts für Feldfrüchteforschung (FCRI) des Landwirtschaftlichen Forschungszentrums (ARC) in Ägypten zur Verfügung gestellt. Fünf Samen wurden in Plastiktöpfe (Innendurchmesser 35 cm, Tiefe 50 cm) mit Sclerotinia sclerotiorum-infizierter Erde unter Gewächshausbedingungen (25 ± 2 °C, relative Luftfeuchtigkeit 75 ± 1 %, 8 h Licht/16 h Dunkelheit) ausgesät. 7–10 Tage nach der Aussaat wurden die Sämlinge vereinzelt, sodass in jedem Topf nur noch zwei gleichmäßig gewachsene Sämlinge mit drei voll entwickelten Blättern verblieben. Alle Topfpflanzen wurden alle zwei Wochen gegossen und monatlich mit der für die jeweilige Sorte empfohlenen Menge gedüngt.
Zur Herstellung einer 500 mg/L-Konzentration von L-Ornithindiamin (auch bekannt als (+)-(S)-2,5-Diaminopentansäure; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland) wurden zunächst 50 mg in 100 mL sterilem destilliertem Wasser gelöst. Die Stammlösung wurde anschließend verdünnt und in den nachfolgenden Experimenten verwendet. Insgesamt wurden sechs Reihen von L-Ornithin-Konzentrationen (12,5, 25, 50, 75, 100 und 125 mg/L) in vitro getestet. Zusätzlich wurde steriles destilliertes Wasser als Negativkontrolle (Mock) und das kommerzielle Fungizid „Rizolex-T“ 50%iges Netzmittelpulver (20 % Toclofos-methyl + 30 % Thiram; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gouvernement Gharbia, Ägypten) als Positivkontrolle verwendet. Das kommerzielle Fungizid „Rizolex-T“ wurde in vitro in fünf Konzentrationen (2, 4, 6, 8 und 10 mg/L) getestet.
Proben von Stängeln und Hülsen der Gartenbohne mit typischen Symptomen von Weißschimmel (Befallsrate: 10–30 %) wurden von landwirtschaftlichen Betrieben entnommen. Obwohl die meisten infizierten Pflanzenteile nach Art/Sorte identifiziert werden konnten (anfällige Handelssorte Giza 3), waren andere, insbesondere solche von lokalen Märkten, unbekannter Art. Die gesammelten infizierten Materialien wurden zunächst 3 Minuten lang mit 0,5%iger Natriumhypochloritlösung oberflächlich desinfiziert, anschließend mehrmals mit sterilem destilliertem Wasser gespült und mit sterilem Filterpapier trocken getupft, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Die infizierten Organe wurden dann aus dem mittleren Gewebe (zwischen gesundem und infiziertem Gewebe) in kleine Stücke geschnitten, auf Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) kultiviert und 5 Tage lang bei 25 ± 2 °C und einem 12-Stunden-Hell-/12-Stunden-Dunkel-Zyklus inkubiert, um die Sklerotienbildung anzuregen. Die Myzelspitzenmethode wurde auch zur Reinigung von Pilzisolaten aus Mischkulturen oder kontaminierten Kulturen eingesetzt. Das gereinigte Pilzisolat wurde zunächst anhand seiner kulturellen morphologischen Merkmale identifiziert und anschließend mikroskopisch als *S. sclerotiorum* bestätigt. Abschließend wurden alle gereinigten Isolate auf ihre Pathogenität an der anfälligen Bohnensorte *Giza 3* getestet, um die Koch’schen Postulate zu erfüllen.
Darüber hinaus wurde das invasivste S. sclerotiorum-Isolat (Isolat Nr. 3) mittels ITS-Sequenzierung (Internal Transcribed Spacer) gemäß White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017, bestätigt. Kurz gesagt, die Isolate wurden in Kartoffel-Dextrose-Bouillon (PDB) kultiviert und 5–7 Tage bei 25 ± 2 °C inkubiert. Anschließend wurde das Pilzmyzel geerntet, durch Gaze filtriert, zweimal mit sterilem Wasser gewaschen und mit sterilem Filterpapier getrocknet. Die genomische DNA wurde mit dem Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024) isoliert. Die ITS-rDNA-Region wurde anschließend mit dem spezifischen Primerpaar ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; erwartete Größe: 540 bp) amplifiziert (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Die gereinigten PCR-Produkte wurden zur Sequenzierung eingesandt (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Die ITS-rDNA-Sequenzen wurden bidirektional mittels Sanger-Sequenzierung sequenziert. Die resultierenden Sequenzen wurden anschließend mit den neuesten Daten in GenBank und dem National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) mithilfe der BLASTn-Software verglichen. Die Abfragesequenz wurde mit 20 weiteren S. sclerotiorum-Stämmen/Isolaten aus den neuesten Daten der NCBI GenBank (Ergänzungstabelle S1) mittels ClustalW im Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; Version 11) (Kumar et al., 2024) verglichen. Die evolutionäre Analyse erfolgte mittels Maximum-Likelihood-Methode und dem allgemeinen zeitumkehrbaren Nukleotidsubstitutionsmodell (Nei und Kumar, 2000). Der Baum mit der höchsten Log-Likelihood ist dargestellt. Der Ausgangsbaum für die heuristische Suche wurde durch Auswahl des Baums mit der höheren Log-Likelihood aus dem Neighbor-Joining-Baum (NJ-Baum) (Kumar et al., 2024) und dem Maximum-Parsimony-Baum (MP-Baum) bestimmt. Der NJ-Baum wurde anhand einer paarweisen Distanzmatrix erstellt, die mit dem allgemeinen zeitumkehrbaren Modell berechnet wurde (Nei und Kumar, 2000).
Die antibakterielle Aktivität von L-Ornithin und des Bakterizids „Rizolex-T“ wurde in vitro mittels Agardiffusionstest bestimmt. Methode: Eine geeignete Menge der L-Ornithin-Stammlösung (500 mg/L) wurde mit 10 ml PDA-Nährmedium gründlich vermischt, um Lösungen mit Endkonzentrationen von 12,5, 25, 50, 75, 100 und 125 mg/L herzustellen. Fünf Konzentrationen des Fungizids „Rizolex-T“ (2, 4, 6, 8 und 10 mg/L) sowie steriles destilliertes Wasser dienten als Kontrollen. Nach dem Erstarren des Mediums wurde ein frisch präparierter Myzelpfropfen einer Sclerotinia sclerotiorum-Kultur (4 mm Durchmesser) in die Mitte einer Petrischale gegeben und bei 25 ± 2 °C kultiviert, bis das Myzel die gesamte Petrischale bedeckte. Anschließend wurde das Pilzwachstum dokumentiert. Berechnen Sie die prozentuale Hemmung des radialen Wachstums von S. sclerotiorum mithilfe von Gleichung 1:
Das Experiment wurde zweimal wiederholt, mit jeweils sechs biologischen Replikaten pro Kontroll-/Versuchsgruppe und fünf Töpfen (zwei Pflanzen pro Topf) pro biologischem Replikat. Jedes biologische Replikat wurde zweimal analysiert (zwei technische Replikate), um die Genauigkeit, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Zusätzlich wurde eine Probit-Regressionsanalyse durchgeführt, um die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) und die IC99 zu berechnen (Prentice, 1976).
Um das Potenzial von L-Ornithin unter Gewächshausbedingungen zu untersuchen, wurden zwei aufeinanderfolgende Topfversuche durchgeführt. Die Töpfe wurden mit sterilisierter Ton-Sand-Erde (3:1) befüllt und mit einer frisch angelegten Kultur von S. sclerotiorum beimpft. Zunächst wurde das invasivste Isolat von S. sclerotiorum (Isolat Nr. 3) kultiviert, indem ein Sklerotium halbiert, mit der Schnittfläche nach unten auf PDA gelegt und vier Tage lang bei 25 °C im Dunkeln (24 h) inkubiert wurde, um das Myzelwachstum anzuregen. Anschließend wurden vier Agar-Stücke mit 5 mm Durchmesser vom Rand entnommen und mit 100 g einer sterilen Mischung aus Weizen- und Reiskleie (1:1, v/v) beimpft. Alle Gefäße wurden fünf Tage lang bei 25 ± 2 °C unter einem 12-Stunden-Hell-/12-Stunden-Dunkel-Zyklus inkubiert, um die Sklerotienbildung zu fördern. Der Inhalt aller Kolben wurde vor dem Hinzufügen der Erde gründlich vermischt, um eine homogene Mischung zu gewährleisten. Anschließend wurden 100 g der kolonisierenden Kleiemischung in jeden Topf gegeben, um eine konstante Pathogenkonzentration sicherzustellen. Die beimpften Töpfe wurden bewässert, um das Pilzwachstum anzuregen, und für 7 Tage unter Gewächshausbedingungen gestellt.
In jeden Topf wurden fünf Samen der Sorte Giza 3 ausgesät. Die sterilisierten Samen der mit L-Ornithin und dem Fungizid Rizolex-T behandelten Töpfe wurden zunächst zwei Stunden in einer wässrigen Lösung der beiden Substanzen mit einer IC99-Endkonzentration von ca. 250 mg/l bzw. 50 mg/l eingeweicht und anschließend eine Stunde an der Luft getrocknet. Die Samen der Kontrollgruppe wurden hingegen in sterilem destilliertem Wasser eingeweicht. Nach zehn Tagen, vor der ersten Bewässerung, wurden die Sämlinge vereinzelt, sodass in jedem Topf nur noch zwei gesunde Sämlinge verblieben. Um eine Infektion mit Sclerotinia sclerotiorum zu gewährleisten, wurden außerdem Bohnenpflanzenstängel im gleichen Entwicklungsstadium (10 Tage) an zwei verschiedenen Stellen mit einem sterilen Skalpell eingeschnitten. In jede Wunde wurden ca. 0,5 g der kolonisierenden Kleiemischung gegeben. Anschließend wurde die Luftfeuchtigkeit erhöht, um die Infektion und Krankheitsentwicklung in allen inokulierten Pflanzen zu fördern. Die Kontrollpflanzen wurden auf ähnliche Weise verletzt und jeweils 0,5 g einer sterilen, nicht besiedelten Kleiemischung in die Wunde gegeben. Anschließend wurden sie unter hoher Luftfeuchtigkeit gehalten, um die Bedingungen für die Krankheitsentwicklung zu simulieren und die Vergleichbarkeit der Behandlungsgruppen zu gewährleisten.
Behandlungsmethode: Bohnensämlinge wurden mit 500 ml einer wässrigen Lösung von L-Ornithin (250 mg/l) oder des Fungizids Rizolex-T (50 mg/l) durch Bewässerung des Bodens gegossen. Die Behandlung wurde dreimal im Abstand von 10 Tagen wiederholt. Die Placebo-Kontrollen wurden mit 500 ml sterilem destilliertem Wasser bewässert. Alle Behandlungen wurden unter Gewächshausbedingungen (25 ± 2 °C, 75 ± 1 % relative Luftfeuchtigkeit, 8 h Licht/16 h Dunkelheit) durchgeführt. Die Töpfe wurden alle zwei Wochen gegossen und monatlich mit einem ausgewogenen NPK-Dünger (20-20-20, mit 3,6 % Schwefel und Spurenelementen; Zain Seeds, Ägypten) in einer Konzentration von 3–4 g/l durch Blattdüngung gemäß den Empfehlungen für die jeweilige Sorte und den Anweisungen des Herstellers behandelt. Sofern nicht anders angegeben, wurden von jeder biologischen Replikation 72 Stunden nach der Behandlung (hpt) vollständig entwickelte, reife Blätter (das zweite und dritte Blatt von oben) gesammelt, homogenisiert, vereinigt und bei -80 °C für weitere Analysen gelagert, darunter, aber nicht beschränkt auf die in situ histochemische Lokalisierung von Indikatoren für oxidativen Stress, Lipidperoxidation, enzymatischen und nicht-enzymatischen Antioxidantien und Genexpression.
Die Intensität des Weißschimmelbefalls wurde 21 Tage nach der Inokulation (dpi) wöchentlich anhand einer Skala von 1–9 (Ergänzungstabelle S2) bewertet, die auf der Petzoldt- und Dickson-Skala (1996) in der von Teran et al. (2006) modifizierten Fassung basiert. Kurz gesagt, wurden die Stängel und Zweige der Bohnenpflanzen ab der Inokulationsstelle untersucht, um die Ausbreitung der Läsionen entlang der Internodien und Knoten zu verfolgen. Anschließend wurde der Abstand der Läsion von der Inokulationsstelle bis zum entferntesten Punkt am Stängel oder Zweig gemessen und je nach Lage der Läsion ein Wert von 1–9 vergeben, wobei (1) keine sichtbare Infektion in der Nähe der Inokulationsstelle und (2–9) eine allmähliche Zunahme der Läsionsgröße und deren Ausbreitung entlang der Knoten/Internodien anzeigte (Ergänzungstabelle S2). Die Intensität des Weißschimmelbefalls wurde dann mithilfe von Formel 2 in Prozent umgerechnet.
Zusätzlich wurde die Fläche unter der Krankheitsverlaufskurve (AUDPC) mit Hilfe der Formel (Shaner und Finney, 1977) berechnet, die kürzlich für die Weißfäule der Gartenbohne (Chauhan et al., 2020) unter Verwendung der Gleichung 3 angepasst wurde:
Dabei bezeichnet Yi den Krankheitsbefall zum Zeitpunkt ti, Yi+1 den Krankheitsbefall zum Folgezeitpunkt ti+1, ti den Zeitpunkt der ersten Messung (in Tagen), ti+1 den Zeitpunkt der nächsten Messung (in Tagen) und n die Gesamtzahl der Messpunkte. Wachstumsparameter der Bohnenpflanzen, darunter Pflanzenhöhe (cm), Anzahl der Seitentriebe pro Pflanze und Anzahl der Blätter pro Pflanze, wurden in allen biologischen Replikaten über 21 Tage wöchentlich erfasst.
In jeder biologischen Replikation wurden am 45. Tag nach der Behandlung (15 Tage nach der letzten Behandlung) Blattproben (zweites und drittes voll entwickeltes Blatt von oben) entnommen. Jede biologische Replikation umfasste fünf Töpfe (zwei Pflanzen pro Topf). Etwa 500 mg des zerkleinerten Pflanzengewebes wurden zur Extraktion der Photosynthesepigmente (Chlorophyll a, Chlorophyll b und Carotinoide) mit 80%igem Aceton bei 4 °C im Dunkeln verwendet. Nach 24 Stunden wurden die Proben zentrifugiert und der Überstand zur kolorimetrischen Bestimmung des Chlorophyll-a-, Chlorophyll-b- und Carotinoidgehalts mit einem UV-160A-Spektralphotometer (Shimadzu Corporation, Japan) nach der Methode von Lichtenthaler (1987) durch Messung der Absorption bei drei verschiedenen Wellenlängen (A470, A646 und A663 nm) verwendet. Schließlich wurde der Gehalt an photosynthetischen Pigmenten unter Verwendung der folgenden Formeln 4–6 berechnet, die von Lichtenthaler (1987) beschrieben wurden.
72 Stunden nach der Behandlung (hpt) wurden von jeder biologischen Replikation Blätter (das zweite und dritte vollständig entwickelte Blatt von oben) für die in-situ-histochemische Lokalisierung von Wasserstoffperoxid (H₂O₂) und Superoxidanionen (O₂•⁻) entnommen. Jede biologische Replikation umfasste fünf Töpfe (zwei Pflanzen pro Topf). Jede biologische Replikation wurde in doppelter Ausführung (zwei technische Replikate) analysiert, um die Genauigkeit, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Methode zu gewährleisten. H₂O₂ und O₂•⁻ wurden mit 0,1 % 3,3′-Diaminobenzidin (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland) bzw. Nitroblautetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland) nach den von Romero-Puertas et al. (2004) und Adam et al. (1989) beschriebenen Methoden mit geringfügigen Modifikationen bestimmt. Zur histochemischen Lokalisierung von H₂O₂ in situ wurden die Segel mit 0,1 % DAB in 10 mM Tris-Puffer (pH 7,8) vakuuminfiltriert und anschließend 60 min bei Raumtemperatur unter Lichteinwirkung inkubiert. Die Segel wurden in 0,15 % (v/v) TCA in 4:1 (v/v) Ethanol:Chloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Ägypten) gebleicht und anschließend bis zur Dunkelfärbung belichtet. Analog wurden die Klappen zur histochemischen Lokalisierung von O₂•⁻ in situ mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,8), der 0,1 (w/v) HBT enthielt, vakuuminfiltriert. Die Segel wurden 20 min bei Raumtemperatur unter Lichteinwirkung inkubiert, anschließend wie oben beschrieben gebleicht und dann bis zum Auftreten dunkelblauer/violetter Flecken belichtet. Die Intensität der resultierenden braunen (als H2O2-Indikator) bzw. blauvioletten (als O2•−-Indikator) Farbe wurde mit Hilfe der Fiji-Version des Bildverarbeitungspakets ImageJ (http://fiji.sc; abgerufen am 7. März 2024) beurteilt.
Malondialdehyd (MDA; als Marker für Lipidperoxidation) wurde nach der Methode von Du und Bramlage (1992) mit leichten Modifikationen bestimmt. Blätter jeder biologischen Replikation (zweites und drittes voll entwickeltes Blatt von oben) wurden 72 Stunden nach der Behandlung (hpt) geerntet. Jede biologische Replikation umfasste fünf Töpfe (zwei Pflanzen pro Topf). Jede biologische Replikation wurde in doppelter Ausführung (zwei technische Replikate) analysiert, um die Genauigkeit, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Methode zu gewährleisten. Kurz gesagt, wurden 0,5 g gemahlenes Blattgewebe für die MDA-Extraktion mit 20%iger Trichloressigsäure (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) verwendet, die 0,01% Butylhydroxytoluol (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) enthielt. Der MDA-Gehalt im Überstand wurde anschließend kolorimetrisch durch Messung der Absorption bei 532 und 600 nm mit einem UV-160A Spektralphotometer (Shimadzu Corporation, Japan) bestimmt und dann als nmol g−1 FW ausgedrückt.
Zur Bestimmung nicht-enzymatischer und enzymatischer Antioxidantien wurden 72 Stunden nach der Behandlung (hpt) von jeder biologischen Replikation die Blätter (zweites und drittes voll entwickeltes Blatt von oben) geerntet. Jede biologische Replikation umfasste fünf Töpfe (zwei Pflanzen pro Topf). Jede biologische Probe wurde doppelt analysiert (zwei technische Proben). Zwei Blätter wurden mit flüssigem Stickstoff vermahlen und direkt zur Bestimmung enzymatischer und nicht-enzymatischer Antioxidantien, der Gesamtaminosäuren, des Prolingehalts, der Genexpression und der Oxalatkonzentration verwendet.
Die Gesamtmenge an löslichen Phenolen wurde mit dem Folin-Ciocalteu-Reagenz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) nach einer leicht modifizierten Methode von Kahkonen et al. (1999) bestimmt. Kurz gesagt, wurden ca. 0,1 g homogenisiertes Blattgewebe mit 20 ml 80%igem Methanol 24 h im Dunkeln extrahiert. Der Überstand wurde nach der Zentrifugation abgenommen. 0,1 ml des Extrakts wurden mit 0,5 ml Folin-Ciocalteu-Reagenz (10%) vermischt, 30 s lang geschüttelt und 5 min im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden 0,5 ml einer 20%igen Natriumcarbonatlösung (Na₂CO₃; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kairo, Ägypten) zugegeben, gründlich vermischt und 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Absorption der Reaktionsmischung bei 765 nm mit einem UV-160A-Spektralphotometer (Shimadzu Corporation, Japan) gemessen. Die Konzentration der gesamten löslichen Phenole in den Probenextrakten wurde mithilfe einer Gallussäure-Kalibrierkurve (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) bestimmt und als Milligramm Gallussäure-Äquivalent pro Gramm Frischgewicht (mg GAE g⁻¹ Frischgewicht) angegeben.
Der Gesamtgehalt an löslichen Flavonoiden wurde nach der Methode von Djeridane et al. (2006) mit leichten Modifikationen bestimmt. Kurz gesagt, wurden 0,3 ml des oben genannten Methanolextrakts mit 0,3 ml einer 5%igen Aluminiumchloridlösung (AlCl₃; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) vermischt, kräftig gerührt und anschließend 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 0,3 ml einer 10%igen Kaliumacetatlösung (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Ägypten) hinzugegeben, gründlich vermischt und 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Absorption der Reaktionsmischung bei 430 nm mit einem UV-160A-Spektralphotometer (Shimadzu Corporation, Japan) gemessen. Die Konzentration der gesamten löslichen Flavonoide in den Probenextrakten wurde mithilfe einer Rutin-Kalibrierungskurve (TCI America, Portland, OR, USA) bestimmt und anschließend als Milligramm Rutin-Äquivalent pro Gramm Frischgewicht (mg RE g-1 Frischgewicht) ausgedrückt.
Der Gesamtgehalt an freien Aminosäuren in Bohnenblättern wurde mit einem modifizierten Ninhydrin-Reagenz (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) nach der Methode von Yokoyama und Hiramatsu (2003), modifiziert von Sun et al. (2006), bestimmt. Kurz gesagt, wurden 0,1 g gemahlenes Gewebe mit pH-5,4-Puffer extrahiert. 200 μL des Überstands wurden mit 200 μL Ninhydrin (2 %) und 200 μL Pyridin (10 %; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA) versetzt, 30 min in einem kochenden Wasserbad inkubiert, anschließend abgekühlt und die Absorption bei 580 nm mit einem UV-160A-Spektralphotometer (Shimadzu Corporation, Japan) gemessen. Prolin wurde hingegen nach der Bates-Methode (Bates et al., 1973) bestimmt. Prolin wurde mit 3%iger Sulfosalicylsäure (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) extrahiert. Nach der Zentrifugation wurden 0,5 ml des Überstands mit 1 ml Eisessig (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) und Ninhydrin-Reagenz versetzt, 45 min bei 90 °C inkubiert, abgekühlt und die Absorption bei 520 nm mit demselben Spektralphotometer wie oben beschrieben gemessen. Die Gesamtmenge an freien Aminosäuren und Prolin in den Blattextrakten wurde anhand von Glycin- bzw. Prolin-Kalibrierkurven (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) bestimmt und als mg/g Frischgewicht angegeben.
Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von antioxidativen Enzymen wurden ca. 500 mg homogenisiertes Gewebe mit 3 ml 50 mM Tris-Puffer (pH 7,8) extrahiert, der 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) und 7,5 % Polyvinylpyrrolidon (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) enthielt. Anschließend wurde 20 min bei 10.000 × g unter Kühlung (4 °C) zentrifugiert und der Überstand (Rohenzymextrakt) gesammelt (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Katalase (CAT) wurde anschließend mit 2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) und 100 μl 269 mM H₂O₂-Lösung umgesetzt, um ihre enzymatische Aktivität nach der Methode von Aebi (1984) mit leichten Modifikationen (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) zu bestimmen. Die Aktivität der Guajakol-abhängigen Peroxidase (POX) wurde nach der Methode von Harrach et al. (2009) bestimmt. Die enzymatische Aktivität der Polyphenoloxidase (PPO) wurde nach der Methode von El-Nagar et al. (2008) mit geringfügigen Modifikationen (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) bestimmt. Dazu wurde eine Reaktion mit 2,2 ml 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0), 100 μl Guajacol (TCI Chemicals, Portland, OR, USA) und 100 μl 12 mM H₂O₂ durchgeführt. Die Methode wurde leicht modifiziert (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Der Test erfolgte nach der Reaktion mit 3 ml einer frisch in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0) hergestellten Catechollösung (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M). Die CAT-Aktivität wurde durch Überwachung der Zersetzung von H2O2 bei 240 nm (A240) gemessen, die POX-Aktivität durch Überwachung des Anstiegs der Absorption bei 436 nm (A436) und die PPO-Aktivität durch Aufzeichnung der Absorptionsschwankungen bei 495 nm (A495) alle 30 s über 3 min mit einem UV-160A Spektralphotometer (Shimadzu, Japan).
Mithilfe der Real-Time-RT-PCR wurden die Transkriptspiegel dreier antioxidativer Gene – Peroxisomenkatalase (PvCAT1; GenBank-Zugangsnummer KF033307.1), Superoxiddismutase (PvSOD; GenBank-Zugangsnummer XM_068639556.1) und Glutathionreduktase (PvGR; GenBank-Zugangsnummer KY195009.1) – in Bohnenblättern (dem zweiten und dritten voll entwickelten Blatt von oben) 72 Stunden nach der letzten Behandlung bestimmt. Kurz gesagt, wurde die RNA mit dem Simply P Total RNA Extraction Kit (Kat.-Nr. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) gemäß Herstellerangaben isoliert. Anschließend wurde cDNA mit dem TOP script™ cDNA Synthesis Kit gemäß Herstellerangaben synthetisiert. Die Primersequenzen der drei Gene sind in der ergänzenden Tabelle S3 aufgeführt. PvActin-3 (GenBank-Zugangsnummer: XM_068616709.1) wurde als Haushaltsgen verwendet, und die relative Genexpression wurde mittels der 2-ΔΔCT-Methode berechnet (Livak und Schmittgen, 2001). Die Stabilität von Aktin unter biotischem Stress (inkompatible Interaktion zwischen Leguminosen und dem Anthraknosepilz Colletotrichum lindemuthianum) und abiotischem Stress (Trockenheit, Salinität, niedrige Temperatur) wurde nachgewiesen (Borges et al., 2012).
Zunächst führten wir eine genomweite In-silico-Analyse der Oxalacetat-Acetylhydrolase (OAH)-Proteine ​​in S. sclerotiorum mithilfe des Protein-Protein-BLAST-Tools (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) durch. Kurz gesagt, verwendeten wir OAH aus Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; Taxide: 1191702; GenBank-Zugangsnummer XP_040799428.1; 342 Aminosäuren) und Penicillium lagena (PlOAH; Taxide: 94218; GenBank-Zugangsnummer XP_056833920.1; 316 Aminosäuren) als Suchsequenzen, um das homologe Protein in S. sclerotiorum (Taxide: 5180) zu kartieren. BLASTp wurde gegen die aktuellsten verfügbaren Genomdaten von S. sclerotiorum in GenBank auf der Website des National Center for Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/, durchgeführt.
Zusätzlich wurden das vorhergesagte OAH-Gen aus S. sclerotiorum (SsOAH) sowie die Evolutionsanalyse und der phylogenetische Baum von AfOAH aus A. fijiensis CBS 313.89 und PlOAH aus P. lagena mithilfe der Maximum-Likelihood-Methode in MEGA11 (Tamura et al., 2021) und dem JTT-Matrix-basierten Modell (Jones et al., 1992) abgeleitet. Der phylogenetische Baum wurde mit der multiplen Sequenzanalyse der Proteinsequenzen aller vorhergesagten OAH-Gene (SsOAH) aus S. sclerotiorum und der Abfragesequenz mithilfe des Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos und Agarwala, 2007) kombiniert. Zusätzlich wurden die am besten passenden Aminosäuresequenzen von SsOAH aus S. sclerotiorum mit den Abfragesequenzen (AfOAH und PlOAH) (Larkin et al., 2007) unter Verwendung von ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) aligniert, und konservierte Regionen im Alignment wurden mit dem ESPript-Tool (Version 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) visualisiert.
Des Weiteren wurden die vorhergesagten funktionellen repräsentativen Domänen und konservierten Bereiche von S. sclerotiorum SsOAH mithilfe des InterPro-Tools (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) interaktiv in verschiedene Familien klassifiziert (Blum et al., 2021). Abschließend wurde die dreidimensionale (3D) Struktur des vorhergesagten S. sclerotiorum SsOAH mithilfe der Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2-Server Version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) modelliert (Kelley et al., 2015) und mit dem SWISS-MODEL-Server (https://swissmodel.expasy.org/) validiert (Biasini et al., 2014). Die vorhergesagten dreidimensionalen Strukturen (PDB-Format) wurden interaktiv mit Hilfe des UCSF-Chimera-Pakets (Version 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) visualisiert (Pettersen et al., 2004).
Die quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR wurde zur Bestimmung der Transkriptionsrate der Oxalacetat-Acetylhydrolase (SsOAH; GenBank-Zugangsnummer: XM_001590428.1) im Myzel von Sclerotinia sclerotiorum eingesetzt. Dazu wurde S. sclerotiorum in einen Kolben mit PDB-Medium inokuliert und in einem Schüttelinkubator (Modell: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) bei 25 ± 2 °C für 24 h bei 150 U/min und im Dunkeln inkubiert, um das Myzelwachstum anzuregen. Anschließend wurden die Zellen mit L-Ornithin und dem Fungizid Rizolex-T in IC50-Konzentrationen (ca. 40 bzw. 3,2 mg/L) behandelt und weitere 24 h unter denselben Bedingungen kultiviert. Nach der Inkubation wurden die Kulturen 5 min bei 2500 U/min zentrifugiert und der Überstand (Pilzmyzel) für die Genexpressionsanalyse gesammelt. Ebenso wurde Pilzmyzel 0, 24, 48, 72, 96 und 120 h nach der Infektion von infizierten Pflanzen gewonnen, die auf der Oberfläche des infizierten Gewebes weißen Schimmel und watteartiges Myzel gebildet hatten. RNA wurde aus dem Pilzmyzel extrahiert und anschließend cDNA wie oben beschrieben synthetisiert. Die Primersequenzen für SsOAH sind in der ergänzenden Tabelle S3 aufgeführt. SsActin (GenBank-Zugangsnummer: XM_001589919.1) diente als Haushaltsgen, und die relative Genexpression wurde mit der 2^-ΔΔCT-Methode berechnet (Livak und Schmittgen, 2001).
Oxalsäure wurde in Kartoffel-Dextrose-Bouillon (PDB) und Pflanzenproben, die den Pilzpathogen Sclerotinia sclerotiorum enthielten, nach der Methode von Xu und Zhang (2000) mit leichten Modifikationen bestimmt. Kurz gesagt, wurden S. sclerotiorum-Isolate in Kolben mit PDB inokuliert und anschließend in einem Schüttelinkubator (Modell I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) bei 150 U/min und 25 ± 2 °C für 3–5 Tage (24 h) im Dunkeln kultiviert, um das Myzelwachstum anzuregen. Nach der Inkubation wurde die Pilzkultur zunächst durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 filtriert und anschließend 5 min bei 2500 U/min zentrifugiert, um restliches Myzel zu entfernen. Der Überstand wurde abgenommen und bei 4 °C für die spätere quantitative Oxalatbestimmung gelagert. Zur Aufbereitung der Pflanzenproben wurden jeweils ca. 0,1 g Pflanzengewebefragmente dreimal mit destilliertem Wasser (jeweils 2 ml) extrahiert. Anschließend wurden die Proben 5 min bei 2500 U/min zentrifugiert, der Überstand durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 trocken filtriert und für weitere Analysen gesammelt.
Zur quantitativen Analyse von Oxalsäure wurde die Reaktionsmischung in einem Glasröhrchen mit Stopfen wie folgt hergestellt: 0,2 ml Probe (oder PDB-Kulturfiltrat bzw. Oxalsäure-Standardlösung), 0,11 ml Bromphenolblau (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml 1 M Schwefelsäure (H₂SO₄; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Ägypten) und 0,176 ml 100 mM Kaliumdichromat (K₂Cr₂O₇; TCI Chemicals, Portland, OR, USA). Anschließend wurde die Lösung mit destilliertem Wasser auf 4,8 ml verdünnt, kräftig gemischt und sofort in ein 60 °C warmes Wasserbad gestellt. Nach 10 min wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,5 ml Natriumhydroxidlösung (NaOH; 0,75 M) gestoppt. Die Extinktion (A600) der Reaktionsmischung wurde bei 600 nm mit einem UV-160-Spektralphotometer (Shimadzu Corporation, Japan) gemessen. PDB und destilliertes Wasser dienten als Kontrollen für die Quantifizierung von Kulturfiltraten bzw. Pflanzenproben. Die Oxalsäurekonzentrationen in den Kulturfiltraten, angegeben als Mikrogramm Oxalsäure pro Milliliter PDB-Medium (μg·mL−1), und in den Blattextrakten, angegeben als Mikrogramm Oxalsäure pro Gramm Frischgewicht (μg·g−1 FG), wurden mithilfe einer Oxalsäure-Kalibrierkurve (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) bestimmt.
Die gesamte Studie wurde in einem vollständig randomisierten Design (CRD) mit sechs biologischen Replikaten pro Behandlung und fünf Töpfen pro biologischem Replikat (zwei Pflanzen pro Topf) durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Biologische Replikate wurden doppelt analysiert (zwei technische Replikate). Die technischen Replikate dienten der Überprüfung der Reproduzierbarkeit des jeweiligen Experiments, wurden aber nicht in die statistische Analyse einbezogen, um Scheinreplikationen zu vermeiden. Die Daten wurden mittels Varianzanalyse (ANOVA) und anschließendem Tukey-Kramer-HSD-Test (p ≤ 0,05) statistisch analysiert. Für die In-vitro-Experimente wurden die IC50- und IC99-Werte mithilfe des Probit-Modells berechnet und 95%-Konfidenzintervalle ermittelt.
Insgesamt wurden vier Isolate von verschiedenen Sojabohnenfeldern im Gouvernement El Ghabiya, Ägypten, gesammelt. Auf PDA-Medium bildeten alle Isolate ein cremeweißes Myzel, das rasch watteartig weiß wurde (Abb. 1A) und im Sklerotienstadium beige oder braun. Die Sklerotien sind in der Regel dicht, schwarz, kugelförmig oder unregelmäßig geformt, 5,2 bis 7,7 mm lang und 3,4 bis 5,3 mm im Durchmesser (Abb. 1B). Obwohl alle vier Isolate nach 10–12 Tagen Inkubation bei 25 ± 2 °C ein randständiges Sklerotienmuster am Kulturmediumrand entwickelten (Abb. 1A), unterschied sich die Anzahl der Sklerotien pro Petrischale signifikant (P < 0,001), wobei Isolat 3 die höchste Anzahl an Sklerotien aufwies (32,33 ± 1,53 Sklerotien pro Petrischale; Abb. 1C). Ebenso produzierte Isolat Nr. 3 in PDB mehr Oxalsäure als andere Isolate (3,33 ± 0,49 μg mL⁻¹; Abb. 1D). Isolat Nr. 3 wies typische morphologische und mikroskopische Merkmale des phytopathogenen Pilzes Sclerotinia sclerotiorum auf. So wuchsen die Kolonien von Isolat Nr. 3 auf PDA schnell, waren cremeweiß (Abb. 1A), umgekehrt beige oder hell lachsgelbbraun und benötigten 6–7 Tage bei 25 ± 2 °C, um die Oberfläche einer Petrischale mit 9 cm Durchmesser vollständig zu bedecken. Aufgrund dieser morphologischen und mikroskopischen Merkmale wurde Isolat Nr. 3 als Sclerotinia sclerotiorum identifiziert.
Abbildung 1. Eigenschaften und Pathogenität von S. sclerotiorum-Isolaten aus häufig vorkommenden Leguminosen. (A) Myzelwachstum von vier S. sclerotiorum-Isolaten auf PDA-Medium, (B) Sklerotien von vier S. sclerotiorum-Isolaten, (C) Anzahl der Sklerotien (pro Petrischale), (D) Oxalsäuresekretion auf PDB-Medium (μg mL−1) und (E) Befallsstärke (%) von vier S. sclerotiorum-Isolaten an der anfälligen Leguminosensorte Giza 3 unter Gewächshausbedingungen. Die Werte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von fünf biologischen Replikaten dar (n = 5). Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen (p < 0,05). (F–H) Typische Weißschimmelsymptome traten 10 Tage nach der Inokulation mit Isolat Nr. 3 (dpi) an oberirdischen Stängeln bzw. Schoten auf. (I) Die evolutionäre Analyse der internen transkribierten Spacer-Region (ITS) des S. sclerotiorum-Isolats Nr. 3 wurde mittels Maximum-Likelihood-Methode durchgeführt und mit 20 Referenzisolaten/-stämmen aus der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) verglichen. Die Zahlen über den Clusterlinien geben die Abdeckung der Region (%) an, die Zahlen unter den Clusterlinien die Astlänge.
Um die Pathogenität zu bestätigen, wurden vier isolierte Stämme von S. sclerotiorum unter Gewächshausbedingungen zur Inokulation der anfälligen Bohnensorte Giza 3 verwendet, was den Koch’schen Postulaten entspricht (Abb. 1E). Obwohl alle isolierten Pilze pathogen waren und die grüne Bohne (Sorte Giza 3) infizieren konnten, was zu typischen Weißschimmelsymptomen an allen oberirdischen Pflanzenteilen (Abb. 1F), insbesondere an Stängeln (Abb. 1G) und Hülsen (Abb. 1H), führte, erwies sich Isolat 3 in zwei unabhängigen Versuchen als das aggressivste. Der Stamm 3 wies den höchsten Befallsgrad (%) an Bohnenpflanzen auf (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 bzw. 76,7 ± 3,1 am 7., 14. bzw. 21. Tag nach der Infektion; Abbildung 1F).
Die Identifizierung des invasivsten S. sclerotiorum-Isolats Nr. 3 wurde durch Sequenzierung der internen transkribierten Spacer-Region (ITS) bestätigt (Abb. 1I). Die phylogenetische Analyse zwischen Isolat Nr. 3 und 20 Referenzisolaten/-stämmen zeigte eine hohe Ähnlichkeit (>99 %). Bemerkenswert ist die hohe Ähnlichkeit des S. sclerotiorum-Isolats Nr. 3 (533 bp) mit dem amerikanischen S. sclerotiorum-Isolat LPM36, isoliert aus getrockneten Erbsensamen (GenBank-Zugangsnummer MK896659.1; 540 bp), und dem chinesischen S. sclerotiorum-Isolat YKY211 (GenBank-Zugangsnummer OR206374.1; 548 bp), das die Stängel- und Wurzelfäule von Matthiola incana verursacht. Alle drei Isolate sind im Dendrogramm (Abb. 1I) jeweils in einer separaten Gruppe am oberen Ende dargestellt. Die neue Sequenz wurde in der NCBI-Datenbank hinterlegt und als „Sclerotinia sclerotiorum – Isolat YN-25“ (GenBank-Zugangsnummer PV202792) bezeichnet. Isolat 3 erwies sich als das invasivste Isolat; daher wurde dieses Isolat für alle nachfolgenden Experimente ausgewählt.
Die antibakterielle Wirkung des Diamins L-Ornithin (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland) wurde in vitro in verschiedenen Konzentrationen (12,5, 25, 50, 75, 100 und 125 mg/L) gegen den S. sclerotiorum-Isolat 3 untersucht. L-Ornithin zeigte eine antibakterielle Wirkung und hemmte das radiale Wachstum der S. sclerotiorum-Hyphen dosisabhängig (Abb. 2A, B). Bei der höchsten getesteten Konzentration (125 mg/L) wies L-Ornithin die höchste Hemmrate des Myzelwachstums auf (99,62 ± 0,27 %; Abb. 2B), die der des kommerziellen Fungizids Rizolex-T (Hemmrate 99,45 ± 0,39 %; Abb. 2C) bei der höchsten getesteten Konzentration (10 mg/L) entsprach, was auf eine vergleichbare Wirksamkeit hindeutet.
Abbildung 2. In-vitro-antibakterielle Aktivität von L-Ornithin gegen Sclerotinia sclerotiorum. (A) Vergleich der antibakteriellen Aktivität verschiedener L-Ornithin-Konzentrationen gegen S. sclerotiorum mit dem kommerziellen Fungizid Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Hemmungsrate (%) des Myzelwachstums von S. sclerotiorum nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von L-Ornithin (12,5, 25, 50, 75, 100 und 125 mg/L) bzw. Rizolex-T (2, 4, 6, 8 und 10 mg/L). Die Werte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung aus fünf biologischen Replikaten dar (n = 5). Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen (p < 0,05). (D, E) Probit-Modell-Regressionsanalyse von L-Ornithin bzw. des kommerziellen Fungizids Rizolex-T. Die Regressionsgerade des Probit-Modells ist als durchgezogene blaue Linie dargestellt, das Konfidenzintervall (95 %) als gestrichelte rote Linie.
Zusätzlich wurde eine Probit-Regressionsanalyse durchgeführt, deren Ergebnisse in Tabelle 1 und den Abbildungen 2D und 2E dargestellt sind. Kurz gesagt, der akzeptable Steigungswert (y = 2,92x − 4,67) und die zugehörigen signifikanten Statistiken (Cox & Snell R² = 0,3709, Nagelkerke R² = 0,4998 und p < 0,0001; Abbildung 2D) von L-Ornithin wiesen auf eine erhöhte antifungale Aktivität gegen S. sclerotiorum im Vergleich zum kommerziellen Fungizid Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R² = 0,1242, Nagelkerke R² = 0,1708 und p < 0,0001) hin (Tabelle 1).
Tabelle 1. Werte der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) und IC99 (mg/l) von L-Ornithin und dem kommerziellen Fungizid „Rizolex-T“ gegen S. sclerotiorum.
Insgesamt reduzierte L-Ornithin (250 mg/L) die Entwicklung und den Schweregrad des Weißschimmels an behandelten Bohnenpflanzen im Vergleich zu unbehandelten, mit S. sclerotiorum infizierten Pflanzen (Kontrolle; Abb. 3A) signifikant. Obwohl der Befallsgrad der unbehandelten, infizierten Kontrollpflanzen allmählich zunahm (52,67 ± 1,53 %, 83,21 ± 2,61 % und 92,33 ± 3,06 %), verringerte L-Ornithin den Befallsgrad (%) während des gesamten Versuchs signifikant (8,97 ± 0,15 %, 18,00 ± 1,00 % und 26,36 ± 3,07 %) an den Tagen 7, 14 und 21 nach der Behandlung (dpt) (Abb. 3A). Wurden mit S. sclerotiorum infizierte Bohnenpflanzen mit 250 mg/L L-Ornithin behandelt, sank die Fläche unter der Krankheitsverlaufskurve (AUDPC) von 1274,33 ± 33,13 in der unbehandelten Kontrolle auf 281,03 ± 7,95. Dieser Wert lag etwas niedriger als der der Positivkontrolle mit 50 mg/L Rizolex-T-Fungizid (183,61 ± 7,71; Abb. 3B). Derselbe Trend wurde im zweiten Experiment beobachtet.
Abb. 3. Wirkung der exogenen Anwendung von L-Ornithin auf die Entwicklung der Weißfäule an Bohnen, verursacht durch Sclerotinia sclerotiorum, unter Gewächshausbedingungen. (A) Krankheitsverlaufskurve der Weißfäule an Bohnen nach Behandlung mit 250 mg/L L-Ornithin. (B) Fläche unter der Krankheitsverlaufskurve (AUDPC) der Weißfäule an Bohnen nach Behandlung mit L-Ornithin. Die Werte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von fünf biologischen Replikaten dar (n = 5). Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen (p < 0,05).
Die exogene Applikation von 250 mg/L L-Ornithin führte nach 42 Tagen zu einer allmählichen Zunahme der Pflanzenhöhe (Abb. 4A), der Anzahl der Seitentriebe pro Pflanze (Abb. 4B) und der Anzahl der Blätter pro Pflanze (Abb. 4C). Während das kommerzielle Fungizid Rizolex-T (50 mg/L) die größte Wirkung auf alle untersuchten Nährstoffparameter zeigte, war die exogene Applikation von 250 mg/L L-Ornithin im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen die zweitstärkste (Abb. 4A–C). Andererseits hatte die Behandlung mit L-Ornithin keinen signifikanten Einfluss auf den Gehalt der Photosynthesepigmente Chlorophyll a (Abb. 4D) und Chlorophyll b (Abb. 4E), erhöhte aber den Gesamtcarotinoidgehalt (0,56 ± 0,03 mg/g Frischgewicht) im Vergleich zur Negativkontrolle (0,44 ± 0,02 mg/g Frischgewicht) und Positivkontrolle (0,46 ± 0,02 mg/g Frischgewicht; Abb. 4F) leicht. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass L-Ornithin für behandelte Leguminosen nicht phytotoxisch ist und deren Wachstum sogar fördern kann.
Abb. 4. Einfluss der exogenen L-Ornithin-Applikation auf Wachstumsmerkmale und Photosynthesepigmente von mit Sclerotinia sclerotiorum infizierten Bohnenblättern unter Gewächshausbedingungen. (A) Pflanzenhöhe (cm), (B) Anzahl der Seitentriebe pro Pflanze, (C) Anzahl der Blätter pro Pflanze, (D) Chlorophyll-a-Gehalt (mg g⁻¹ Frischgewicht), (E) Chlorophyll-b-Gehalt (mg g⁻¹ Frischgewicht), (F) Gesamtcarotinoidgehalt (mg g⁻¹ Frischgewicht). Die Werte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung aus fünf biologischen Replikaten dar (n = 5). Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen (p < 0,05).
Die histochemische Lokalisierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS; dargestellt als Wasserstoffperoxid [H₂O₂]) und freier Radikale (dargestellt als Superoxidanionen [O₂•⁻]) in situ zeigte, dass die exogene Applikation von L-Ornithin (250 mg/L) die Akkumulation von H₂O₂ (96,05 ± 5,33 nmol·g⁻¹ Frischgewicht; Abb. 5A) und O₂•⁻ (32,69 ± 8,56 nmol·g⁻¹ Frischgewicht; Abb. 5B) im Vergleich zu unbehandelten, infizierten Pflanzen (173,31 ± 12,06 bzw. 149,35 ± 7,94 nmol·g⁻¹ Frischgewicht) und Pflanzen, die mit 50 mg/L des kommerziellen Fungizids Rizolex-T behandelt wurden (170,12 ± 9,50 bzw. 149,35 ± 7,94 nmol·g⁻¹ Frischgewicht), signifikant reduzierte. 157,00 ± 7,81 nmol·g⁻¹ Frischgewicht) nach 72 h. Unter Hochdruckbedingungen (hpt) akkumulierten hohe Konzentrationen an H₂O₂ und O₂•⁻ (Abb. 5A, B). Auch der TCA-basierte Malondialdehyd-(MDA)-Test zeigte, dass mit S. sclerotiorum infizierte Bohnenpflanzen höhere MDA-Konzentrationen (113,48 ± 10,02 nmol·g⁻¹ Frischgewicht) in ihren Blättern aufwiesen (Abb. 5C). Die exogene Applikation von L-Ornithin reduzierte die Lipidperoxidation jedoch signifikant, was sich in der Abnahme des MDA-Gehalts in den behandelten Pflanzen (33,08 ± 4,00 nmol·g⁻¹ Frischgewicht) zeigte.
Abb. 5. Einfluss der exogenen L-Ornithin-Applikation auf wichtige Marker für oxidativen Stress und nicht-enzymatische antioxidative Abwehrmechanismen in mit S. sclerotiorum infizierten Bohnenblättern 72 Stunden nach der Infektion unter Gewächshausbedingungen. (A) Wasserstoffperoxid (H₂O₂; nmol g⁻¹ Frischgewicht) nach 72 Stunden, (B) Superoxidanion (O₂•⁻; nmol g⁻¹ Frischgewicht) nach 72 Stunden, (C) Malondialdehyd (MDA; nmol g⁻¹ Frischgewicht) nach 72 Stunden, (D) Gesamtgehalt an löslichen Phenolen (mg GAE g⁻¹ Frischgewicht) nach 72 Stunden, (E) Gesamtgehalt an löslichen Flavonoiden (mg RE g⁻¹ Frischgewicht) nach 72 Stunden, (F) Gesamtgehalt an freien Aminosäuren (mg g⁻¹ Frischgewicht) nach 72 Stunden und (G) Prolingehalt (mg g⁻¹ Frischgewicht) nach 72 Stunden. Die Werte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (Mittelwert ± SD) von 5 biologischen Replikaten (n = 5) dar. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen (p < 0,05).