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Staubstürme stellen aufgrund ihrer zerstörerischen Auswirkungen auf Landwirtschaft, menschliche Gesundheit, Verkehrsnetze und Infrastruktur eine ernsthafte Bedrohung für viele Länder weltweit dar. Winderosion gilt daher als globales Problem. Ein umweltfreundlicher Ansatz zur Eindämmung der Winderosion ist die mikrobiell induzierte Carbonatfällung (MICP). Die Nebenprodukte der harnstoffbasierten MICP, wie beispielsweise Ammoniak, sind jedoch in großen Mengen unerwünscht. Diese Studie präsentiert zwei Formulierungen von Calciumformiat-Bakterien für den harnstofffreien Abbau von MICP und vergleicht deren Leistung umfassend mit zwei Formulierungen von nicht-ammoniakproduzierenden Calciumacetat-Bakterien. Die untersuchten Bakterien sind Bacillus subtilis und Bacillus amyloliquefaciens. Zunächst wurden die optimalen Werte der Faktoren, die die CaCO₃-Bildung steuern, ermittelt. Anschließend wurden Windkanalversuche mit Sanddünenproben durchgeführt, die mit den optimierten Formulierungen behandelt wurden. Dabei wurden die Winderosionsbeständigkeit, die Abtragsschwelle und die Beständigkeit gegen Sandbombardement gemessen. Calciumcarbonat (CaCO₃)-Allomorphe wurden mittels Lichtmikroskopie, Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Röntgenbeugungsanalyse untersucht. Formulierungen auf Calciumformiatbasis zeigten im Vergleich zu Formulierungen auf Acetatbasis eine signifikant höhere Calciumcarbonatbildung. Darüber hinaus produzierte B. subtilis mehr Calciumcarbonat als B. amyloliquefaciens. REM-Aufnahmen verdeutlichten die Bindung und Abprägung aktiver und inaktiver Bakterien auf sedimentiertem Calciumcarbonat. Alle Formulierungen reduzierten die Winderosion signifikant.
Winderosion gilt seit Langem als gravierendes Problem in ariden und semiariden Regionen wie dem Südwesten der USA, Westchina, der Sahara und weiten Teilen des Nahen Ostens¹. Geringe Niederschläge in ariden und hyperariden Klimazonen haben große Gebiete dieser Regionen in Wüsten, Sanddünen und Brachland verwandelt. Anhaltende Winderosion gefährdet die Infrastruktur, beispielsweise Verkehrsnetze, landwirtschaftliche Flächen und Industriegebiete, was zu schlechten Lebensbedingungen und hohen Kosten der Stadtentwicklung in diesen Regionen führt^2,3,4. Winderosion beeinträchtigt nicht nur den Ort ihres Auftretens, sondern verursacht auch gesundheitliche und wirtschaftliche Probleme in abgelegenen Gemeinden, da sie Partikel durch den Wind in weit entfernte Gebiete transportiert^5,6.
Die Bekämpfung von Winderosion stellt weiterhin ein globales Problem dar. Verschiedene Bodenstabilisierungsmethoden werden eingesetzt, um Winderosion einzudämmen. Zu diesen Methoden gehören unter anderem die Bewässerung⁷, Ölmulch⁸, Biopolymere⁵, mikrobiell induzierte Carbonatfällung (MICP)^9,10,11,12 und enzyminduzierte Carbonatfällung (EICP)¹. Die Bodenbefeuchtung ist eine Standardmethode zur Staubbindung im Feld. Aufgrund der schnellen Verdunstung ist diese Methode jedoch in ariden und semiariden Gebieten nur bedingt wirksam¹. Die Anwendung von Ölmulch erhöht die Kohäsion des Sandes und die Reibung zwischen den Partikeln. Durch die Kohäsion werden die Sandkörner zusammengehalten; Ölmulch birgt jedoch auch andere Probleme: Seine dunkle Farbe erhöht die Wärmeabsorption und führt zum Absterben von Pflanzen und Mikroorganismen. Geruch und Dämpfe können Atemwegserkrankungen verursachen, und nicht zuletzt stellen die hohen Kosten ein weiteres Hindernis dar. Biopolymere zählen zu den neuerdings vorgeschlagenen umweltfreundlichen Methoden zur Minderung von Winderosion; sie werden aus natürlichen Quellen wie Pflanzen, Tieren und Bakterien gewonnen. Xanthan, Guarkernmehl, Chitosan und Gellan sind die am häufigsten verwendeten Biopolymere in technischen Anwendungen⁵. Wasserlösliche Biopolymere können jedoch bei Kontakt mit Wasser an Festigkeit verlieren und aus dem Boden ausgewaschen werden¹³,¹⁴. Die elektrochemische Kaltverpressung (EICP) hat sich als wirksames Verfahren zur Staubbekämpfung in verschiedenen Anwendungsbereichen erwiesen, darunter unbefestigte Straßen, Absetzbecken und Baustellen. Obwohl die Ergebnisse vielversprechend sind, müssen einige potenzielle Nachteile berücksichtigt werden, wie beispielsweise die Kosten und das Fehlen von Kristallisationskeimen (was die Bildung und Ausfällung von CaCO₃-Kristallen beschleunigt¹⁵,¹⁶).
Die mikrobiell induzierte Carbonatfällung (MICP) wurde erstmals Ende des 19. Jahrhunderts von Murray und Irwin (1890) sowie Steinmann (1901) in ihren Studien zum Harnstoffabbau durch marine Mikroorganismen beschrieben.¹⁷ MICP ist ein natürlich vorkommender biologischer Prozess, der verschiedene mikrobielle Aktivitäten und chemische Reaktionen umfasst. Dabei wird Calciumcarbonat durch die Reaktion von Carbonationen aus mikrobiellen Metaboliten mit Calciumionen in der Umgebung ausgefällt.^18,19 Die am Harnstoffabbau beteiligte MICP (harnstoffabbauende MICP) ist die häufigste Form der mikrobiell induzierten Carbonatfällung. Hierbei katalysiert die von Bakterien produzierte Urease die Hydrolyse von Harnstoff.^{20,21,22,23,24,25,26,27}
Bei der MICP, die den Kohlenstoffkreislauf der organischen Salzoxidation umfasst (MICP ohne Harnstoffabbau), nutzen heterotrophe Bakterien organische Salze wie Acetat, Lactat, Citrat, Succinat, Oxalat, Malat und Glyoxylat als Energiequellen zur Produktion von Carbonatmineralien28. In Gegenwart von Calciumlactat als Kohlenstoffquelle und Calciumionen ist die chemische Reaktion der Calciumcarbonatbildung in Gleichung (5) dargestellt.
Im MICP-Verfahren liefern Bakterienzellen Kristallisationskeime, die besonders wichtig für die Ausfällung von Calciumcarbonat sind. Die Bakterienzelloberfläche ist negativ geladen und kann als Adsorptionsmittel für zweiwertige Kationen wie Calciumionen wirken. Durch die Adsorption von Calciumionen an die Bakterienzellen reagieren Calciumkationen und Carbonatanionen bei ausreichender Carbonationenkonzentration miteinander, und Calciumcarbonat fällt auf der Bakterienoberfläche aus.^29,30 Der Prozess lässt sich wie folgt zusammenfassen.^31,32
Biogenerierte Calciumcarbonatkristalle lassen sich in drei Typen unterteilen: Calcit, Vaterit und Aragonit. Calcit und Vaterit sind die häufigsten bakteriell induzierten Calciumcarbonat-Allomorphe^33,34. Calcit ist der thermodynamisch stabilste Calciumcarbonat-Allomorph³⁵. Obwohl Vaterit als metastabil beschrieben wurde, wandelt er sich letztendlich in Calcit um^36,37. Vaterit ist der dichteste dieser Kristalle. Er ist ein hexagonaler Kristall, der aufgrund seiner größeren Größe eine bessere Porenfüllungsfähigkeit als andere Calciumcarbonatkristalle aufweist³⁸. Sowohl durch Harnstoff abgebautes als auch nicht abgebautes mikrobiell induziertes Calciumcarbonat (MICP) kann zur Ausfällung von Vaterit führen^13,39,40,41.
Obwohl MICP vielversprechendes Potenzial bei der Stabilisierung problematischer und winderosionsgefährdeter Böden gezeigt hat^{42,43,44,45,46,47,48}, ist Ammoniak eines der Nebenprodukte der Harnstoffhydrolyse. Dieses kann je nach Expositionsgrad leichte bis schwere Gesundheitsprobleme verursachen⁴⁹. Dieser Nebeneffekt macht die Anwendung dieser Technologie umstritten, insbesondere bei der Behandlung großer Flächen, beispielsweise zur Staubbekämpfung. Zudem ist der Ammoniakgeruch bei hohen Aufwandmengen und großen Volumina unerträglich, was die praktische Anwendbarkeit beeinträchtigen kann. Zwar haben neuere Studien gezeigt, dass Ammoniumionen durch Umwandlung in andere Produkte wie Struvit reduziert werden können, jedoch werden sie dadurch nicht vollständig entfernt⁵⁰. Daher besteht weiterhin Bedarf an alternativen Lösungen, die keine Ammoniumionen erzeugen. Die Nutzung von Nicht-Harnstoff-Abbauwegen für MICP könnte eine vielversprechende Lösung darstellen, die im Kontext der Winderosionsminderung bisher wenig erforscht wurde. Fattahi et al. untersuchten den harnstofffreien MICP-Abbau mithilfe von Calciumacetat und Bacillus megaterium⁴¹, während Mohebbi et al. Calciumacetat und Bacillus amyloliquefaciens⁹ verwendeten. Ihre Studie verglich jedoch nicht andere Calciumquellen und heterotrophe Bakterien, die die Winderosionsbeständigkeit möglicherweise verbessern könnten. Zudem mangelt es an Literatur, die harnstofffreie Abbauwege mit harnstoffhaltigen Abbauwegen im Hinblick auf die Minderung von Winderosion vergleicht.
Zudem wurden die meisten Studien zur Winderosion und Staubbekämpfung an Bodenproben mit ebenen Oberflächen durchgeführt.^1,51,52,53 Ebene Flächen sind in der Natur jedoch seltener als Hügel und Senken. Daher sind Sanddünen das häufigste Landschaftsmerkmal in Wüstenregionen.
Um die oben genannten Mängel zu beheben, zielte diese Studie darauf ab, eine neue Gruppe ammoniakfreier Bakterien einzuführen. Zu diesem Zweck wurden mikrobielle Carbonatfällungswege (MICP) ohne Harnstoffabbau untersucht. Die Effizienz zweier Calciumquellen (Calciumformiat und Calciumacetat) wurde analysiert. Nach Kenntnis der Autoren wurde die Carbonatfällung mittels zweier Calciumquellen-Bakterien-Kombinationen (Calciumformiat-Bacillus subtilis und Calciumformiat-Bacillus amyloliquefaciens) bisher nicht untersucht. Die Auswahl dieser Bakterien basierte auf den von ihnen produzierten Enzymen, die die Oxidation von Calciumformiat und Calciumacetat zu mikrobieller Carbonatfällung katalysieren. Eine umfassende experimentelle Studie wurde durchgeführt, um die optimalen Faktoren wie pH-Wert, Bakterien- und Calciumquellenarten und deren Konzentrationen, das Verhältnis von Bakterien zu Calciumquellenlösung sowie die Aushärtungszeit zu ermitteln. Schließlich wurde die Wirksamkeit dieser Bakterienarten bei der Unterdrückung der Winderosion durch Kalziumkarbonatfällung untersucht, indem eine Reihe von Windkanalversuchen an Sanddünen durchgeführt wurde, um das Ausmaß der Winderosion, die Schwellengeschwindigkeit des Ablösens und die Windbombardierungsresistenz des Sandes zu bestimmen. Zusätzlich wurden Penetrometermessungen und mikrostrukturelle Untersuchungen (z. B. Röntgenbeugungsanalyse (XRD) und Rasterelektronenmikroskopie (SEM)) durchgeführt.
Für die Herstellung von Calciumcarbonat werden Calcium- und Carbonationen benötigt. Calciumionen können aus verschiedenen Calciumquellen wie Calciumchlorid, Calciumhydroxid und Magermilchpulver gewonnen werden^54,55. Carbonationen lassen sich durch verschiedene mikrobielle Verfahren wie Harnstoffhydrolyse und aerobe oder anaerobe Oxidation organischer Substanzen herstellen⁵⁶. In dieser Studie wurden Carbonationen durch die Oxidationsreaktion von Formiat und Acetat gewonnen. Darüber hinaus verwendeten wir Calciumsalze von Formiat und Acetat zur Herstellung von reinem Calciumcarbonat, wobei lediglich CO₂ und H₂O als Nebenprodukte entstanden. In diesem Verfahren dient nur eine Substanz als Calcium- und Carbonatquelle, und es entsteht kein Ammoniak. Diese Eigenschaften machen das von uns verwendete Verfahren zur Calcium- und Carbonatherstellung vielversprechend.
Die entsprechenden Reaktionen von Calciumformiat und Calciumacetat zur Bildung von Calciumcarbonat sind in den Formeln (7)–(14) dargestellt. Die Formeln (7)–(11) zeigen, dass sich Calciumformiat in Wasser unter Bildung von Ameisensäure bzw. Formiat löst. Die Lösung ist somit eine Quelle freier Calcium- und Hydroxidionen (Formeln 8 und 9). Durch die Oxidation der Ameisensäure werden die Kohlenstoffatome der Ameisensäure in Kohlendioxid umgewandelt (Formel 10). Schließlich entsteht Calciumcarbonat (Formeln 11 und 12).
Calciumcarbonat entsteht analog aus Calciumacetat (Gleichungen 13–15), allerdings wird dabei Essigsäure bzw. Acetat anstelle von Ameisensäure gebildet.
Ohne Enzyme können Acetat und Formiat bei Raumtemperatur nicht oxidiert werden. FDH (Formiatdehydrogenase) und CoA (Coenzym A) katalysieren die Oxidation von Formiat bzw. Acetat zu Kohlendioxid (Gl. 16, 17)^{57, 58, 59}. Verschiedene Bakterien können diese Enzyme produzieren. In dieser Studie wurden heterotrophe Bakterien, nämlich Bacillus subtilis (PTCC #1204 (Persian Type Culture Collection), auch bekannt als NCIMB #13061 (International Collection of Bacteria, Yeast, Phage, Plasmids, Plant Seeds and Plant Cell Tissue Cultures)) und Bacillus amyloliquefaciens (PTCC #1732, NCIMB #12077), verwendet. Diese Bakterien wurden in einem Medium kultiviert, das Fleischpepton (5 g/L) und Fleischextrakt (3 g/L) enthielt und als Nährbouillon (NBR) (105443 Merck) bezeichnet wird.
Daher wurden vier Formulierungen hergestellt, um die Ausfällung von Calciumcarbonat unter Verwendung von zwei Calciumquellen und zwei Bakterien zu induzieren: Calciumformiat und Bacillus subtilis (FS), Calciumformiat und Bacillus amyloliquefaciens (FA), Calciumacetat und Bacillus subtilis (AS) sowie Calciumacetat und Bacillus amyloliquefaciens (AA).
Im ersten Teil des Versuchsaufbaus wurden Tests durchgeführt, um die optimale Kombination für eine maximale Calciumcarbonatproduktion zu ermitteln. Da die Bodenproben Calciumcarbonat enthielten, wurde eine Reihe von Vorversuchen entwickelt, um die durch die verschiedenen Kombinationen produzierte CaCO₃-Menge genau zu messen. Dabei wurden Mischungen aus Kulturmedium und Calciumquellenlösungen untersucht. Für jede der oben definierten Kombinationen aus Calciumquelle und Bakterienlösung (FS, FA, AS und AA) wurden Optimierungsfaktoren (Konzentration der Calciumquelle, Aushärtungszeit, Konzentration der Bakterienlösung, gemessen anhand der optischen Dichte (OD) der Lösung, Verhältnis von Calciumquelle zu Bakterienlösung und pH-Wert) abgeleitet und in den in den folgenden Abschnitten beschriebenen Windkanalversuchen zur Behandlung von Sanddünen verwendet.
Für jede Kombination wurden 150 Experimente durchgeführt, um den Effekt der CaCO₃-Fällung zu untersuchen und verschiedene Faktoren zu bewerten, darunter die Konzentration der Calciumquelle, die Aushärtungszeit, die bakterielle optische Dichte (OD), das Verhältnis von Calciumquelle zu Bakterienlösung und der pH-Wert während der aeroben Oxidation organischer Substanz (Tabelle 1). Der pH-Bereich für den optimierten Prozess wurde anhand der Wachstumskurven von Bacillus subtilis und Bacillus amyloliquefaciens ausgewählt, um ein schnelleres Wachstum zu erzielen. Dies wird im Abschnitt „Ergebnisse“ detaillierter erläutert.
Die Proben für die Optimierungsphase wurden in folgenden Schritten vorbereitet: Zunächst wurde die MICP-Lösung durch Einstellen des pH-Werts des Kulturmediums hergestellt und anschließend 15 min bei 121 °C autoklaviert. Der Bakterienstamm wurde dann unter Laminarströmung angeimpft und in einem Schüttelinkubator bei 30 °C und 180 U/min inkubiert. Sobald die optische Dichte (OD) der Bakterien den gewünschten Wert erreicht hatte, wurde sie im gewünschten Verhältnis mit der Calciumquellenlösung vermischt (Abbildung 1a). Die MICP-Lösung wurde in einem Schüttelinkubator bei 220 U/min und 30 °C so lange reagieren und aushärten gelassen, bis der Zielwert erreicht war. Das ausgefällte CaCO₃ wurde nach Zentrifugation bei 6000 g für 5 min abgetrennt und anschließend bei 40 °C getrocknet, um die Proben für den Kalzimetertest vorzubereiten (Abbildung 1b). Die Ausfällung von CaCO₃ wurde anschließend mit einem Bernard-Kalzimeter gemessen. Dabei reagiert CaCO₃-Pulver mit 1,0 N HCl (ASTM-D4373-02) unter Bildung von CO₂. Das Volumen dieses Gases dient als Maß für den CaCO₃-Gehalt (Abbildung 1c). Zur Umrechnung des CO₂-Volumens in den CaCO₃-Gehalt wurde eine Kalibrierkurve erstellt, indem reines CaCO₃-Pulver mit 1 N HCl gewaschen und gegen das freigesetzte CO₂ aufgetragen wurde. Morphologie und Reinheit des ausgefällten CaCO₃-Pulvers wurden mittels SEM-Aufnahmen und XRD-Analyse untersucht. Ein optisches Mikroskop mit 1000-facher Vergrößerung wurde verwendet, um die Bildung von Calciumcarbonat um die Bakterien, die Phase des gebildeten Calciumcarbonats und die Aktivität der Bakterien zu untersuchen.
Das Dejegh-Becken ist eine bekannte, stark erodierte Region in der südwestlichen Provinz Fars im Iran. Die Forscher sammelten dort winderosierte Bodenproben. Die Proben wurden von der Bodenoberfläche entnommen. Indikatoruntersuchungen ergaben, dass es sich um schlecht sortierten, sandigen Boden mit Schluffanteil handelte, der gemäß dem Unified Soil Classification System (USC) als SP-SM klassifiziert wurde (Abbildung 2a). Die XRD-Analyse zeigte, dass der Boden in Dejegh hauptsächlich aus Kalzit und Quarz besteht (Abbildung 2b). Die EDX-Analyse wies zudem das Vorhandensein weiterer Elemente wie Aluminium, Kalium und Eisen in geringeren Anteilen nach.
Zur Vorbereitung der Labordünen für die Winderosionsversuche wurde der Boden aus einer Höhe von 170 mm durch einen Trichter mit 10 mm Durchmesser auf eine feste Oberfläche gepresst. So entstand eine typische Düne mit einer Höhe von 60 mm und einem Durchmesser von 210 mm. In der Natur entstehen die Sanddünen mit der geringsten Dichte durch Windverwehungen. Auch die nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellte Probe wies die geringste relative Dichte auf (γ = 14,14 kN/m³) und bildete einen Sandkegel auf einer horizontalen Fläche mit einem Böschungswinkel von etwa 29,7°.
Die im vorherigen Abschnitt ermittelte optimale MICP-Lösung wurde mit Aufwandmengen von 1, 2 und 3 lm-2 auf den Dünenhang gesprüht. Anschließend wurden die Proben für 9 Tage (d. h. die optimale Aushärtungszeit) in einem Inkubator bei 30 °C (Abb. 3) gelagert und danach für Windkanaltests entnommen.
Für jede Behandlung wurden vier Proben angefertigt: eine zur Messung des Calciumcarbonatgehalts und der Oberflächenfestigkeit mittels Penetrometer und die übrigen drei für Erosionsversuche bei drei verschiedenen Windgeschwindigkeiten. In den Windkanalversuchen wurde das Erosionsvolumen bei unterschiedlichen Windgeschwindigkeiten ermittelt und anschließend die Schwellengeschwindigkeit für jedes behandelte Probenmaterial anhand eines Diagramms des Erosionsvolumens in Abhängigkeit von der Windgeschwindigkeit bestimmt. Zusätzlich zu den Winderosionsversuchen wurden die behandelten Proben einem Sandbombardement (Sprungversuchen) unterzogen. Hierfür wurden zwei weitere Proben mit Aufbringungsmengen von 2 und 3 l/m² vorbereitet. Der Sandbombardementversuch dauerte 15 Minuten bei einem Fluss von 120 g/m², was im Bereich der in früheren Studien gewählten Werte liegt^60,61,62. Der horizontale Abstand zwischen der Abrasivdüse und dem Dünenfuß betrug 800 mm und befand sich 100 mm über dem Tunnelboden. Diese Position wurde so gewählt, dass nahezu alle aufgewirbelten Sandpartikel auf die Düne fielen.
Der Windkanalversuch wurde in einem offenen Windkanal mit einer Länge von 8 m, einer Breite von 0,4 m und einer Höhe von 1 m durchgeführt (Abbildung 4a). Der Windkanal besteht aus verzinkten Stahlblechen und kann Windgeschwindigkeiten von bis zu 25 m/s erzeugen. Zusätzlich wurde ein Frequenzumrichter eingesetzt, um die Lüfterfrequenz anzupassen und diese schrittweise zu erhöhen, bis die Zielwindgeschwindigkeit erreicht war. Abbildung 4b zeigt die schematische Darstellung der durch Wind erodierten Sanddünen und das im Windkanal gemessene Windgeschwindigkeitsprofil.
Um die Ergebnisse der in dieser Studie vorgeschlagenen nicht-urealytischen MICP-Formulierung mit den Ergebnissen des urealytischen MICP-Kontrolltests zu vergleichen, wurden Dünenproben präpariert und mit einer biologischen Lösung behandelt, die Harnstoff, Calciumchlorid und Sporosarcina pasteurii enthielt (da Sporosarcina pasteurii eine signifikante Urease-Produktionsfähigkeit aufweist⁶³). Die optische Dichte der Bakterienlösung betrug 1,5, und die Konzentrationen von Harnstoff und Calciumchlorid lagen bei 1 M (basierend auf den in früheren Studien empfohlenen Werten^36,64,65). Das Kulturmedium bestand aus Nährbouillon (8 g/L) und Harnstoff (20 g/L). Die Bakterienlösung wurde auf die Dünenoberfläche gesprüht und 24 Stunden lang zur Anhaftung der Bakterien belassen. Nach 24 Stunden wurde eine Zementierungslösung (Calciumchlorid und Harnstoff) aufgesprüht. Der urealytische MICP-Kontrolltest wird im Folgenden als UMC bezeichnet. Der Calciumcarbonatgehalt von urealytisch und nicht urealytisch behandelten Bodenproben wurde durch Waschen gemäß dem von Choi et al.66 vorgeschlagenen Verfahren bestimmt.
Abbildung 5 zeigt die Wachstumskurven von Bacillus amyloliquefaciens und Bacillus subtilis im Kulturmedium (Nährlösung) mit einem anfänglichen pH-Wert von 5 bis 10. Wie die Abbildung zeigt, wuchsen Bacillus amyloliquefaciens und Bacillus subtilis bei pH 6–8 bzw. 7–9 am schnellsten. Daher wurde dieser pH-Bereich für die Optimierung gewählt.
Wachstumskurven von (a) Bacillus amyloliquefaciens und (b) Bacillus subtilis bei verschiedenen Anfangs-pH-Werten des Nährmediums.
Abbildung 6 zeigt die im Bernard-Kalkometer produzierte Kohlendioxidmenge, die ausgefälltes Calciumcarbonat (CaCO₃) repräsentiert. Da in jeder Kombination ein Faktor konstant gehalten und die anderen variiert wurden, entspricht jeder Punkt in den Diagrammen dem maximalen Kohlendioxidvolumen der jeweiligen Versuchsreihe. Wie die Abbildung zeigt, stieg die Calciumcarbonatproduktion mit zunehmender Konzentration der Calciumquelle. Die Konzentration der Calciumquelle beeinflusst somit direkt die Calciumcarbonatproduktion. Da Calcium- und Kohlenstoffquelle identisch sind (Calciumformiat und Calciumacetat), führt eine höhere Freisetzung von Calciumionen zu mehr gebildetem Calciumcarbonat (Abbildung 6a). In den Formulierungen AS und AA stieg die Calciumcarbonatproduktion mit zunehmender Aushärtungszeit kontinuierlich an, bis die Niederschlagsmenge nach 9 Tagen nahezu konstant blieb. In der Formulierung FA sank die Calciumcarbonatbildungsrate nach 6 Tagen Aushärtungszeit. Im Vergleich zu den anderen Formulierungen wies die Formulierung FS nach 3 Tagen eine relativ geringe Calciumcarbonatbildungsrate auf (Abbildung 6b). In den Formulierungen FA und FS wurden nach drei Tagen 70 % bzw. 87 % der gesamten Calciumcarbonatproduktion erreicht, während dieser Anteil in den Formulierungen AA und AS nur etwa 46 % bzw. 45 % betrug. Dies deutet darauf hin, dass die Formulierung auf Ameisensäurebasis im Vergleich zur Formulierung auf Acetatbasis in der Anfangsphase eine höhere CaCO₃-Bildungsrate aufweist. Die Bildungsrate verlangsamt sich jedoch mit zunehmender Aushärtungszeit. Abbildung 6c lässt den Schluss zu, dass selbst bei Bakterienkonzentrationen oberhalb von OD₁ kein signifikanter Beitrag zur Calciumcarbonatbildung geleistet wird.
Änderung des CO2-Volumens (und des entsprechenden CaCO3-Gehalts), gemessen mit dem Bernard-Kalzimeter, als Funktion von (a) der Konzentration der Calciumquelle, (b) der Abbindezeit, (c) der optischen Dichte (OD), (d) des anfänglichen pH-Werts, (e) des Verhältnisses von Calciumquelle zu Bakterienlösung (für jede Formulierung); und (f) der maximalen Menge an Calciumcarbonat, die für jede Kombination von Calciumquelle und Bakterien produziert wird.
Bezüglich des Einflusses des anfänglichen pH-Werts des Mediums zeigt Abbildung 6d, dass die CaCO₃-Produktion für FA und FS bei pH 7 ein Maximum erreichte. Diese Beobachtung deckt sich mit früheren Studien, die die höchste Stabilität von FDH-Enzymen im pH-Bereich von 7–6,7 belegen. Bei AA und AS hingegen nahm die CaCO₃-Ausfällung bei pH-Werten über 7 zu. Frühere Studien zeigten zudem, dass der optimale pH-Bereich für die CoA-Enzymaktivität zwischen 8 und 9,2–6,8 liegt. Da die optimalen pH-Bereiche für die CoA-Enzymaktivität und das Wachstum von B. amyloliquefaciens (8–9,2) bzw. (6–8) betragen (Abbildung 5a), wird für die AA-Formulierung ein optimaler pH-Wert von 8 erwartet, und die beiden pH-Bereiche überschneiden sich. Dies wurde experimentell bestätigt (siehe Abbildung 6d). Da das optimale pH-Wert für das Wachstum von B. subtilis bei 7–9 (Abbildung 5b) und das optimale pH-Wert für die CoA-Enzymaktivität bei 8–9,2 liegt, wird die maximale CaCO₃-Ausbeute im pH-Bereich von 8–9 erwartet, was durch Abbildung 6d bestätigt wird (d. h. der optimale pH-Wert für die Ausfällung beträgt 9). Die Ergebnisse in Abbildung 6e zeigen, dass das optimale Verhältnis von Calciumquellenlösung zu Bakterienlösung sowohl für Acetat- als auch für Formiatlösungen 1 beträgt. Zum Vergleich wurde die Leistung verschiedener Formulierungen (AA, AS, FA und FS) anhand der maximalen CaCO₃-Produktion unter verschiedenen Bedingungen (Calciumquellenkonzentration, Aushärtungszeit, optische Dichte, Verhältnis von Calciumquellenlösung zu Bakterienlösung und Ausgangs-pH-Wert) bewertet. Von den untersuchten Formulierungen wies die Formulierung FS die höchste CaCO₃-Produktion auf, die etwa dreimal so hoch war wie die der Formulierung AA (Abbildung 6f). Vier bakterienfreie Kontrollexperimente wurden für beide Calciumquellen durchgeführt, wobei nach 30 Tagen keine CaCO₃-Ausfällung beobachtet wurde.
Die optischen Mikroskopieaufnahmen aller Formulierungen zeigten, dass Vaterit die Hauptphase war, in der sich Calciumcarbonat bildete (Abbildung 7). Die Vateritkristalle waren kugelförmig^69,70,71. Es wurde festgestellt, dass Calciumcarbonat auf den Bakterienzellen ausfiel, da deren Oberfläche negativ geladen war und als Adsorptionsmittel für zweiwertige Kationen wirken konnte. Am Beispiel der Formulierung FS zeigte sich, dass sich nach 24 Stunden Calciumcarbonat auf einigen Bakterienzellen bildete (Abbildung 7a), und nach 48 Stunden nahm die Anzahl der mit Calciumcarbonat beschichteten Bakterienzellen deutlich zu. Zusätzlich konnten, wie in Abbildung 7b dargestellt, Vateritpartikel nachgewiesen werden. Nach 72 Stunden schien schließlich eine große Anzahl von Bakterien an die Vateritkristalle gebunden zu sein, und die Anzahl der Vateritpartikel hatte deutlich zugenommen (Abbildung 7c).
Optische Mikroskopiebeobachtungen der CaCO3-Ausfällung in FS-Zusammensetzungen im Zeitverlauf: (a) 24, (b) 48 und (c) 72 h.
Zur weiteren Untersuchung der Morphologie der ausgefällten Phase wurden Röntgenbeugungs- (XRD) und Rasterelektronenmikroskopie-Analysen (REM) der Pulver durchgeführt. Die XRD-Spektren (Abb. 8a) und REM-Aufnahmen (Abb. 8b, c) bestätigten das Vorhandensein von Vateritkristallen, da diese eine salatartige Form aufwiesen und eine Übereinstimmung zwischen den Vaterit-Peaks und den Peaks des Ausfällungsprodukts beobachtet wurde.
(a) Vergleich der Röntgenbeugungsspektren von gebildetem CaCO3 und Vaterit. REM-Aufnahmen von Vaterit bei (b) 1 kHz bzw. (c) 5,27 kHz Vergrößerung.
Die Ergebnisse der Windkanalversuche sind in Abbildung 9a und 9b dargestellt. Abbildung 9a zeigt, dass die Schwellenerosionsgeschwindigkeit (TDV) des unbehandelten Sandes bei etwa 4,32 m/s liegt. Bei einer Ausbringungsmenge von 1 l/m² (Abbildung 9a) sind die Steigungen der Bodenabtragsgeraden für die Fraktionen FA, FS, AA und UMC annähernd gleich derjenigen der unbehandelten Düne. Dies deutet darauf hin, dass die Behandlung bei dieser Ausbringungsmenge unwirksam ist und die dünne Bodenkruste verschwindet, sobald die Windgeschwindigkeit die TDV überschreitet. Die Erosionsrate der Düne entspricht dann derjenigen der unbehandelten Düne. Die Erosionssteigung der Fraktion AS ist ebenfalls geringer als die der anderen Fraktionen mit niedrigeren Abszissen (d. h. niedrigerer TDV) (Abbildung 9a). Die Pfeile in Abbildung 9b zeigen, dass bei der maximalen Windgeschwindigkeit von 25 m/s bei Ausbringungsmengen von 2 und 3 l/m² keine Erosion in den behandelten Dünen auftrat. Anders ausgedrückt: Bei den Dünen FS, FA, AS und UMC war die durch CaCO₃-Ablagerung verursachte Winderosion bei Aufbringungsraten von 2 und 3 l/m² widerstandsfähiger als bei der maximalen Windgeschwindigkeit (25 m/s). Der in diesen Versuchen ermittelte TDV-Wert von 25 m/s stellt somit die untere Grenze für die in Abbildung 9b dargestellten Aufbringungsraten dar, außer im Fall von AA, wo der TDV-Wert nahezu der maximalen Windkanalgeschwindigkeit entspricht.
Winderosionstest (a) Gewichtsverlust in Abhängigkeit von der Windgeschwindigkeit (Aufwandmenge 1 l/m2), (b) Schwellenwert der Abreißgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Aufwandmenge und der Formulierung (CA für Calciumacetat, CF für Calciumformiat).
Abbildung 10 zeigt die Oberflächenerosion von Sanddünen nach dem Sandbombardierungstest, die mit verschiedenen Formulierungen und Aufwandmengen behandelt wurden. Die quantitativen Ergebnisse sind in Abbildung 11 dargestellt. Die unbehandelte Probe ist nicht abgebildet, da sie keinerlei Widerstand zeigte und während des Tests vollständig erodiert wurde (Gesamtmasseverlust). Abbildung 11 verdeutlicht, dass die mit der Biokomposition AA behandelte Probe bei einer Aufwandmenge von 2 l/m² 83,5 % ihres Gewichts verlor, während alle anderen Proben während des Sandbombardierungsprozesses eine Erosion von weniger als 30 % aufwiesen. Bei einer Erhöhung der Aufwandmenge auf 3 l/m² verloren alle behandelten Proben weniger als 25 % ihres Gewichts. Bei beiden Aufwandmengen zeigte die Verbindung FS die beste Beständigkeit gegenüber dem Sandbombardierungstest. Die maximale und minimale Beständigkeit der mit FS bzw. AA behandelten Proben lassen sich auf deren maximale bzw. minimale CaCO₃-Ausfällung zurückführen (Abbildung 6f).
Ergebnisse der Bombardierung von Sanddünen unterschiedlicher Zusammensetzung bei Durchflussraten von 2 und 3 l/m² (Pfeile zeigen die Windrichtung an, Kreuze zeigen die Windrichtung senkrecht zur Zeichenebene an).
Wie in Abbildung 12 dargestellt, stieg der Calciumcarbonatgehalt aller Formulierungen mit zunehmender Aufwandmenge von 1 l/m² auf 3 l/m². Darüber hinaus wies die Formulierung FS bei allen Aufwandmengen den höchsten Calciumcarbonatgehalt auf, gefolgt von FA und UMC. Dies deutet darauf hin, dass diese Formulierungen eine höhere Oberflächenbeständigkeit aufweisen könnten.
Abbildung 13a zeigt die Veränderung des Oberflächenwiderstands von unbehandelten, Kontroll- und behandelten Bodenproben, gemessen mit einem Permeameter. Aus dieser Abbildung geht hervor, dass der Oberflächenwiderstand der UMC-, AS-, FA- und FS-Formulierungen mit zunehmender Aufwandmenge deutlich anstieg. Bei der AA-Formulierung war der Anstieg der Oberflächenfestigkeit hingegen relativ gering. Wie die Abbildung zeigt, weisen die FA- und FS-Formulierungen des nicht harnstoffabbaubaren MICP eine bessere Oberflächenpermeabilität auf als das harnstoffabbaubare MICP. Abbildung 13b zeigt die Veränderung der Schwellenabtragsgeschwindigkeit (TDV) in Abhängigkeit vom Bodenoberflächenwiderstand. Aus dieser Abbildung geht klar hervor, dass bei Dünen mit einem Oberflächenwiderstand von über 100 kPa die Schwellenabtragsgeschwindigkeit 25 m/s überschreitet. Da der Oberflächenwiderstand in situ einfach mit einem Permeameter gemessen werden kann, lässt sich die TDV auch ohne Windkanalversuche abschätzen und dient somit als Qualitätsindikator für Feldanwendungen.
Die Ergebnisse der REM-Untersuchungen sind in Abbildung 14 dargestellt. Abbildung 14a-b zeigt die vergrößerten Partikel der unbehandelten Bodenprobe. Diese weisen deutlich auf Kohäsion ohne natürliche Bindungen oder Zementierung hin. Abbildung 14c zeigt die REM-Aufnahme der Kontrollprobe, die mit harnstoffabbauendem MICP behandelt wurde. In dieser Aufnahme sind CaCO₃-Präzipitate als Calcit-Polymorphe zu erkennen. Wie in Abbildung 14d-o dargestellt, bindet das ausgefällte CaCO₃ die Partikel; sphärische Vateritkristalle sind ebenfalls in den REM-Aufnahmen erkennbar. Die Ergebnisse dieser und früherer Studien deuten darauf hin, dass die als Vaterit-Polymorphe gebildeten CaCO₃-Bindungen auch eine angemessene mechanische Festigkeit gewährleisten können. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Oberflächenwiderstand auf 350 kPa und die Schwellentrenngeschwindigkeit von 4,32 auf über 25 m/s ansteigt. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit den Ergebnissen früherer Studien, die zeigen, dass die Matrix des MICP-gefällten CaCO3 Vaterit ist, welches eine angemessene mechanische Festigkeit und Winderosionsbeständigkeit aufweist13,40 und auch nach 180 Tagen Exposition gegenüber den Umweltbedingungen im Freiland eine angemessene Winderosionsbeständigkeit beibehalten kann13.
(a, b) REM-Mikrographien von unbehandeltem Boden, (c) MICP-Harnstoffabbau-Kontrolle, (df) AA-behandelte Proben, (gi) AS-behandelte Proben, (jl) FA-behandelte Proben und (mo) FS-behandelte Proben bei einer Ausbringungsmenge von 3 L/m2 bei verschiedenen Vergrößerungen.
Abbildung 14d–f zeigt, dass sich nach der Behandlung mit AA-Verbindungen Calciumcarbonat auf der Oberfläche und zwischen den Sandkörnern abgelagert hat, während gleichzeitig einige unbeschichtete Sandkörner zu beobachten waren. Bei AS-Komponenten erhöhte sich die Menge des gebildeten CaCO₃ zwar nicht signifikant (Abb. 6f), die Anzahl der durch CaCO₃ verursachten Kontakte zwischen den Sandkörnern war jedoch im Vergleich zu AA-Verbindungen deutlich erhöht (Abb. 14g–i).
Aus den Abbildungen 14j–l und 14m–o geht hervor, dass die Verwendung von Calciumformiat als Calciumquelle im Vergleich zur AS-Mischung zu einer weiteren Erhöhung der CaCO₃-Ausfällung führt, was mit den Calciummeter-Messungen in Abbildung 6f übereinstimmt. Dieses zusätzliche CaCO₃ lagert sich hauptsächlich auf den Sandpartikeln ab und verbessert die Kontaktqualität nicht unbedingt. Dies bestätigt das zuvor beobachtete Verhalten: Trotz der Unterschiede in der Menge der CaCO₃-Ausfällung (Abbildung 6f) unterscheiden sich die drei Formulierungen (AS, FA und FS) hinsichtlich ihrer Windbeständigkeit (Abbildung 11) und ihres Oberflächenwiderstands (Abbildung 13a) nicht signifikant.
Um die mit CaCO₃ beschichteten Bakterienzellen und den bakteriellen Abdruck auf den ausgefällten Kristallen besser darzustellen, wurden hochauflösende REM-Aufnahmen angefertigt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 15 dargestellt. Wie gezeigt, fällt Calciumcarbonat auf den Bakterienzellen aus und liefert die für die Ausfällung benötigten Keime. Die Abbildung zeigt außerdem die durch CaCO₃ induzierten aktiven und inaktiven Bindungen. Daraus lässt sich schließen, dass eine Zunahme inaktiver Bindungen nicht zwangsläufig zu einer weiteren Verbesserung der mechanischen Eigenschaften führt. Daher führt eine erhöhte CaCO₃-Ausfällung nicht zwangsläufig zu einer höheren mechanischen Festigkeit, und das Ausfällungsmuster spielt eine wichtige Rolle. Dieser Punkt wurde auch in den Arbeiten von Terzis und Laloui⁷² sowie Soghi und Al-Kabani⁴⁵,⁷³ untersucht. Um den Zusammenhang zwischen Ausfällungsmuster und mechanischer Festigkeit weiter zu erforschen, werden MICP-Studien mit µCT-Bildgebung empfohlen. Dies geht jedoch über den Rahmen dieser Studie hinaus (d. h. die Einführung verschiedener Kombinationen von Calciumquellen und Bakterien für ammoniakfreie MICP).
CaCO3 induzierte aktive und inaktive Bindungen in Proben, die mit (a) AS-Zusammensetzung und (b) FS-Zusammensetzung behandelt wurden, und hinterließ einen Abdruck von Bakterienzellen auf dem Sediment.
Wie in Abbildung 14j-o und 15b dargestellt, ist ein CaCO₃-Film vorhanden (die prozentuale Zusammensetzung des Films beträgt laut EDX-Analyse 11 % Kohlenstoff, 46,62 % Sauerstoff und 42,39 % Calcium, was dem CaCO₃-Gehalt in Abbildung 16 sehr nahe kommt). Dieser Film bedeckt die Vateritkristalle und Bodenpartikel und trägt so zum Erhalt der Integrität des Boden-Sediment-Systems bei. Das Vorhandensein dieses Films wurde ausschließlich in den mit der Formiat-basierten Formulierung behandelten Proben beobachtet.
Tabelle 2 vergleicht die Oberflächenfestigkeit, die Schwellenablösegeschwindigkeit und den bioinduzierten CaCO₃-Gehalt von Böden, die in früheren und in dieser Studie mit mikrobiell induzierter Chloroxid-Politur (MICP) behandelt wurden, wobei sowohl harnstoffabbauende als auch nicht-harnstoffabbauende Verfahren zum Einsatz kamen. Untersuchungen zur Winderosionsbeständigkeit von mit MICP behandelten Dünenproben sind rar. Meng et al. untersuchten die Winderosionsbeständigkeit von mit MICP und harnstoffabbauenden Substanzen behandelten Dünenproben mithilfe eines Laubbläsers,¹³ während in dieser Studie nicht-harnstoffabbauende Dünenproben (sowie harnstoffabbauende Kontrollen) in einem Windkanal getestet und mit vier verschiedenen Kombinationen von Bakterien und Substanzen behandelt wurden.
Wie ersichtlich, wurden in einigen früheren Studien hohe Aufwandmengen von über 4 l/m² untersucht.^13,41,74 Es ist anzumerken, dass hohe Aufwandmengen aufgrund der Kosten für Wasserversorgung, Transport und Ausbringung großer Wassermengen in der Praxis wirtschaftlich schwer umsetzbar sein können. Auch mit niedrigeren Aufwandmengen von 1,62–2 l/m² wurden recht gute Oberflächenfestigkeiten von bis zu 190 kPa und eine Trockenfließgeschwindigkeit (TDV) von über 25 m/s erzielt. In der vorliegenden Studie erreichten mit Formiat-basiertem MICP ohne Harnstoffabbau behandelte Dünen hohe Oberflächenfestigkeiten, die mit denen des Harnstoffabbauverfahrens im gleichen Aufwandmengenbereich vergleichbar waren (d. h. Proben, die mit Formiat-basiertem MICP ohne Harnstoffabbau behandelt wurden, erreichten bei höheren Aufwandmengen ebenfalls die von Meng et al.¹³ berichteten Oberflächenfestigkeitswerte, siehe Abbildung 13a). Es ist auch ersichtlich, dass bei einer Aufwandmenge von 2 l/m² die Ausbeute an Calciumcarbonat zur Minderung der Winderosion bei einer Windgeschwindigkeit von 25 m/s für das auf Formiat basierende MICP ohne Harnstoffabbau 2,25 % betrug, was sehr nahe an der erforderlichen Menge an CaCO3 (d. h. 2,41 %) liegt, verglichen mit Dünen, die mit dem Kontroll-MICP mit Harnstoffabbau bei der gleichen Aufwandmenge und der gleichen Windgeschwindigkeit (25 m/s) behandelt wurden.
Aus dieser Tabelle lässt sich schließen, dass sowohl der Abbauweg mit als auch der harnstofffreie Abbauweg hinsichtlich Oberflächenwiderstand und TDV zufriedenstellende Ergebnisse liefern. Der Hauptunterschied besteht darin, dass der harnstofffreie Abbauweg kein Ammoniak enthält und somit die Umweltbelastung reduziert. Darüber hinaus scheint die in dieser Studie vorgeschlagene Formiat-basierte MICP-Methode ohne Harnstoffabbau bessere Ergebnisse zu erzielen als die Acetat-basierte MICP-Methode ohne Harnstoffabbau. Obwohl Mohebbi et al. die Acetat-basierte MICP-Methode ohne Harnstoffabbau untersuchten, umfasste ihre Studie Proben auf ebenen Oberflächen. Aufgrund der stärkeren Erosion durch Wirbelbildung um die Dünenproben und der daraus resultierenden Scherung, die zu einem niedrigeren TDV führt, ist zu erwarten, dass die Winderosion der Dünenproben bei gleicher Windgeschwindigkeit deutlicher ausgeprägt ist als die von ebenen Oberflächen.