Wir berichteten bereits, dass die Serumspiegel des aus dem Darm stammenden Tryptophanmetaboliten Indol-3-propionsäure (IPA) bei Patienten mit Leberfibrose niedriger sind. In der vorliegenden Studie untersuchten wir das Transkriptom und das DNA-Methylom in Lebern adipöser Tiere in Bezug auf die Serum-IPA-Spiegel sowie die Rolle von IPA bei der Induktion der phänotypischen Inaktivierung hepatischer Sternzellen (HSCs) in vitro.
Die Studie umfasste 116 adipöse Patienten ohne Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) (Alter: 46,8 ± 9,3 Jahre; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²), die sich im Kuopio Bariatric Surgery Center (KOBS) einer bariatrischen Operation unterzogen. Die zirkulierenden IPA-Konzentrationen wurden mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) gemessen, die Lebertranskriptomanalyse erfolgte durch Sequenzierung der Gesamt-RNA und die DNA-Methylierungsanalyse wurde mit dem Infinium HumanMethylation450 BeadChip durchgeführt. Für die In-vitro-Experimente wurden humane hepatische Sternzellen (LX-2) verwendet.
Die Serum-IPA-Konzentrationen korrelierten mit der Expression von Genen, die an Apoptose-, Mitophagie- und Langlebigkeitsprozessen in der Leber beteiligt sind. Das Gen für die Serin/Threonin-Kinase 1 (AKT1) war das am häufigsten exprimierte und dominanteste interagierende Gen in den Leber-Transkript- und DNA-Methylierungsprofilen. Die IPA-Behandlung induzierte Apoptose, verringerte die mitochondriale Atmung und veränderte die Zellmorphologie und die mitochondriale Dynamik durch Modulation der Expression von Genen, die bekanntermaßen Fibrose, Apoptose und das Überleben von LX-2-Zellen regulieren.
Zusammengenommen stützen diese Daten die Annahme, dass IPA ein therapeutisches Potenzial besitzt und Apoptose auslösen sowie den HSC-Phänotyp in Richtung eines inaktiven Zustands verschieben kann. Dadurch erweitert sich die Möglichkeit, Leberfibrose durch Eingriffe in die HSC-Aktivierung und den mitochondrialen Stoffwechsel zu hemmen.
Die zunehmende Verbreitung von Adipositas und metabolischem Syndrom korreliert mit einer steigenden Inzidenz der metabolisch bedingten Fettlebererkrankung (MASLD); 25–30 % der Allgemeinbevölkerung sind von dieser Erkrankung betroffen [1]. Hauptfolge der MASLD-Ätiologie ist die Leberfibrose, ein dynamischer Prozess, der durch die kontinuierliche Akkumulation von fibröser extrazellulärer Matrix (ECM) gekennzeichnet ist [2]. Die wichtigsten an der Leberfibrose beteiligten Zellen sind hepatische Sternzellen (HSCs), die vier bekannte Phänotypen aufweisen: ruhend, aktiviert, inaktiviert und seneszent [3, 4]. HSCs können aktiviert werden und sich von einem ruhenden Zustand in proliferative, fibroblastenähnliche Zellen mit hohem Energiebedarf umwandeln, die eine erhöhte Expression von α-Aktin glatter Muskulatur (α-SMA) und Kollagen Typ I (Col-I) zeigen [5, 6]. Im Zuge der Rückbildung der Leberfibrose werden aktivierte HSCs durch Apoptose oder Inaktivierung eliminiert. Zu diesen Prozessen gehören die Herunterregulierung fibrogener Gene und die Modulation von Überlebensgenen (wie NF-κB- und PI3K/Akt-Signalwege) [7, 8] sowie Veränderungen der mitochondrialen Dynamik und Funktion [9].
Es wurde festgestellt, dass die Serumspiegel des im Darm produzierten Tryptophan-Metaboliten Indol-3-propionsäure (IPA) bei menschlichen Stoffwechselerkrankungen, einschließlich MASLD, erniedrigt sind [10–13]. IPA steht in Zusammenhang mit der Ballaststoffzufuhr, ist für seine antioxidativen und entzündungshemmenden Wirkungen bekannt und mildert den durch die Ernährung induzierten Phänotyp der nichtalkoholischen Steatohepatitis (NASH) in vivo und in vitro [11–14]. Hinweise darauf liefert unsere frühere Studie, die zeigte, dass die Serum-IPA-Spiegel bei Patienten mit Leberfibrose niedriger waren als bei adipösen Patienten ohne Leberfibrose in der Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die Behandlung mit IPA die Expression von Genen reduzieren kann, die klassische Marker für Zelladhäsion, Zellmigration und die Aktivierung hämatopoetischer Stammzellen in einem humanen hepatischen Sternzellmodell (LX-2) darstellen, und dass IPA ein potenzieller leberschützender Metabolit ist [15]. Es bleibt jedoch unklar, wie IPA die Rückbildung der Leberfibrose durch Aktivierung der HSC-Apoptose und der mitochondrialen Bioenergetik induziert.
Wir zeigen hier, dass Serum-IPA mit der Expression von Genen assoziiert ist, die in Apoptose-, Mitophagie- und Langlebigkeitswegen in der Leber von adipösen Personen ohne Typ-2-Diabetes (KOBS) angereichert sind. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass IPA die Clearance und den Abbau aktivierter hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) über den Inaktivierungsweg induzieren kann. Diese Ergebnisse enthüllen eine neue Funktion von IPA und machen es zu einem potenziellen therapeutischen Ziel zur Förderung der Rückbildung von Leberfibrose.
Eine frühere Studie an der KOBS-Kohorte zeigte, dass Patienten mit Leberfibrose niedrigere zirkulierende IPA-Spiegel aufwiesen als Patienten ohne Leberfibrose [15]. Um den potenziellen Störfaktor Typ-2-Diabetes auszuschließen, rekrutierten wir 116 adipöse Patienten ohne Typ-2-Diabetes (mittleres Alter ± Standardabweichung: 46,8 ± 9,3 Jahre; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²) (Tabelle 1) aus der laufenden KOBS-Studie als Studienpopulation [16]. Alle Teilnehmer gaben ihre schriftliche Einwilligung nach Aufklärung, und das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission des Krankenhauses des Kreises Nord-Savo gemäß der Deklaration von Helsinki genehmigt (54/2005, 104/2008 und 27/2010).
Leberbiopsien wurden im Rahmen bariatrischer Operationen entnommen und von erfahrenen Pathologen nach zuvor beschriebenen Kriterien histologisch beurteilt [17, 18]. Die Beurteilungskriterien sind in der ergänzenden Tabelle S1 zusammengefasst und wurden bereits zuvor beschrieben [19].
Nüchternserumproben wurden mittels ungerichteter Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) für die Metabolomanalyse untersucht (n = 116). Die Analyse der Proben erfolgte mit einem UHPLC-qTOF-MS-System (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Deutschland) wie bereits beschrieben¹⁹. Die Identifizierung von Isopropylalkohol (IPA) basierte auf der Retentionszeit und dem Vergleich des MS/MS-Spektrums mit reinen Standards. Die IPA-Signalintensität (Peakfläche) wurde in allen weiteren Analysen berücksichtigt^[20].
Die RNA-Sequenzierung der gesamten Leber erfolgte mittels Illumina HiSeq 2500, die Daten wurden wie zuvor beschrieben vorverarbeitet [19, 21, 22]. Wir führten eine gezielte differentielle Expressionsanalyse von Transkripten durch, die die mitochondriale Funktion/Biogenese beeinflussen. Hierfür verwendeten wir 1957 Gene aus der MitoMiner 4.0-Datenbank [23]. Die DNA-Methylierungsanalyse der Leber erfolgte mit dem Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) nach der bereits beschriebenen Methodik [24, 25].
Humane hepatische Sternzellen (LX-2) wurden freundlicherweise von Prof. Stefano Romeo zur Verfügung gestellt und in DMEM/F12-Medium (Biowest, L0093-500, 1 % Penicillin/Streptomycin; Lonza, DE17-602E, 2 % FBS; Gibco, 10270-106) kultiviert. Zur Bestimmung der optimalen IPA-Dosis wurden LX-2-Zellen 24 h lang mit verschiedenen IPA-Konzentrationen (10 μM, 100 μM und 1 mM; Sigma, 220027) in DMEM/F12-Medium behandelt. Um die Fähigkeit von IPA zur Inaktivierung von HSCs zu untersuchen, wurden LX-2-Zellen zudem 24 h lang in serumfreiem Medium mit 5 ng/ml TGF-β1 (R&D Systems, 240-B-002/CF) und 1 mM IPA koinkubiert. Für die entsprechenden Fahrzeugkontrollen wurde 4 nM HCL mit 0,1 % BSA für die TGF-β1-Behandlung und 0,05 % DMSO für die IPA-Behandlung verwendet; beide wurden für die Kombinationsbehandlung zusammen verwendet.
Die Apoptose wurde mithilfe des FITC Annexin V Apoptose-Detektionskits mit 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Kat.-Nr. 640922) gemäß den Herstellerangaben untersucht. Kurz gesagt, wurden LX-2-Zellen (1 × 10⁵ Zellen/Well) über Nacht in 12-Well-Platten kultiviert und anschließend mit verschiedenen Dosen von IPA oder IPA und TGF-β1 behandelt. Am folgenden Tag wurden die nicht-adhärenten und die adhärenten Zellen geerntet, trypsinisiert, mit PBS gewaschen, in Annexin-V-Bindungspuffer resuspendiert und 15 Minuten lang mit FITC-Annexin V und 7-AAD inkubiert.
Mitochondrien in lebenden Zellen wurden mittels Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) auf oxidative Aktivität angefärbt. Für die MTR-Assays wurden LX-2-Zellen in gleicher Zelldichte mit IPA und TGF-β1 inkubiert. Nach 24 h wurden die lebenden Zellen trypsinisiert, mit PBS gewaschen und anschließend wie zuvor beschrieben [26] für 20 min in serumfreiem Medium mit 100 μM MTR inkubiert. Zur Analyse der Morphologie lebender Zellen wurden Zellgröße und Zytoplasmakomplexität anhand der Vorwärtsstreuung (FSC) bzw. Seitwärtsstreuung (SSC) bestimmt.
Alle Daten (30.000 Ereignisse) wurden mit NovoCyte Quanteon (Agilent) erfasst und mit der Software NovoExpress® 1.4.1 oder FlowJo V.10 analysiert.
Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und extrazelluläre Azidifizierungsrate (ECAR) wurden in Echtzeit mit einem Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) mit Seahorse XF Cell Mito Stress gemäß den Herstellerangaben gemessen. Kurz gesagt, wurden 2 × 10⁴ LX-2-Zellen pro Well auf XF96-Zellkulturplatten ausgesät. Nach Inkubation über Nacht wurden die Zellen mit Isopropanol (IPA) und TGF-β1 behandelt (siehe Ergänzende Methoden 1). Die Datenanalyse erfolgte mit der Seahorse XF Wave Software, die den Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator beinhaltet. Daraus wurde ein bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) berechnet [27].
Die Gesamt-RNA wurde in cDNA transkribiert. Spezifische Methoden sind in Referenz [15] beschrieben. Die mRNA-Spiegel des humanen ribosomalen sauren Proteins P0 (RPLP0) und von Cyclophilin A1 (PPIA) dienten als konstitutive Genkontrollen. Die PCR wurde mit dem QuantStudio 6 pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher, Landsmeer, Niederlande) und dem TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) oder dem Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) durchgeführt. Die relative Genexpressionsänderung wurde anhand der ΔΔCt-Werte und der ∆∆Ct-Methode berechnet. Details zu den Primern finden sich in den ergänzenden Tabellen S2 und S3.
Nukleäre DNA (ncDNA) und mitochondriale DNA (mtDNA) wurden mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) wie zuvor beschrieben extrahiert [28]. Die relative Menge an mtDNA wurde durch Berechnung des Verhältnisses jeder Ziel-mtDNA-Region zum geometrischen Mittelwert der drei nukleären DNA-Regionen (mtDNA/ncDNA) ermittelt, wie in den ergänzenden Methoden 2 detailliert beschrieben. Einzelheiten zu den Primern für mtDNA und ncDNA sind in der ergänzenden Tabelle S4 aufgeführt.
Lebende Zellen wurden mit Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) angefärbt, um interzelluläre und intrazelluläre Mitochondriennetzwerke sichtbar zu machen. LX-2-Zellen (1 × 10⁴ Zellen/Well) wurden auf Objektträgern in entsprechenden Kulturplatten mit Glasboden (Ibidi GmbH, Martinsried, Deutschland) kultiviert. Nach 24 h wurden die lebenden LX-2-Zellen 20 min bei 37 °C mit 100 μM MTR inkubiert und die Zellkerne wie zuvor beschrieben [29] mit DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) angefärbt. Mitochondriale Netzwerke wurden mit einem inversen Mikroskop Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Deutschland), ausgestattet mit einem Zeiss LSM 800 Konfokalmodul, bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ und einem 63×/NA 1,3 Objektiv visualisiert. Für jeden Probentyp wurden zehn Z-Serien-Bilder aufgenommen. Jede Z-Serie umfasst 30 Schnitte mit einer Dicke von jeweils 9,86 μm. Für jede Probe wurden Bilder von zehn verschiedenen Bildfeldern mit der Software ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Deutschland) aufgenommen. Die Analyse der mitochondrialen Morphologie erfolgte mit der Software ImageJ (Version 1.54d) [30, 31] gemäß den in den ergänzenden Methoden (Abschnitt 3) beschriebenen Parametern.
Die Zellen wurden mit 2 % Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer fixiert, anschließend mit 1 % Osmiumtetroxidlösung (Sigma Aldrich, MO, USA) nachfixiert, schrittweise mit Aceton (Merck, Darmstadt, Deutschland) entwässert und schließlich in Epoxidharz eingebettet. Ultradünne Schnitte wurden angefertigt und mit 1 % Uranylacetat (Merck, Darmstadt, Deutschland) und 1 % Bleicitrat (Merck, Darmstadt, Deutschland) kontrastiert. Ultrastrukturelle Aufnahmen wurden mit einem JEM 2100F EXII Transmissionselektronenmikroskop (JEOL Ltd, Tokio, Japan) bei einer Beschleunigungsspannung von 80 kV angefertigt.
Die Morphologie von LX-2-Zellen, die 24 Stunden lang mit IPA behandelt wurden, wurde mittels Phasenkontrastmikroskopie bei 50-facher Vergrößerung mit einem inversen Lichtmikroskop von Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 und AxioCam MRm, Jena, Deutschland) analysiert.
Klinische Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung oder Median (Interquartilsabstand: IQR) angegeben. Unterschiede zwischen den drei Studiengruppen wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse (kontinuierliche Variablen) bzw. χ²-Test (kategoriale Variablen) verglichen. Die Falsch-Positiv-Rate (FDR) wurde zur Korrektur multipler Testungen herangezogen; Gene mit einer FDR < 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet. Die Korrelation zwischen CpG-DNA-Methylierung und IPA-Signalintensität wurde mittels Spearman-Korrelationsanalyse untersucht; die nominalen p-Werte (p < 0,05) wurden angegeben.
Mithilfe des webbasierten Gen-Set-Analyse-Tools WebGestalt wurde eine Pathway-Analyse für 268 Transkripte (nominaler p-Wert < 0,01), 119 mitochondrienassoziierte Transkripte (nominaler p-Wert < 0,05) und 4350 CpG-Dinukleotide von insgesamt 3093 Lebertranskripten durchgeführt, die mit den zirkulierenden Serum-IPA-Spiegeln assoziiert waren. Das frei verfügbare Tool Venny DB (Version 2.1.0) wurde zur Identifizierung überlappender Gene und StringDB (Version 11.5) zur Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen verwendet.
Im LX-2-Experiment wurden die Proben mittels D’Agostino-Pearson-Test auf Normalverteilung geprüft. Die Daten stammen aus mindestens drei biologischen Replikaten und wurden einer einfaktoriellen ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test unterzogen. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, und die Anzahl der Experimente ist in jeder Abbildung angegeben. Alle Analysen und Grafiken wurden mit der Statistiksoftware GraphPad Prism 8 für Windows (GraphPad Software Inc., Version 8.4.3, San Diego, USA) erstellt.
Zunächst untersuchten wir den Zusammenhang zwischen den Serum-IPA-Spiegeln und Leber-, Ganzkörper- und mitochondrialen Transkripten. Im Gesamttranskriptprofil war MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; Mitogen-aktivierte Proteinkinase-aktivierte Proteinkinase 3) das am stärksten mit den Serum-IPA-Spiegeln assoziierte Gen; im mitochondrienbezogenen Transkriptprofil war AKT1 (FDR = 0,7621; AKT Serin/Threonin-Kinase 1) das am stärksten assoziierte Gen (Zusatzdatei 1 und Zusatzdatei 2).
Anschließend analysierten wir globale Transkripte (n = 268; p < 0,01) und mitochondrienassoziierte Transkripte (n = 119; p < 0,05) und identifizierten schließlich die Apoptose als den signifikantesten kanonischen Signalweg (p = 0,0089). Bei den mit den Serum-IPA-Spiegeln assoziierten mitochondrialen Transkripten konzentrierten wir uns auf die Signalwege der Apoptose (FDR = 0,00001), der Mitophagie (FDR = 0,00029) und des TNF (FDR = 0,000006) (Abbildung 1A, Tabelle 2 und ergänzende Abbildungen 1A-B).
Überlappende Analyse globaler, mitochondrienassoziierter Transkripte und DNA-Methylierung in der menschlichen Leber in Zusammenhang mit Serum-IPA-Spiegeln. A zeigt 268 globale Transkripte, 119 mitochondrienassoziierte Transkripte und DNA-methylierte Transkripte, die 3092 CpG-Stellen zugeordnet sind, welche mit Serum-IPA-Spiegeln assoziiert sind (p-Werte < 0,01 für globale Transkripte und DNA-methylierte Transkripte sowie p-Werte < 0,05 für mitochondriale Transkripte). Die wichtigsten überlappenden Transkripte (AKT1 und YKT6) sind in der Mitte dargestellt. B: Die Interaktionskarte der 13 Gene mit dem höchsten Interaktionswert (0,900) wurde aus den 56 überlappenden Genen (schwarze Linie) erstellt, die signifikant mit Serum-IPA-Spiegeln assoziiert waren. Die Daten wurden mit dem Online-Tool StringDB ermittelt. Grün: Gene, die der Gen-Ontologie (GO)-Komponente „Zelluläre Komponente: Mitochondrien“ (GO:0005739) zugeordnet sind. AKT1 ist das Protein mit dem höchsten Score (0,900) für Interaktionen mit anderen Proteinen, basierend auf den Daten (Text Mining, Experimente, Datenbanken und Koexpression). Netzwerkknoten repräsentieren Proteine, Kanten Verbindungen zwischen Proteinen.
Da Darmmikrobiota-Metabolite die epigenetische Zusammensetzung durch DNA-Methylierung regulieren können [32], untersuchten wir, ob die Serum-IPA-Konzentration mit der DNA-Methylierung in der Leber assoziiert ist. Wir fanden heraus, dass die beiden wichtigsten Methylierungsstellen, die mit der Serum-IPA-Konzentration korrelieren, in der Nähe der Prolin-Serin-reichen Region 3 (C19orf55) und des Hitzeschockproteins der Familie B (klein), Mitglied 6 (HSPB6), liegen (Zusatzdatei 3). Die DNA-Methylierung von 4350 CpG-Dinukleotiden (p < 0,01) korrelierte mit der Serum-IPA-Konzentration und war in Signalwegen angereichert, die die Langlebigkeit regulieren (p = 0,006) (Abbildung 1A, Tabelle 2 und ergänzende Abbildung 1C).
Um die biologischen Mechanismen zu verstehen, die den Zusammenhängen zwischen Serum-IPA-Spiegeln, globalen Transkripten, mitochondrienassoziierten Transkripten und DNA-Methylierung in der menschlichen Leber zugrunde liegen, führten wir eine Überlappungsanalyse der in der vorherigen Pathway-Analyse identifizierten Gene durch (Abbildung 1A). Die Ergebnisse der Pathway-Anreicherung der 56 überlappenden Gene (innerhalb der schwarzen Linie in Abbildung 1A) zeigten, dass der Apoptose-Pathway (p = 0,00029) zwei Gene hervorhob, die in allen drei Analysen identifiziert wurden: AKT1 und YKT6 (YKT6 v-SNARE-Homolog), wie im Venn-Diagramm dargestellt (Ergänzende Abbildung 2 und Abbildung 1A). Interessanterweise stellten wir fest, dass AKT1 (cg19831386) und YKT6 (cg24161647) positiv mit den Serum-IPA-Spiegeln korrelierten (Zusatzdatei 3). Um potenzielle Proteininteraktionen zwischen Genprodukten zu identifizieren, wählten wir 13 Gene mit dem höchsten gemeinsamen Regions-Score (0,900) aus 56 überlappenden Genen als Eingabe aus und erstellten eine Interaktionskarte. Gemäß dem Konfidenzniveau (marginales Konfidenzniveau) befand sich das AKT1-Gen mit dem höchsten Score (0,900) an erster Stelle (Abbildung 1B).
Basierend auf der Pathway-Analyse stellten wir fest, dass Apoptose der Hauptweg ist. Daher untersuchten wir, ob eine IPA-Behandlung die Apoptose von HSCs in vitro beeinflusst. Wir konnten bereits zeigen, dass verschiedene IPA-Konzentrationen (10 μM, 100 μM und 1 mM) für LX-2-Zellen nicht toxisch sind [15]. Diese Studie zeigte, dass die Behandlung mit 10 μM und 100 μM IPA die Anzahl lebensfähiger und nekrotischer Zellen erhöhte. Im Vergleich zur Kontrollgruppe sank die Zellviabilität jedoch bei einer IPA-Konzentration von 1 mM, während die Nekroserate unverändert blieb (Abbildung 2A, B). Um die optimale Konzentration zur Induktion von Apoptose in LX-2-Zellen zu ermitteln, testeten wir anschließend 10 μM, 100 μM und 1 mM IPA über 24 Stunden (Abbildung 2A–E und ergänzende Abbildung 3A–B). Interessanterweise verringerten IPA 10 μM und 100 μM die Apoptoserate (%), jedoch erhöhte IPA 1 mM die späte Apoptose und die Apoptoserate (%) im Vergleich zur Kontrolle und wurde daher für weitere Experimente ausgewählt (Abbildungen 2A–D).
IPA induziert Apoptose in LX-2-Zellen. Die Apoptoserate und Zellmorphologie wurden mittels Durchflusszytometrie und Annexin-V/7-AAD-Doppelfärbung quantifiziert. BA-Zellen wurden 24 h lang mit 10 μM, 100 μM und 1 mM IPA oder mit F–H TGF-β1 (5 ng/ml) und 1 mM IPA in serumfreiem Medium inkubiert. A: Lebende Zellen (Annexin V -/ 7-AAD -); B: Nekrotische Zellen (Annexin V -/ 7-AAD +); C, F: Frühe Apoptose (Annexin V +/ 7-AAD -); D, G: Späte Apoptose (Annexin V +/ 7-AAD +); E, H: Prozentualer Anteil der frühen bzw. späten Apoptoserate (%). Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt; n = 3 unabhängige Experimente. Statistische Vergleiche wurden mittels einfaktorieller ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test durchgeführt. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Wie wir bereits gezeigt haben, kann 5 ng/ml TGF-β1 die HSC-Aktivierung durch Erhöhung der Expression klassischer Marker-Gene induzieren [15]. LX-2-Zellen wurden mit 5 ng/ml TGF-β1 und 1 mM IPA in Kombination behandelt (Abb. 2E–H). Die TGF-β1-Behandlung allein veränderte die Apoptoserate nicht, die gleichzeitige Behandlung mit IPA erhöhte jedoch die späte Apoptose und die Apoptoserate (%) im Vergleich zur TGF-β1-Behandlung (Abb. 2E–H). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass 1 mM IPA die Apoptose in LX-2-Zellen unabhängig von der TGF-β1-Induktion fördern kann.
Wir untersuchten weiterhin die Wirkung von IPA auf die mitochondriale Atmung in LX-2-Zellen. Die Ergebnisse zeigten, dass 1 mM IPA die Parameter der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) – nicht-mitochondriale Atmung, basale und maximale Atmung, Protonenleck und ATP-Produktion – im Vergleich zur Kontrollgruppe verringerte (Abbildung 3A, B), während der bioenergetische Gesundheitsindex (BHI) unverändert blieb.
IPA reduziert die mitochondriale Atmung in LX-2-Zellen. Die mitochondriale Atmungskurve (OCR) wird anhand der mitochondrialen Atmungsparameter (nicht-mitochondriale Atmung, basale Atmung, maximale Atmung, Protonenleck, ATP-Produktion, SRC und BHI) dargestellt. Zellen A und B wurden jeweils 24 h lang mit 10 μM, 100 μM bzw. 1 mM IPA inkubiert. Zellen C und D wurden jeweils 24 h lang mit TGF-β1 (5 ng/ml) und 1 mM IPA in serumfreiem Medium inkubiert. Alle Messwerte wurden mithilfe des CyQuant-Kits auf den DNA-Gehalt normiert. BHI: Bioenergetischer Gesundheitsindex; SRC: Respiratorische Reservekapazität; OCR: Sauerstoffverbrauchsrate. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt (n = 5 unabhängige Experimente). Statistische Vergleiche wurden mittels einfaktorieller ANOVA und Bonferroni-Post-hoc-Test durchgeführt. *p < 0,05; **p < 0,01; und ***p < 0,001
Um die Wirkung von IPA auf das bioenergetische Profil von TGF-β1-aktivierten LX-2-Zellen besser zu verstehen, analysierten wir die mitochondriale oxidative Phosphorylierung mittels OCR (Abb. 3C,D). Die Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung mit TGF-β1 die maximale Atmung, die respiratorische Reservekapazität (SRC) und den BHI im Vergleich zur Kontrollgruppe reduzierte (Abb. 3C,D). Die Kombinationsbehandlung verringerte die basale Atmung, den Protonenleck und die ATP-Produktion, jedoch waren SRC und BHI signifikant höher als bei der Behandlung mit TGF-β1 (Abb. 3C,D).
Wir führten außerdem den „Zellulären Energiephänotyp-Test“ der Seahorse-Software durch (Ergänzende Abb. 4A–D). Wie in der ergänzenden Abb. 3B dargestellt, waren sowohl das OCR- als auch das ECAR-Stoffwechselpotenzial nach TGF-β1-Behandlung verringert. Im Vergleich zur Kontrollgruppe wurde jedoch kein Unterschied zwischen den Gruppen mit Kombinationsbehandlung und IPA-Behandlung beobachtet. Des Weiteren waren sowohl die basalen als auch die Stresswerte des OCR nach Kombinationsbehandlung und IPA-Behandlung im Vergleich zur Kontrollgruppe reduziert (Ergänzende Abb. 4C). Interessanterweise zeigte sich bei der Kombinationstherapie ein ähnliches Muster: Die basalen und Stresswerte des ECAR blieben im Vergleich zur TGF-β1-Behandlung unverändert (Ergänzende Abb. 4C). In HSCs veränderten die Reduktion der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung und die Fähigkeit der Kombinationsbehandlung, SCR und BHI nach TGF-β1-Exposition wiederherzustellen, das Stoffwechselpotenzial (OCR und ECAR) nicht. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass IPA die Bioenergetik in HSCs verringern kann, was darauf schließen lässt, dass IPA ein niedrigeres Energieprofil induzieren kann, das den HSC-Phänotyp in Richtung Inaktivierung verschiebt (Ergänzende Abbildung 4D).
Der Einfluss von IPA auf die mitochondriale Dynamik wurde mittels dreidimensionaler Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie und Netzwerkverbindungen sowie MTR-Färbung untersucht (Abbildung 4 und ergänzende Abbildung 5). Abbildung 4 zeigt, dass die TGF-β1-Behandlung im Vergleich zur Kontrollgruppe die mittlere Oberfläche, die Anzahl der Verzweigungen, die Gesamtlänge der Verzweigungen und die Anzahl der Verzweigungspunkte verringerte (Abbildung 4A und B) und den Anteil der Mitochondrien von sphärischer zu intermediärer Morphologie veränderte (Abbildung 4C). Nur die IPA-Behandlung verringerte das mittlere mitochondriale Volumen und veränderte den Anteil der Mitochondrien von sphärischer zu intermediärer Morphologie im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 4A). Im Gegensatz dazu blieben Sphärizität, mittlere Verzweigungslänge und die mittels membranpotenzialabhängiger MTR gemessene mitochondriale Aktivität (Abbildung 4A und E) unverändert, und diese Parameter unterschieden sich nicht zwischen den Gruppen. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Behandlung mit TGF-β1 und IPA die Form und Größe der Mitochondrien sowie die Netzwerkkomplexität in lebenden LX-2-Zellen zu modulieren scheint.
IPA verändert die mitochondriale Dynamik und die mitochondriale DNA-Menge in LX-2-Zellen. A. Repräsentative konfokale Aufnahmen von lebenden LX-2-Zellen, die 24 h in serumfreiem Medium mit TGF-β1 (5 ng/ml) und 1 mM IPA inkubiert wurden. Dargestellt sind mitotracker™ Red CMXRos angefärbte mitochondriale Netzwerke und mit DAPI blau angefärbte Zellkerne. Alle Datensätze umfassen mindestens 15 Bilder pro Gruppe. Für jeden Probentyp wurden 10 Z-Stapel-Bilder aufgenommen. Jede Z-Achsen-Sequenz enthielt 30 Schichten mit einer Dicke von jeweils 9,86 μm. Maßstabsbalken: 10 μm. B. Repräsentative Objekte (nur Mitochondrien), die durch adaptive Schwellenwertsetzung im Bild identifiziert wurden. Die quantitative Analyse und der Vergleich der morphologischen Netzwerkverbindungen der Mitochondrien wurden für alle Zellen jeder Gruppe durchgeführt. C. Häufigkeit der mitochondrialen Formverhältnisse. Werte nahe 0 deuten auf sphärische, Werte nahe 1 auf filamentöse Formen hin. D Der Gehalt an mitochondrialer DNA (mtDNA) wurde wie in Material und Methoden beschrieben bestimmt. E Die Mitotracker™ Red CMXRos-Analyse wurde mittels Durchflusszytometrie (30.000 Ereignisse) wie in Material und Methoden beschrieben durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt (n = 3 unabhängige Experimente). Statistische Vergleiche wurden mittels einfaktorieller ANOVA und Bonferroni-Post-hoc-Test durchgeführt. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Anschließend analysierten wir den mtDNA-Gehalt in LX-2-Zellen als Indikator für die Mitochondrienzahl. Im Vergleich zur Kontrollgruppe war der mtDNA-Gehalt in der mit TGF-β1 behandelten Gruppe erhöht (Abbildung 4D). Im Vergleich zur mit TGF-β1 behandelten Gruppe war der mtDNA-Gehalt in der Gruppe mit der Kombinationsbehandlung verringert (Abbildung 4D). Dies deutet darauf hin, dass IPA den mtDNA-Gehalt und möglicherweise auch die Mitochondrienzahl sowie die mitochondriale Atmung reduzieren kann (Abbildung 3C). Darüber hinaus schien IPA den mtDNA-Gehalt in der Kombinationsbehandlung zu reduzieren, hatte aber keinen Einfluss auf die MTR-vermittelte mitochondriale Aktivität (Abbildungen 4A–C).
Wir untersuchten den Zusammenhang zwischen IPA und den mRNA-Spiegeln von Genen, die mit Fibrose, Apoptose, Überleben und mitochondrialer Dynamik in LX-2-Zellen assoziiert sind (Abbildung 5A–D). Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte die mit TGF-β1 behandelte Gruppe eine erhöhte Expression von Genen wie der Kollagen-Typ-I-α2-Kette (COL1A2), α-glatter Muskelaktin (αSMA), Matrix-Metalloproteinase 2 (MMP2), Gewebeinhibitor der Metalloproteinase 1 (TIMP1) und dem Dynamin-1-ähnlichen Gen (DRP1), was auf verstärkte Fibrose und Aktivierung hindeutet. Des Weiteren reduzierte die Behandlung mit TGF-β1 im Vergleich zur Kontrollgruppe die mRNA-Spiegel des nukleären Pregnan-X-Rezeptors (PXR), von Caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, Inhibitor von B-Zell-α, Enhancer des nukleären Faktors κ-Gens (NFκB1A) und Inhibitor der nukleären Faktor-κB-Kinase-Untereinheit β (IKBKB) (Abbildung 5A–D). Im Vergleich zur TGF-β1-Behandlung allein reduzierte die Kombinationstherapie mit TGF-β1 und IPA die Expression von COL1A2 und MMP2, erhöhte jedoch die mRNA-Spiegel von PXR, TIMP1, B-Zell-Lymphom-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β und IKBKB. Die IPA-Behandlung reduzierte die Expression von MMP2, Bcl-2-assoziiertem Protein X (BAX), AKT1, Optikusatrophie-Protein 1 (OPA1) und mitochondrialem Fusionsprotein 2 (MFN2) signifikant, während die Expression von CASP8, NFκB1A, NFκB1B und IKBKB im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht war. Die Expression von Caspase-3 (CASP3), apoptotischem Peptidase-Aktivierungsfaktor 1 (APAF1), mitochondrialem Fusionsprotein 1 (MFN1) und Fissionsprotein 1 (FIS1) zeigte hingegen keine Unterschiede. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die IPA-Behandlung die Expression von Genen moduliert, die mit Fibrose, Apoptose, Überleben und mitochondrialer Dynamik assoziiert sind. Unsere Daten legen nahe, dass die IPA-Behandlung die Fibrose in LX-2-Zellen reduziert und gleichzeitig das Überleben durch eine Verschiebung des Phänotyps hin zur Inaktivierung fördert.
IPA moduliert die Expression von Fibroblasten-, Apoptose-, Überlebens- und Mitochondriendynamik-Genen in LX-2-Zellen. Die Histogramme zeigen die mRNA-Expression relativ zur endogenen Kontrolle (RPLP0 oder PPIA) nach 24-stündiger Induktion von LX-2-Zellen mit TGF-β1 und IPA in serumfreiem Medium. A steht für Fibroblasten, B für apoptotische Zellen, C für überlebende Zellen und D für die Genexpression der Mitochondriendynamik. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt (n = 3 unabhängige Experimente). Statistische Vergleiche wurden mittels einfaktorieller ANOVA und Bonferroni-Post-hoc-Test durchgeführt. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Anschließend wurden Veränderungen der Zellgröße (FSC-H) und der zytoplasmatischen Komplexität (SSC-H) mittels Durchflusszytometrie (Abb. 6A,B) und Veränderungen der Zellmorphologie nach IPA-Behandlung mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Phasenkontrastmikroskopie (Ergänzende Abb. 6A-B) analysiert. Wie erwartet, wiesen die Zellen der TGF-β1-behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe eine erhöhte Größe auf (Abb. 6A,B). Dies zeigte die klassische Expansion des rauen endoplasmatischen Retikulums (ER*) und der Phagolysosomen (P), was auf eine Aktivierung hämatopoetischer Stammzellen (HSC) hindeutet (Ergänzende Abb. 6A). Im Vergleich zur TGF-β1-behandelten Gruppe waren jedoch Zellgröße, zytoplasmatische Komplexität (Abb. 6A,B) und ER*-Gehalt in der Gruppe mit kombinierter Behandlung mit TGF-β1 und IPA verringert (Ergänzende Abb. 6A). Des Weiteren verringerte die IPA-Behandlung die Zellgröße, die zytoplasmatische Komplexität (Abb. 6A,B) sowie den P- und ER*-Gehalt (Ergänzende Abb. 6A) im Vergleich zur Kontrollgruppe. Zusätzlich erhöhte sich der Anteil apoptotischer Zellen nach 24-stündiger IPA-Behandlung im Vergleich zur Kontrollgruppe (weiße Pfeile, Ergänzende Abb. 6B). Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass 1 mM IPA die Apoptose von HSCs stimulieren und die durch TGF-β1 induzierten Veränderungen der zellmorphologischen Parameter umkehren kann. Dadurch werden Zellgröße und -komplexität reguliert, was mit einer Inaktivierung von HSCs in Zusammenhang stehen könnte.
IPA verändert die Zellgröße und die zytoplasmatische Komplexität von LX-2-Zellen. Repräsentative Bilder der Durchflusszytometrie-Analyse. Die Analyse erfolgte mit einer spezifischen Gating-Strategie für LX-2-Zellen: SSC-A/FSC-A zur Definition der Zellpopulation, FSC-H/FSC-A zur Identifizierung von Zelldubletten und SSC-H/FSC-H zur Analyse von Zellgröße und -komplexität. Die Zellen wurden 24 h lang in serumfreiem Medium mit TGF-β1 (5 ng/ml) und 1 mM IPA inkubiert. Für die Analyse von Zellgröße und zytoplasmatischer Komplexität wurden die LX-2-Zellen in folgende Quadranten eingeteilt: unterer linker Quadrant (SSC-H-/FSC-H-), oberer linker Quadrant (SSC-H+/FSC-H-), unterer rechter Quadrant (SSC-H-/FSC-H+) und oberer rechter Quadrant (SSC-H+/FSC-H+). B. Die Zellmorphologie wurde mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von FSC-H (Vorwärtsstreuung, Zellgröße) und SSC-H (Seitwärtsstreuung, zytoplasmatische Komplexität) analysiert (30.000 Ereignisse). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt; n = 3 unabhängige Experimente. Statistische Vergleiche wurden mittels einfaktorieller ANOVA und Bonferroni-Post-hoc-Test durchgeführt. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 und ****p < 0,0001
Darmmetaboliten wie IPA sind in den Fokus der Forschung gerückt und deuten darauf hin, dass neue Zielstrukturen in der Darmmikrobiota entdeckt werden könnten. Interessanterweise zeigte sich IPA, ein Metabolit, den wir mit Leberfibrose beim Menschen in Verbindung gebracht haben [15], in Tiermodellen als potenziell antifibrotische Substanz [13, 14]. Hier demonstrieren wir erstmals einen Zusammenhang zwischen Serum-IPA und der globalen Lebertranskriptomik sowie der DNA-Methylierung bei adipösen Personen ohne Typ-2-Diabetes (T2D). Dabei heben wir Apoptose, Mitophagie und Langlebigkeit hervor und identifizieren das Gen AKT1 als mögliches Kandidatengen für die Regulation der Leberhomöostase. Eine weitere Neuheit unserer Studie ist der Nachweis der Wechselwirkung einer IPA-Behandlung mit Apoptose, Zellmorphologie, mitochondrialer Bioenergetik und Dynamik in LX-2-Zellen. Dies deutet auf ein niedrigeres Energiespektrum hin, das den HSC-Phänotyp in Richtung Inaktivierung verschiebt und IPA somit zu einem potenziellen Kandidaten für die Verbesserung der Leberfibrose macht.
Wir fanden heraus, dass Apoptose, Mitophagie und Langlebigkeit die wichtigsten kanonischen Signalwege sind, die in Lebergenen angereichert sind, welche mit zirkulierendem Serum-IPA assoziiert sind. Eine Störung des mitochondrialen Qualitätskontrollsystems (MQC) kann zu mitochondrialer Dysfunktion, Mitophagie und Apoptose führen und dadurch das Auftreten von MASLD begünstigen [33, 34]. Daher lässt sich vermuten, dass IPA über Apoptose, Mitophagie und Langlebigkeit an der Aufrechterhaltung der Zelldynamik und der mitochondrialen Integrität in der Leber beteiligt sein könnte. Unsere Daten zeigten, dass zwei Gene in allen drei Assays übereinstimmten: YKT6 und AKT1. YKT6 ist ein SNARE-Protein, das an der Zellmembranfusion beteiligt ist. Es spielt eine Rolle bei Autophagie und Mitophagie, indem es mit STX17 und SNAP29 einen Initiationskomplex am Autophagosom bildet und so die Fusion von Autophagosomen und Lysosomen fördert [35]. Des Weiteren führt der Funktionsverlust von YKT6 zu einer beeinträchtigten Mitophagie [36], während die Hochregulation von YKT6 mit der Progression des hepatozellulären Karzinoms (HCC) assoziiert ist und ein erhöhtes Zellüberleben zeigt [37]. AKT1 ist das wichtigste interagierende Gen und spielt eine bedeutende Rolle bei Lebererkrankungen, unter anderem im PI3K/AKT-Signalweg, im Zellzyklus, bei der Zellmigration, der Proliferation, der fokalen Adhäsion, der Mitochondrienfunktion und der Kollagensekretion [38–40]. Ein aktivierter PI3K/AKT-Signalweg kann hämatopoetische Stammzellen (HSCs) aktivieren, die für die Produktion der extrazellulären Matrix (ECM) verantwortlich sind. Seine Dysregulation kann zur Entstehung und zum Fortschreiten der Leberfibrose beitragen [40]. Darüber hinaus ist AKT einer der wichtigsten Zellüberlebensfaktoren, der die p53-abhängige Apoptose hemmt, und die AKT-Aktivierung kann mit der Hemmung der Leberzellapoptose assoziiert sein [41, 42]. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass IPA an der mitochondrienassoziierten Apoptose der Leber beteiligt sein könnte, indem es die Entscheidung der Hepatozyten zwischen Apoptose und Überleben beeinflusst. Diese Effekte könnten durch die Kandidatengene AKT und/oder YKT6 reguliert werden, die für die Leberhomöostase von entscheidender Bedeutung sind.
Unsere Ergebnisse zeigten, dass 1 mM IPA in LX-2-Zellen unabhängig von einer TGF-β1-Behandlung Apoptose induzierte und die mitochondriale Atmung verringerte. Apoptose ist ein wichtiger Mechanismus zur Auflösung von Fibrose und zur Aktivierung hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) und spielt zudem eine Schlüsselrolle in der reversiblen physiologischen Reaktion auf Leberfibrose [4, 43]. Darüber hinaus lieferte die Wiederherstellung des BHI in LX-2-Zellen nach kombinierter Behandlung neue Erkenntnisse über die potenzielle Rolle von IPA bei der Regulation der mitochondrialen Bioenergetik. Unter Ruhebedingungen nutzen hämatopoetische Zellen normalerweise die mitochondriale oxidative Phosphorylierung zur ATP-Produktion und weisen eine geringe metabolische Aktivität auf. Die Aktivierung von HSCs hingegen steigert die mitochondriale Atmung und Biosynthese, um den Energiebedarf beim Eintritt in die Glykolyse zu decken [44]. Die Tatsache, dass IPA das metabolische Potenzial und den ECAR nicht beeinflusste, deutet darauf hin, dass der glykolytische Stoffwechselweg eine geringere Priorität hat. Eine weitere Studie zeigte, dass 1 mM IPA die Aktivität der mitochondrialen Atmungskette in Kardiomyozyten, der humanen Hepatozyten-Zelllinie Huh7 und humanen Nabelschnurvenenendothelzellen (HUVEC) modulieren konnte. Allerdings wurde kein Effekt von IPA auf die Glykolyse in Kardiomyozyten festgestellt, was darauf hindeutet, dass IPA die Bioenergetik anderer Zelltypen beeinflussen könnte [45]. Daher vermuten wir, dass 1 mM IPA als milder chemischer Entkoppler wirken könnte, da es die Expression fibrogenetischer Gene, die Zellmorphologie und die mitochondriale Bioenergetik signifikant reduzieren kann, ohne die Menge an mtDNA zu verändern [46]. Mitochondriale Entkoppler können kulturinduzierte Fibrose und die Aktivierung von HSCs hemmen [47] und die mitochondriale ATP-Produktion reduzieren, die durch bestimmte Proteine ​​wie Entkopplungsproteine ​​(UCP) oder Adeninnukleotid-Translokase (ANT) reguliert oder induziert wird. Je nach Zelltyp kann dieses Phänomen Zellen vor Apoptose schützen und/oder die Apoptose fördern [46]. Weitere Studien sind jedoch erforderlich, um die Rolle von IPA als mitochondrialer Entkoppler bei der Inaktivierung hämatopoetischer Stammzellen aufzuklären.
Wir untersuchten anschließend, ob sich die Veränderungen der mitochondrialen Atmung in der mitochondrialen Morphologie lebender LX-2-Zellen widerspiegeln. Interessanterweise verändert die Behandlung mit TGF-β1 das Verhältnis der Mitochondrien von sphärisch zu intermediär, begleitet von einer verringerten mitochondrialen Verzweigung und einer erhöhten Expression von DRP1, einem Schlüsselfaktor der mitochondrialen Fission [48]. Darüber hinaus korreliert die mitochondriale Fragmentierung mit der Gesamtkomplexität des mitochondrialen Netzwerks, und der Übergang von der Fusion zur Fission ist entscheidend für die Aktivierung hämatopoetischer Stammzellen (HSCs), während die Hemmung der mitochondrialen Fission zur Apoptose von HSCs führt [49]. Unsere Ergebnisse deuten somit darauf hin, dass die Behandlung mit TGF-β1 eine Verringerung der Komplexität des mitochondrialen Netzwerks mit einer verminderten Verzweigung induzieren kann, wie sie häufiger bei der mitochondrialen Fission aktivierter hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) auftritt. Unsere Daten zeigten zudem, dass IPA den Anteil sphärischer Mitochondrien von einer intermediären Form verändern und dadurch die Expression von OPA1 und MFN2 reduzieren kann. Studien haben gezeigt, dass eine Herunterregulierung von OPA1 zu einer Abnahme des mitochondrialen Membranpotenzials und zur Auslösung von Zelltod (Apoptose) führen kann [50]. MFN2 ist bekannt dafür, die mitochondriale Fusion und Apoptose zu vermitteln [51]. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Induktion von LX-2-Zellen durch TGF-β1 und/oder IPA die Form und Größe der Mitochondrien sowie deren Aktivierungszustand und Netzwerkkomplexität moduliert.
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Kombinationstherapie mit TGFβ-1 und IPA die mtDNA-Menge und zellmorphologische Parameter durch die Regulation der mRNA-Expression von Fibrose-, Apoptose- und Überlebensgenen in apoptoseresistenten Zellen reduzieren kann. Tatsächlich senkte IPA die mRNA-Expression von AKT1 und wichtigen Fibrosegenen wie COL1A2 und MMP2, erhöhte aber die Expression von CASP8, einem mit Apoptose assoziierten Protein. Unsere Ergebnisse zeigten, dass nach IPA-Behandlung die BAX-Expression abnahm und die mRNA-Expression von TIMP1-Familienuntereinheiten, BCL-2 und NF-κB zunahm. Dies legt nahe, dass IPA Überlebenssignale in apoptoseresistenten hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) stimulieren kann. Diese Moleküle könnten in aktivierten hämatopoetischen Stammzellen als Überlebenssignale wirken, was mit einer erhöhten Expression antiapoptotischer Proteine ​​(wie Bcl-2), einer verringerten Expression des proapoptotischen Proteins BAX und einem komplexen Zusammenspiel zwischen TIMP und NF-κB einhergehen kann [5, 7]. IPA entfaltet seine Wirkung über PXR, und wir stellten fest, dass die Kombinationstherapie mit TGF-β1 und IPA die PXR-mRNA-Expression erhöhte, was auf eine Suppression der HSC-Aktivierung hindeutet. Es ist bekannt, dass aktivierte PXR-Signalwege die HSC-Aktivierung sowohl in vivo als auch in vitro hemmen [52, 53]. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass IPA zur Eliminierung aktivierter HSCs beitragen kann, indem es die Apoptose fördert, Fibrose und den mitochondrialen Stoffwechsel reduziert und Überlebenssignale verstärkt. Diese Prozesse führen typischerweise zur Umwandlung des aktivierten HSC-Phänotyps in einen inaktivierten. Eine weitere mögliche Erklärung für den potenziellen Mechanismus und die Rolle von IPA bei der Apoptose ist, dass es dysfunktionale Mitochondrien primär über Mitophagie (intrinsischer Signalweg) und den extrinsischen TNF-Signalweg (Tabelle 1) abbaut, der direkt mit dem NF-κB-Überlebenssignalweg verknüpft ist (Ergänzende Abbildung 7). Interessanterweise können IPA-assoziierte angereicherte Gene pro-apoptotische und pro-Überlebenssignale im apoptotischen Signalweg induzieren [54], was darauf hindeutet, dass IPA durch Interaktion mit diesen Genen den apoptotischen Signalweg oder das Überleben beeinflussen könnte. Wie IPA jedoch während der HSC-Aktivierung Apoptose oder Überleben induziert und welche Mechanismen dabei eine Rolle spielen, ist weiterhin unklar.
IPA ist ein mikrobieller Metabolit, der aus dem Nahrungs-Tryptophan durch die Darmmikrobiota gebildet wird. Studien haben gezeigt, dass es im Darmmilieu entzündungshemmende, antioxidative und epigenetisch-regulatorische Eigenschaften besitzt.[55] Weitere Studien belegen, dass IPA die Darmbarrierefunktion modulieren und oxidativen Stress reduzieren kann, was zu seinen lokalen physiologischen Wirkungen beitragen dürfte.[56] IPA wird über den Blutkreislauf zu den Zielorganen transportiert. Da IPA eine ähnliche Hauptmetabolitstruktur wie Tryptophan, Serotonin und Indolderivate aufweist, übt es metabolische Wirkungen aus, die zu kompetitiven Stoffwechselwegen führen.[52] IPA kann mit Tryptophan-Derivaten um Bindungsstellen an Enzymen oder Rezeptoren konkurrieren und dadurch möglicherweise normale Stoffwechselwege stören. Dies unterstreicht die Notwendigkeit weiterer Studien zu seiner Pharmakokinetik und Pharmakodynamik, um sein therapeutisches Fenster besser zu verstehen.[57] Es bleibt abzuwarten, ob dies auch in hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) der Fall ist.
Wir sind uns der Einschränkungen unserer Studie bewusst. Um gezielt Zusammenhänge mit IPA zu untersuchen, schlossen wir Patienten mit Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) aus. Wir erkennen an, dass dies die allgemeine Übertragbarkeit unserer Ergebnisse auf Patienten mit Typ-2-Diabetes mellitus und fortgeschrittener Lebererkrankung einschränkt. Obwohl die physiologische Konzentration von IPA im menschlichen Serum 1–10 μM beträgt [11, 20], wurde eine Konzentration von 1 mM IPA gewählt, basierend auf der höchsten nicht-toxischen Konzentration [15] und der höchsten Apoptoserate, ohne Unterschied im Anteil nekrotischer Zellen. Obwohl in dieser Studie supraphysiologische IPA-Konzentrationen verwendet wurden, besteht derzeit kein Konsens über die effektive Dosis von IPA [52]. Obwohl unsere Ergebnisse signifikant sind, bleibt der umfassendere Metabolismus von IPA ein aktives Forschungsgebiet. Darüber hinaus wurden unsere Ergebnisse zum Zusammenhang zwischen Serum-IPA-Konzentrationen und der DNA-Methylierung von Lebertranskripten nicht nur aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs), sondern auch aus Lebergewebe gewonnen. Wir entschieden uns für die Verwendung humaner LX-2-Zellen, da unsere vorherigen Transkriptomanalysen gezeigt hatten, dass IPA mit der Aktivierung hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) assoziiert ist [15] und HSCs die Hauptzellen im Verlauf der Leberfibrose darstellen. Da die Leber aus verschiedenen Zelltypen besteht, sollten neben IPA auch andere Zellmodelle, wie beispielsweise ein Hepatozyten-HSC-Immunzell-Kokultursystem in Kombination mit Caspase-Aktivierung und DNA-Fragmentierung, sowie der Wirkmechanismus auf Proteinebene untersucht werden, um die Rolle von IPA und seine Interaktion mit anderen Leberzelltypen zu erforschen.