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Schwefelwasserstoff (H₂S) hat vielfältige physiologische und pathologische Wirkungen auf den menschlichen Körper. Natriumhydrogensulfid (NaHS) wird häufig als pharmakologisches Werkzeug zur Untersuchung der H₂S-Wirkungen in biologischen Experimenten eingesetzt. Obwohl der H₂S-Verlust aus NaHS-Lösungen nur wenige Minuten dauert, wurden NaHS-Lösungen in einigen Tierstudien als H₂S-Donatoren im Trinkwasser verwendet. Diese Studie untersuchte, ob Trinkwasser mit einer NaHS-Konzentration von 30 μM, das in Ratten-/Mäuseflaschen zubereitet wurde, wie von einigen Autoren vorgeschlagen, mindestens 12–24 Stunden stabil bleibt. Eine NaHS-Lösung (30 μM) wurde in Trinkwasser hergestellt und sofort in Ratten-/Mäuse-Trinkflaschen gefüllt. Proben wurden nach 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 und 24 Stunden von der Spitze und aus dem Inneren der Trinkflasche entnommen, um den Sulfidgehalt mittels der Methylenblaumethode zu bestimmen. Zusätzlich wurden männliche und weibliche Ratten zwei Wochen lang mit NaHS (30 μM) injiziert. Die Serum-Sulfidkonzentrationen wurden in der ersten Woche jeden zweiten Tag und am Ende der zweiten Woche gemessen. Die NaHS-Lösung in der Probe, die von der Spitze der Wasserflasche entnommen wurde, war instabil; ihre Konzentration sank nach 12 bzw. 24 Stunden um 72 % bzw. 75 %. In Proben aus dem Inneren der Wasserflaschen war der Rückgang der NaHS-Konzentration innerhalb von zwei Stunden nicht signifikant; nach 12 bzw. 24 Stunden sank sie jedoch um 47 % bzw. 72 %. Die NaHS-Injektion hatte keinen Einfluss auf den Serum-Sulfidspiegel männlicher und weiblicher Ratten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass aus Trinkwasser hergestellte NaHS-Lösungen aufgrund ihrer Instabilität nicht zur H₂S-Verabreichung verwendet werden sollten. Diese Verabreichungsart führt zu einer unregelmäßigen und geringeren NaHS-Belastung der Tiere als erwartet.
Schwefelwasserstoff (H₂S) wird seit 1700 als Toxin eingesetzt; seine mögliche Rolle als endogenes Biosignalmolekül wurde jedoch erst 1996 von Abe und Kimura beschrieben. In den letzten drei Jahrzehnten wurden zahlreiche Funktionen von H₂S in verschiedenen menschlichen Systemen aufgeklärt, was zu der Erkenntnis führte, dass H₂S-Donormoleküle klinische Anwendungsmöglichkeiten bei der Behandlung oder dem Management bestimmter Krankheiten haben könnten; siehe Chirino et al. für einen aktuellen Überblick.
Natriumhydrogensulfid (NaHS) wird häufig als pharmakologisches Werkzeug zur Untersuchung der Wirkung von H₂S in Zellkultur- und Tierstudien eingesetzt⁵,⁶,⁷,⁸. NaHS ist jedoch kein idealer H₂S-Donor, da es in Lösung schnell in H₂S/HS⁻ umgewandelt wird, leicht mit Polysulfiden verunreinigt wird und leicht oxidiert und verflüchtigt wird⁴,⁹. In vielen biologischen Experimenten wird NaHS in Wasser gelöst, was zu passiver Verflüchtigung und Verlust von H₂S¹⁰,¹¹,¹², spontaner Oxidation von H₂S¹¹,¹²,¹³ und Photolyse¹⁴ führt. Sulfid in der ursprünglichen Lösung geht durch die Verflüchtigung von H₂S sehr schnell verloren¹¹. In einem offenen Gefäß beträgt die Halbwertszeit (t½) von H₂S etwa 5 Minuten, und seine Konzentration nimmt pro Minute um etwa 13 % ab¹⁰. Obwohl der Verlust von Schwefelwasserstoff aus NaHS-Lösungen nur wenige Minuten dauert, wurden in einigen Tierstudien NaHS-Lösungen über einen Zeitraum von 1–21 Wochen als Schwefelwasserstoffquelle im Trinkwasser verwendet, wobei die NaHS-haltige Lösung alle 12–24 Stunden ausgetauscht wurde.^{15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26} Dieses Vorgehen widerspricht den Prinzipien wissenschaftlicher Forschung, da die Dosierung von Arzneimitteln auf deren Anwendung bei anderen Spezies, insbesondere beim Menschen, basieren sollte.²⁷
Die präklinische Forschung in der Biomedizin zielt darauf ab, die Qualität der Patientenversorgung oder die Behandlungsergebnisse zu verbessern. Die Ergebnisse der meisten Tierstudien konnten jedoch bisher nicht auf den Menschen übertragen werden^28,29,30. Ein Grund für dieses Scheitern der Translation ist die mangelnde Berücksichtigung der methodischen Qualität von Tierstudien³⁰. Daher war das Ziel dieser Studie, zu untersuchen, ob 30 μM NaHS-Lösungen, die in Ratten-/Mäuse-Trinkflaschen hergestellt wurden, im Trinkwasser 12–24 Stunden lang stabil bleiben, wie in einigen Studien behauptet oder angedeutet.
Alle Experimente dieser Studie wurden gemäß den in Iran veröffentlichten Richtlinien für die Haltung und Verwendung von Labortieren durchgeführt³¹. Alle Versuchsberichte dieser Studie folgten zudem den ARRIVE-Richtlinien³². Die Ethikkommission des Instituts für Endokrinologie der Shahid-Beheshti-Universität für Medizinische Wissenschaften genehmigte alle experimentellen Verfahren dieser Studie.
Zinkacetat-Dihydrat (CAS: 5970-45-6) und wasserfreies Eisen(III)-chlorid (CAS: 7705-08-0) wurden von Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Frankreich) bezogen. Natriumhydrogensulfid-Hydrat (CAS: 207683-19-0) und N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin (DMPD) (CAS: 535-47-0) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Isofluran wurde von Piramal (Bethlehem, PA, USA) bezogen. Salzsäure (HCl) wurde von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen.
Bereiten Sie eine NaHS-Lösung (30 μM) in Trinkwasser zu und füllen Sie diese sofort in die Wasserflaschen der Ratten/Mäuse. Diese Konzentration wurde basierend auf zahlreichen Publikationen gewählt, die NaHS als H₂S-Quelle verwenden (siehe Abschnitt „Diskussion“). NaHS ist ein hydratisiertes Molekül, das unterschiedliche Mengen an Kristallwasser enthalten kann (d. h. NaHS·xH₂O). Laut Herstellerangaben betrug der Anteil an NaHS in unserer Studie 70,7 % (d. h. NaHS·1,3 H₂O). Diesen Wert haben wir in unseren Berechnungen berücksichtigt und dabei ein Molekulargewicht von 56,06 g/mol verwendet, das dem von wasserfreiem NaHS entspricht. Kristallwasser (auch Hydratwasser genannt) sind die Wassermoleküle, aus denen die Kristallstruktur besteht.³³ Hydrate weisen im Vergleich zu Anhydraten andere physikalische und thermodynamische Eigenschaften auf.³⁴
Vor Zugabe von NaHS zum Trinkwasser wurden pH-Wert und Temperatur der Lösung gemessen. Die NaHS-Lösung wurde sofort in die Trinkflasche der Ratte/Maus im Tierkäfig gegeben. Zur Bestimmung des Sulfidgehalts wurden nach 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 und 24 Stunden Proben von der Spitze und aus dem Inneren der Trinkflasche entnommen. Die Sulfidmessungen erfolgten unmittelbar nach jeder Probenahme. Die Proben wurden von der Spitze des Röhrchens entnommen, da einige Studien gezeigt haben, dass die geringe Porengröße des Röhrchens die H₂S-Verdunstung minimieren kann^15,19. Dies scheint auch für die Lösung in der Flasche zu gelten. Anders verhielt es sich jedoch mit der Lösung im Flaschenhals, die eine höhere Verdunstungsrate aufwies und autoxidierend wirkte; die Tiere tranken dieses Wasser sogar zuerst.
Für die Studie wurden männliche und weibliche Wistar-Ratten verwendet. Die Ratten wurden in Polypropylenkäfigen (2–3 Ratten pro Käfig) unter Standardbedingungen (Temperatur 21–26 °C, Luftfeuchtigkeit 32–40 %) mit einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus (7–19 Uhr und 19–7 Uhr) gehalten. Sie hatten freien Zugang zu Leitungswasser und wurden mit Standardfutter (Khorak Dam Pars Company, Teheran, Iran) gefüttert. Jeweils 10 weibliche (190–230 g) und 10 männliche (320–370 g) Wistar-Ratten gleichen Alters (6 Monate) wurden zufällig in eine Kontrollgruppe und eine mit NaHS (30 μM) behandelte Gruppe (n = 5 pro Gruppe) eingeteilt. Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurde der KISS-Ansatz (Keep It Simple, Stupid) angewendet, der auf bisherigen Erfahrungen und einer Poweranalyse basiert.³⁵ Zunächst führten wir eine Pilotstudie an drei Ratten durch und bestimmten den mittleren Gesamt-Sulfidspiegel im Serum sowie dessen Standardabweichung (8,1 ± 0,81 μM). Unter Berücksichtigung einer Teststärke von 80 % und eines zweiseitigen Signifikanzniveaus von 5 % ermittelten wir anschließend eine vorläufige Stichprobengröße (n = 5, basierend auf der Fachliteratur). Diese entsprach einer standardisierten Effektstärke von 2,02, wobei der von Festing vorgeschlagene Wert zur Berechnung der Stichprobengröße für Versuchstiere³⁵ verwendet wurde. Nach Multiplikation dieses Wertes mit der Standardabweichung (2,02 × 0,81) ergab sich eine vorhergesagte detektierbare Effektstärke von 20 % (1,6 μM), was als akzeptabel gilt. Dies bedeutet, dass n = 5 pro Gruppe ausreicht, um eine mittlere Veränderung von 20 % zwischen den Gruppen nachzuweisen. Die Ratten wurden mithilfe der Zufallsfunktion von Excel³⁶ (siehe Abb. S1 im Anhang) randomisiert in eine Kontrollgruppe und eine NaSH-behandelte Gruppe eingeteilt. Die Verblindung erfolgte auf der Ebene der Ergebnisse, und die Prüfer, die die biochemischen Messungen durchführten, kannten die Gruppenzuordnung nicht.
Die NaHS-Gruppen beider Geschlechter wurden zwei Wochen lang mit einer 30 μM NaHS-Lösung im Trinkwasser behandelt. Die Lösung wurde alle 24 Stunden erneuert, währenddessen wurde das Körpergewicht gemessen. Am Ende der ersten und zweiten Woche wurden allen Ratten unter Isofluran-Narkose jeden zweiten Tag Blutproben aus der Schwanzspitze entnommen. Die Blutproben wurden 10 Minuten bei 3000 g zentrifugiert, das Serum abgetrennt und bei –80 °C für die spätere Bestimmung von Serumharnstoff, Kreatinin (Cr) und Gesamtsulfid gelagert. Serumharnstoff wurde enzymatisch mittels Urease-Methode und Serumkreatinin photometrisch nach Jaffé mit kommerziell erhältlichen Kits (Man Company, Teheran, Iran) und einem automatischen Analysengerät (Selectra E, Seriennummer 0-2124, Niederlande) bestimmt. Die intra- und interassay-Variationskoeffizienten für Harnstoff und Cr lagen unter 2,5 %.
Die Methylenblau-Methode (MB-Methode) dient zur Bestimmung des Gesamtsulfidgehalts in Trinkwasser und Serum, das Natriumhydrogensulfat (NaHS) enthält. MB ist die gebräuchlichste Methode zur Sulfidbestimmung in Lösungen und biologischen Proben^11,37. Mit der MB-Methode lässt sich der Gesamtsulfidgehalt abschätzen³⁸ und anorganische Sulfide in Form von H₂S, HS^- und S₂ in der wässrigen Phase messen³⁹. Bei dieser Methode wird Schwefel in Gegenwart von Zinkacetat als Zinksulfid (ZnS) ausgefällt^11,38. Die Zinkacetat-Fällung ist die gängigste Methode zur Abtrennung von Sulfiden von anderen Chromophoren¹¹. ZnS wird unter stark sauren Bedingungen mit Salzsäure (HCl) wieder gelöst¹¹. Das Sulfid reagiert mit DMPD im stöchiometrischen Verhältnis 1:2 in einer durch Eisen(III)-chlorid (Fe³⁺ wirkt als Oxidationsmittel) katalysierten Reaktion zum Farbstoff Methylenblau (MB), der spektrophotometrisch bei 670 nm detektiert wird^40,41. Die Nachweisgrenze der MB-Methode beträgt ungefähr 1 μM11.
In dieser Studie wurden 100 μL jeder Probe (Lösung oder Serum) in ein Röhrchen gegeben. Anschließend wurden 200 μL Zinkacetat (1 % (w/v) in destilliertem Wasser), 100 μL DMPD (20 mM in 7,2 M HCl) und 133 μL FeCl₃ (30 mM in 1,2 M HCl) hinzugefügt. Die Mischung wurde 30 min lang im Dunkeln bei 37 °C inkubiert. Die Lösung wurde 10 min bei 10.000 g zentrifugiert, und die Absorption des Überstands wurde bei 670 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA) gemessen. Die Sulfidkonzentrationen wurden anhand einer Kalibrierkurve von NaHS (0–100 μM) in ddH₂O bestimmt (siehe Abb. S2 im Anhang). Alle für die Messungen verwendeten Lösungen wurden frisch zubereitet. Die intra- und interassay-Variationskoeffizienten für die Sulfidmessungen betrugen 2,8 % bzw. 3,4 %. Wir bestimmten außerdem die Gesamtmenge an Sulfid, die aus Natriumthiosulfat-haltigen Trinkwasser- und Serumproben mittels der Methode mit angereicherten Proben⁴² zurückgewonnen wurde. Die Wiederfindungsraten für Natriumthiosulfat-haltige Trinkwasser- und Serumproben lagen bei 91 ± 1,1 % (n = 6) bzw. 93 ± 2,4 % (n = 6).
Die statistische Analyse erfolgte mit der Software GraphPad Prism Version 8.0.2 für Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com). Ein gepaarter t-Test wurde verwendet, um Temperatur und pH-Wert des Trinkwassers vor und nach der NaHS-Zugabe zu vergleichen. Der H₂S-Verlust in der NaHS-haltigen Lösung wurde als prozentuale Abnahme gegenüber der Ausgangsaufnahme berechnet. Um die statistische Signifikanz dieses Verlusts zu prüfen, wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse mit Messwiederholung (ANOVA) mit anschließendem Dunnett-Test für Mehrfachvergleiche durchgeführt. Körpergewicht, Serumharnstoff, Serumkreatinin und Gesamtserumsulfid wurden im Zeitverlauf zwischen Kontroll- und NaHS-behandelten Ratten unterschiedlichen Geschlechts mittels einer zweifaktoriellen gemischten ANOVA (Zwischen-Innerhalb-Variable) mit anschließendem Bonferroni-Post-hoc-Test verglichen. Zweiseitige p-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
Der pH-Wert des Trinkwassers betrug vor der NaHS-Zugabe 7,60 ± 0,01 und nach der NaHS-Zugabe 7,71 ± 0,03 (n = 13, p = 0,0029). Die Temperatur des Trinkwassers lag bei 26,5 ± 0,2 °C und sank nach der NaHS-Zugabe auf 26,2 ± 0,2 °C (n = 13, p = 0,0128). Eine 30 μM NaHS-Lösung wurde in Trinkwasser hergestellt und in einer Wasserflasche aufbewahrt. Die NaHS-Lösung ist instabil und ihre Konzentration nimmt mit der Zeit ab. Bei der Probenahme am Flaschenhals wurde innerhalb der ersten Stunde ein signifikanter Rückgang (68,0 %) beobachtet. Nach 12 bzw. 24 Stunden war der NaHS-Gehalt in der Lösung um 72 % bzw. 75 % gesunken. In Proben aus Wasserflaschen war die Reduktion von NaHS bis zu 2 Stunden nicht signifikant, nach 12 bzw. 24 Stunden jedoch um 47 % bzw. 72 % gesunken. Diese Daten zeigen, dass der Anteil an NaHS in einer 30 μM-Lösung in Trinkwasser nach 24 Stunden unabhängig vom Probenahmeort auf etwa ein Viertel des Ausgangswerts gesunken war (Abbildung 1).
Stabilität einer NaHS-Lösung (30 μM) in Trinkwasser in Ratten-/Mäuseflaschen. Nach der Lösungsherstellung wurden Proben von der Spitze und aus dem Inneren der Wasserflasche entnommen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 6/Gruppe) dargestellt. * und #, p < 0,05 im Vergleich zu Zeitpunkt 0. Die Abbildung der Wasserflasche zeigt die Spitze (mit Öffnung) und den Flaschenkörper. Das Volumen der Spitze beträgt ca. 740 μL.
Die NaHS-Konzentration in der frisch zubereiteten 30 μM-Lösung betrug 30,3 ± 0,4 μM (Bereich: 28,7–31,9 μM, n = 12). Nach 24 Stunden sank die NaHS-Konzentration jedoch auf einen niedrigeren Wert (Mittelwert: 3,0 ± 0,6 μM). Wie in Abbildung 2 dargestellt, waren die NaHS-Konzentrationen, denen die Ratten ausgesetzt waren, während des Untersuchungszeitraums nicht konstant.
Das Körpergewicht weiblicher Ratten stieg im Verlauf der Zeit signifikant an (von 205,2 ± 5,2 g auf 213,8 ​​± 7,0 g in der Kontrollgruppe und von 204,0 ± 8,6 g auf 211,8 ± 7,5 g in der NaHS-behandelten Gruppe); die NaHS-Behandlung hatte jedoch keinen Einfluss auf das Körpergewicht (Abb. 3). Auch das Körpergewicht männlicher Ratten stieg im Verlauf der Zeit signifikant an (von 338,6 ± 8,3 g auf 352,4 ± 6,0 g in der Kontrollgruppe und von 352,4 ± 5,9 g auf 363,2 ± 4,3 g in der NaHS-behandelten Gruppe); auch hier hatte die NaHS-Behandlung keinen Einfluss auf das Körpergewicht (Abb. 3).
Veränderungen des Körpergewichts bei weiblichen und männlichen Ratten nach Verabreichung von NaHS (30 μM). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt und mittels zweifaktorieller Varianzanalyse mit Messwiederholung und Bonferroni-Post-hoc-Test verglichen. n = 5 Tiere pro Geschlecht und Gruppe.
Die Serumkonzentrationen von Harnstoff und Kreatinphosphat waren bei Kontroll- und NaSH-behandelten Ratten während der gesamten Studie vergleichbar. Darüber hinaus hatte die NaSH-Behandlung keinen Einfluss auf die Serumkonzentrationen von Harnstoff und Kreatinchrom (Tabelle 1).
Die Ausgangskonzentrationen von Gesamtsulfid im Serum waren bei Kontrolltieren und mit NaHS behandelten männlichen (8,1 ± 0,5 μM vs. 9,3 ± 0,2 μM) und weiblichen (9,1 ± 1,0 μM vs. 6,1 ± 1,1 μM) Ratten vergleichbar. Die 14-tägige NaHS-Gabe hatte weder bei männlichen noch bei weiblichen Ratten einen Einfluss auf die Gesamtsulfidkonzentration im Serum (Abb. 4).
Veränderungen der Gesamt-Sulfidkonzentration im Serum männlicher und weiblicher Ratten nach Verabreichung von NaHS (30 μM). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt und mittels einer zweifaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholung und anschließendem Bonferroni-Post-hoc-Test verglichen. Pro Geschlecht: n = 5/Gruppe.
Die wichtigste Schlussfolgerung dieser Studie ist, dass Trinkwasser mit NaHS instabil ist: Nur etwa ein Viertel des ursprünglichen Gesamtsulfidgehalts war 24 Stunden nach der Probenentnahme aus der Spitze und dem Inneren von Trinkflaschen für Ratten und Mäuse nachweisbar. Darüber hinaus waren die Ratten aufgrund des H₂S-Verlusts in der NaHS-Lösung instabilen NaHS-Konzentrationen ausgesetzt. Die Zugabe von NaHS zum Trinkwasser hatte keinen Einfluss auf Körpergewicht, Serumharnstoff, Serumkreatinin, Chrom oder den Gesamtserumsulfidgehalt.
In dieser Studie betrug die H₂S-Verlustrate aus 30 μM NaHS-Lösungen in Trinkwasser etwa 3 % pro Stunde. In einer gepufferten Lösung (100 μM Natriumsulfid in 10 mM PBS, pH 7,4) wurde ein Abfall der Sulfidkonzentration um 7 % innerhalb von 8 Stunden berichtet¹¹. Wir haben die intraperitoneale Verabreichung von NaHS bereits verteidigt, indem wir berichteten, dass die Sulfidverlustrate aus einer 54 μM NaHS-Lösung in Trinkwasser etwa 2,3 % pro Stunde betrug (4 %/Stunde in den ersten 12 Stunden und 1,4 %/Stunde in den letzten 12 Stunden nach der Zubereitung)⁸. Frühere Studien⁴³ fanden einen konstanten H₂S-Verlust aus NaHS-Lösungen, hauptsächlich aufgrund von Verflüchtigung und Oxidation. Selbst ohne Zugabe von Blasen geht Sulfid in der Stammlösung aufgrund der H₂S-Verflüchtigung rasch verloren¹¹. Studien haben gezeigt, dass während des etwa 30–60 Sekunden dauernden Verdünnungsprozesses ca. 5–10 % des H₂S durch Verdunstung verloren gehen⁶. Um die Verdunstung von H₂S aus der Lösung zu verhindern, haben Forscher verschiedene Maßnahmen ergriffen, darunter vorsichtiges Rühren der Lösung¹², Abdecken der Stammlösung mit einer Plastikfolie⁶ und Minimierung des Luftkontakts, da die Verdunstungsrate von H₂S von der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche abhängt.¹³ Die spontane Oxidation von H₂S erfolgt hauptsächlich durch Übergangsmetallionen, insbesondere Eisen(III)-Ionen, die Verunreinigungen im Wasser darstellen.¹³ Die Oxidation von H₂S führt zur Bildung von Polysulfiden (Schwefelatome, die durch kovalente Bindungen verknüpft sind).¹¹ Um eine Oxidation zu vermeiden, werden H₂S-haltige Lösungen in sauerstofffreien Lösungsmitteln hergestellt^44,45 und anschließend 20–30 min mit Argon oder Stickstoff gespült, um die vollständige Entgasung sicherzustellen.^{11,12,37,44,45,46} Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) ist ein Metallchelator (10^–4 M), der die Autoxidation von HS^– in aeroben Lösungen verhindert. Ohne DTPA beträgt die Autoxidationsrate von HS^– bei 25 °C innerhalb von ca. 3 h etwa 50 %.^37,47 Da die Oxidation von 1e-Sulfid durch UV-Licht katalysiert wird, sollte die Lösung auf Eis gelagert und vor Licht geschützt werden.¹¹
Wie in Abbildung 5 dargestellt, dissoziiert NaHS in Wasser gelöst in Na⁺ und HS⁻. Diese Dissoziation wird durch den pK₁-Wert der Reaktion bestimmt, der temperaturabhängig ist: pK₁ = 3,122 + 1132/T, wobei T zwischen 5 und 30 °C liegt und in Kelvin (K) gemessen wird; K = °C + 273,1548. HS⁻ besitzt einen hohen pK₂-Wert (pK₂ = 19), sodass bei pH < 96,49 kein S²⁻ gebildet wird oder nur in sehr geringen Mengen. Im Gegensatz dazu wirkt HS⁻ als Base und nimmt H⁺ von einem H₂O-Molekül auf, während H₂O als Säure fungiert und in H₂S und OH⁻ umgewandelt wird.
Bildung von gelöstem H₂S-Gas in NaHS-Lösung (30 µM). aq, wässrige Lösung; g, Gas; l, Flüssigkeit. Alle Berechnungen basieren auf der Annahme eines pH-Werts von 7,0 und einer Wassertemperatur von 20 °C. Erstellt mit BioRender.com.
Trotz Hinweisen auf die Instabilität von NaHS-Lösungen wurden diese in mehreren Tierstudien als H₂S-Donator im Trinkwasser eingesetzt¹⁵,¹⁶,¹⁷,¹⁸,¹⁹,²⁰,²¹,²²,²³,²⁴,²⁵,²⁶. Die Interventionsdauer variierte zwischen einer und 21 Wochen (Tabelle 2). In diesen Studien wurde die NaHS-Lösung alle 12, 15, 17, 18, 24, 25 Stunden bzw. alle 24,¹⁹, 20, 21, 22, 23 Stunden erneuert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Ratten aufgrund des H₂S-Verlusts aus der NaHS-Lösung instabilen Wirkstoffkonzentrationen ausgesetzt waren und der NaHS-Gehalt im Trinkwasser der Ratten innerhalb von 12 bzw. 24 Stunden signifikant schwankte (siehe Abbildung 2). Zwei dieser Studien berichteten, dass der H₂S-Gehalt im Wasser über 24 Stunden stabil blieb²² bzw. dass innerhalb von 12 Stunden nur ein H₂S-Verlust von 2–3 % beobachtet wurde¹⁵. Sie lieferten jedoch keine unterstützenden Daten oder Messdetails. Zwei Studien zeigten, dass der geringe Durchmesser von Wasserflaschen die H₂S-Verdunstung minimieren kann¹⁵,¹⁹. Unsere Ergebnisse zeigten jedoch, dass dies den H₂S-Verlust aus einer Wasserflasche lediglich um 2 Stunden, nicht aber um 12–24 Stunden, verzögern kann. Beide Studien weisen darauf hin, dass wir davon ausgehen, dass sich der NaHS-Gehalt im Trinkwasser nicht verändert hat, da wir keine Farbveränderung des Wassers beobachteten; daher war die Oxidation von H₂S durch Luft nicht signifikant¹⁹,²⁰. Überraschenderweise beurteilt diese subjektive Methode die Stabilität von NaHS im Wasser, anstatt die Veränderung seiner Konzentration im Zeitverlauf zu messen.
Der H₂S-Verlust in NaHS-Lösung hängt vom pH-Wert und der Temperatur ab. Wie unsere Studie zeigt, führt das Auflösen von NaHS in Wasser zur Bildung einer alkalischen Lösung⁵⁰. Die Bildung von gelöstem H₂S-Gas ist beim Auflösen von NaHS in Wasser pH-abhängig⁶. Je niedriger der pH-Wert der Lösung, desto höher ist der Anteil an NaHS, der als H₂S-Gasmoleküle vorliegt, und desto mehr Sulfid geht aus der wässrigen Lösung verloren¹¹. In keiner dieser Studien wurde der pH-Wert des als Lösungsmittel für NaHS verwendeten Trinkwassers angegeben. Gemäß den Empfehlungen der WHO, die von den meisten Ländern übernommen wurden, sollte der pH-Wert von Trinkwasser im Bereich von 6,5–8,5⁵¹ liegen. In diesem pH-Bereich steigt die Rate der spontanen Oxidation von H₂S um etwa das Zehnfache¹³. Das Auflösen von NaHS in Wasser in diesem pH-Bereich führt zu einer Konzentration von gelöstem H₂S-Gas von 1 bis 22,5 μM, was die Bedeutung der pH-Wert-Überwachung des Wassers vor dem Auflösen von NaHS unterstreicht. Darüber hinaus würde der in der oben genannten Studie angegebene Temperaturbereich (18–26 °C) eine Änderung der Konzentration von gelöstem H₂S-Gas in der Lösung um etwa 10 % zur Folge haben, da Temperaturänderungen den pK₁-Wert beeinflussen und bereits geringe Änderungen des pK₁-Werts einen signifikanten Einfluss auf die Konzentration von gelöstem H₂S-Gas haben können⁴⁸. Die lange Dauer einiger Studien (5 Monate)²², in deren Verlauf mit großen Temperaturschwankungen zu rechnen ist, verschärft dieses Problem zusätzlich.
Alle Studien außer einer²¹ verwendeten eine 30 μM NaHS-Lösung im Trinkwasser. Zur Begründung der verwendeten Dosis (30 μM) führten einige Autoren an, dass NaHS in der wässrigen Phase exakt die gleiche H₂S-Gaskonzentration erzeugt und der physiologische Bereich von H₂S zwischen 10 und 100 μM liegt, sodass diese Dosis im physiologischen Bereich liegt^15,16. Andere erklärten, dass 30 μM NaHS den Plasma-H₂S-Spiegel im physiologischen Bereich von 5–300 μM halten können^19,20. Wir betrachten die in einigen Studien zur Untersuchung der H₂S-Wirkungen verwendete NaHS-Konzentration von 30 μM in Wasser (pH = 7,0, T = 20 °C). Daraus lässt sich berechnen, dass die Konzentration des gelösten H₂S-Gases 14,7 μM beträgt, was etwa 50 % der anfänglichen NaHS-Konzentration entspricht. Dieser Wert ist vergleichbar mit den von anderen Autoren unter denselben Bedingungen berechneten Werten^13,48.
In unserer Studie hatte die Verabreichung von NaHS keinen Einfluss auf das Körpergewicht; dieses Ergebnis deckt sich mit den Ergebnissen anderer Studien an männlichen Mäusen^22,23 und männlichen Ratten¹⁸. Zwei Studien berichteten jedoch, dass NaHS das verringerte Körpergewicht bei nephrektomierten Ratten wiederherstellte^24,26, während andere Studien keinen Effekt der NaHS-Verabreichung auf das Körpergewicht feststellten^{15,16,17,19,20,21,25}. Des Weiteren beeinflusste die NaHS-Verabreichung in unserer Studie die Serumharnstoff- und Kreatin-Chrom-Werte nicht, was mit den Ergebnissen einer anderen Studie übereinstimmt²⁵.
Die Studie ergab, dass die Zugabe von NaHS zum Trinkwasser über zwei Wochen die Gesamtkonzentration von Sulfid im Serum männlicher und weiblicher Ratten nicht beeinflusste. Dieses Ergebnis deckt sich mit den Resultaten von Sen et al. (16): Eine achtwöchige Behandlung mit 30 μM NaHS im Trinkwasser hatte keinen Einfluss auf den Sulfidspiegel im Plasma von Kontrollratten. Allerdings berichteten sie, dass diese Intervention den verringerten H₂S-Spiegel im Plasma nephrektomierter Mäuse wiederherstellte. Li et al. (22) berichteten ebenfalls, dass die Behandlung mit 30 μM NaHS im Trinkwasser über fünf Monate den Spiegel an freiem Sulfid im Plasma älterer Mäuse um etwa 26 % erhöhte. Andere Studien berichteten keine Veränderungen des zirkulierenden Sulfids nach Zugabe von NaHS zum Trinkwasser.
Sieben Studien berichteten über die Verwendung von Sigma-NaHS^{15,16,19,20,21,22,23}, machten aber keine weiteren Angaben zum Kristallwassergehalt. Fünf Studien erwähnten die Quelle des in ihren Herstellungsverfahren verwendeten NaHS nicht^{17,18,24,25,26}. NaHS ist ein hydratisiertes Molekül, dessen Kristallwassergehalt variieren kann. Dies beeinflusst die Menge an NaHS, die zur Herstellung einer Lösung mit einer bestimmten Molarität benötigt wird. Beispielsweise betrug der NaHS-Gehalt in unserer Studie NaHS·1,3 H₂O. Daher könnten die tatsächlichen NaHS-Konzentrationen in diesen Studien niedriger sein als die berichteten.
„Wie kann eine so kurzlebige Verbindung eine so lang anhaltende Wirkung haben?“ Diese Frage stellten Pozgay et al.²¹ bei der Untersuchung der Wirkung von NaHS auf Colitis bei Mäusen. Sie hoffen, dass zukünftige Studien diese Frage beantworten können, und vermuten, dass NaHS-Lösungen neben H₂S und Disulfiden, die die Wirkung von NaHS vermitteln,²¹ auch stabilere Polysulfide enthalten könnten. Eine weitere Möglichkeit ist, dass selbst sehr geringe Restkonzentrationen von NaHS in Lösung einen positiven Effekt haben könnten. Tatsächlich lieferten Olson et al. Hinweise darauf, dass mikromolare H₂S-Konzentrationen im Blut nicht physiologisch sind und im nanomolaren Bereich liegen oder gar nicht vorhanden sein sollten¹³. H₂S wirkt möglicherweise durch Proteinsulfatierung, eine reversible posttranslationale Modifikation, die Funktion, Stabilität und Lokalisation vieler Proteine ​​beeinflusst^52,53,54. Unter physiologischen Bedingungen sind etwa 10–25 % vieler Leberproteine ​​sulfyliert⁵³. Beide Studien bestätigen den raschen Abbau von NaHS19,23, geben aber überraschenderweise an, dass „wir die NaHS-Konzentration im Trinkwasser durch täglichen Austausch kontrolliert haben.“23 In einer Studie wurde versehentlich fälschlicherweise behauptet, dass „NaHS ein Standard-H₂S-Donator ist und in der klinischen Praxis häufig anstelle von H₂S verwendet wird.“18
Die obige Diskussion zeigt, dass NaHS durch Verflüchtigung, Oxidation und Photolyse aus der Lösung verloren geht. Daher werden einige Vorschläge zur Reduzierung des H₂S-Verlusts aus der Lösung gemacht. Erstens hängt die Verdunstung von H₂S von der Gas-Flüssigkeits-Grenzfläche¹³ und dem pH-Wert der Lösung¹¹ ab. Um den Verdunstungsverlust zu minimieren, kann der Flaschenhals, wie bereits beschrieben^15,19, so klein wie möglich gestaltet und der pH-Wert des Wassers auf einen akzeptablen oberen Grenzwert (z. B. 6,5–8,55¹¹) eingestellt werden. Zweitens kommt es aufgrund der Einwirkung von Sauerstoff und der Anwesenheit von Übergangsmetallionen im Trinkwasser¹³ zu einer spontanen Oxidation von H₂S. Daher kann die Entsauerung des Trinkwassers mit Argon oder Stickstoff^44,45 und die Verwendung von Metallchelatoren^37,47 die Oxidation von Sulfiden verringern. Drittens können Wasserflaschen mit Aluminiumfolie umwickelt werden, um die photochemische Zersetzung von H₂S zu verhindern. Dieses Verfahren gilt auch für lichtempfindliche Substanzen wie Streptozotocin⁵⁵. Anorganische Sulfidsalze (NaHS, Na₂S und CaS) können zudem per Magensonde anstatt wie zuvor berichtet im Trinkwasser gelöst verabreicht werden^56,57,58. Studien haben gezeigt, dass radioaktives Natriumsulfid, das Ratten per Magensonde verabreicht wurde, gut resorbiert und in nahezu alle Gewebe verteilt wird⁵⁹. Bisher wurden anorganische Sulfidsalze in den meisten Studien intraperitoneal verabreicht; diese Applikationsart wird jedoch in der klinischen Praxis selten angewendet⁶⁰. Die orale Verabreichung ist hingegen die gebräuchlichste und bevorzugte Applikationsart beim Menschen⁶¹. Daher empfehlen wir, die Wirkung von H₂S-Donatoren bei Nagetieren mittels oraler Magensonde zu untersuchen.
Eine Einschränkung besteht darin, dass wir Sulfid in wässriger Lösung und Serum mittels der Methylenblau-Methode (MB-Methode) gemessen haben. Zu den Methoden zur Sulfidbestimmung gehören die Iodtitration, die Spektralphotometrie, elektrochemische Verfahren (Potentiometrie, Amperometrie, coulometrische und amperometrische Methoden) sowie die Chromatographie (Gaschromatographie und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie). Die am häufigsten verwendete Methode ist die spektralphotometrische MB-Methode⁶². Eine Einschränkung der MB-Methode zur H₂S-Messung in biologischen Proben ist, dass sie alle schwefelhaltigen Verbindungen und nicht freies H₂S erfasst⁶³, da sie unter sauren Bedingungen durchgeführt wird, was zur Extraktion von Schwefel aus der biologischen Quelle führt⁶⁴. Laut der American Public Health Association ist die MB-Methode jedoch die Standardmethode zur Sulfidbestimmung in Wasser⁶⁵. Daher beeinflusst diese Einschränkung unsere Hauptergebnisse zur Instabilität von NaHS-haltigen Lösungen nicht. Darüber hinaus betrug die Wiederfindungsrate der Sulfidmessungen in Wasser- und Serumproben mit NaHS in unserer Studie 91 % bzw. 93 %. Diese Werte liegen im Bereich der zuvor berichteten Werte (77–92)66 und weisen auf eine akzeptable analytische Präzision42 hin. Es ist anzumerken, dass wir gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) sowohl männliche als auch weibliche Ratten verwendet haben, um eine übermäßige Abhängigkeit von ausschließlich männlichen Tieren in präklinischen Studien67 zu vermeiden und nach Möglichkeit sowohl männliche als auch weibliche Ratten einzubeziehen68. Dieser Punkt wurde auch von anderen hervorgehoben69,70,71.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass aus Trinkwasser hergestellte NaHS-Lösungen aufgrund ihrer Instabilität nicht zur H₂S-Erzeugung geeignet sind. Diese Verabreichungsmethode würde Tiere instabilen und niedrigeren als erwarteten NaHS-Konzentrationen aussetzen; daher sind die Ergebnisse möglicherweise nicht auf den Menschen übertragbar.
Die im Rahmen dieser Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze können auf Anfrage beim korrespondierenden Autor angefordert werden.
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