Die Sortierung von Proteinen im Sekretionsweg ist essenziell für die Aufrechterhaltung der Zellkompartimentierung und Homöostase. Neben der Sortierung über die Membranhülle ist die Rolle von Lipiden bei der Kinesin-Sortierung im Sekretionstransport eine seit Langem unbeantwortete Grundlagenfrage. In dieser Studie zeigen wir mittels simultaner, hochauflösender 3D-Mehrfarben-Echtzeit-Bildgebung in vivo, dass neu synthetisierte, Glycosylphosphatidylinositol-immobilisierte Proteine ​​mit sehr langen Ceramid-Lipidresten geclustert und in spezialisierte Endoplasma-Exportorte klassifiziert werden. Diese unterscheiden sich von denen, die Transmembranproteine ​​nutzen. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Kettenlänge des Ceramids in der Membran des endoplasmatischen Retikulums entscheidend für diese Sortierselektivität ist. Unsere Studie liefert den ersten direkten In-vivo-Beweis für die Klassifizierung von Proteinfrachten anhand ihrer Lipidkettenlänge in selektive Exportorte im Sekretionsweg.
In eukaryotischen Zellen werden die im endoplasmatischen Retikulum (ER) synthetisierten Proteine ​​während des Transports durch den sekretorischen Weg sortiert und zu ihrem jeweiligen zellulären Zielort transportiert (1). Neben der Hüllprotein-vermittelten Sortierung wurde lange vermutet, dass bestimmte Lipide auch als selektive Austrittspunkte dienen können, indem sie Proteine ​​in spezifischen Membrandomänen bündeln (2–5). Bislang fehlen jedoch direkte In-vivo-Beweise für diesen möglichen lipidbasierten Mechanismus. Um dieses grundlegende Problem zu lösen, untersuchten wir in Hefe, wie Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-verankerte Proteine ​​(GPI-APs) differenziell aus dem ER exportiert werden. GPI-APs sind eine Gruppe von Lipid-verknüpften Zelloberflächenproteinen (6, 7). GPI-APs sind sezernierte Proteine, die über den Glycolipidanteil (GPI-Anker) an die äußere Schicht der Plasmamembran gebunden sind. Sie akzeptieren GPI-Anker als konservative posttranslationale Modifikationen im ER-Lumen (8). Nach der Anheftung durchläuft GPI-AP den Golgi-Apparat (5, 9) vom endoplasmatischen Retikulum (ER) zur Plasmamembran. Die Anwesenheit von GPI-Ankern bewirkt, dass GPI-AP entlang des Sekretionswegs getrennt von anderen sekretierten Transmembranproteinen (einschließlich anderer Plasmamembranproteine) transportiert wird (5, 9, 10). In Hefezellen werden GPI-AP im ER von anderen sekretierten Proteinen getrennt und anschließend in spezifische Vesikel verpackt, die vom Hüllproteinkomplex II (COPII) umhüllt werden (6, 7). Die Determinanten dieses Klassifizierungsprozesses beim ER-Export sind unklar. Es wird jedoch vermutet, dass dieser Mechanismus Lipide erfordert, insbesondere die strukturelle Umgestaltung des Lipidanteils des GPI-Ankers (5, 8). In Hefe beginnt die Lipidumgestaltung des GPI unmittelbar nach der Anheftung und führt in vielen Fällen zur Bindung von Ceramid an die gesättigte Fettsäure C26:0 (11, 12). C26-Ceramid ist das bisher hauptsächlich von Hefezellen produzierte Ceramid. Es wird im endoplasmatischen Retikulum (ER) synthetisiert und größtenteils über COPII-Vesikel zum Golgi-Apparat exportiert (13). Der ER-Export von GPI-AP erfordert spezifisch eine kontinuierliche Ceramidsynthese (14, 15), und die Umwandlung von Ceramid zu Inositolphosphat-Ceramid (IPC) im Golgi-Apparat wiederum ist von der GPI-Ankersynthese abhängig (16). Biophysikalische Studien mit künstlichen Membranen haben gezeigt, dass Ceramide mit sehr langen Acylketten zu geordneten Domänen mit einzigartigen physikalischen Eigenschaften koaleszieren können (17, 18). Diese Daten führen zu der Hypothese, dass C26-Ceramid und GPI-AP mit C26-Ceramid ihre physikalischen Eigenschaften nutzen, um in der relativ ungeordneten Lipidumgebung der ER-Membran geordnete Bereiche oder Regionen zu bilden. Es besteht hauptsächlich aus kurzen und ungesättigten Glycerolipiden (C16:1 und C18:1) (19, 20). Diese Regionen werden selektiv auf spezifische ER-Austrittsstellen (ERES) ausgerichtet, wo Ceramid und Ceramid-basierte GPI-AP im selben dedizierten COPII-Vesikel zum Golgi transportiert werden können (5).
In dieser Studie haben wir diesen lipidbasierten Mechanismus direkt mit Hilfe der Superresolutions-Konfokalmikroskopie in Echtzeit (SCLIM) getestet. SCLIM ist eine hochmoderne Mikroskopietechnik, die simultan fluoreszenzmarkierte Proteine ​​beobachten kann. Die dreifarbigen und dreidimensionalen (3D) Bilder weisen eine extrem hohe Auflösung und Geschwindigkeit in lebenden Zellen auf (21, 22).
Zunächst setzten wir die SCLIM-Technologie ein, um genauer zu untersuchen, wie normale GPI-AP mit einer C26-Ceramidgruppe aus den nach Verlassen des ER sezernierten Transmembranproteinen in S. cerevisiae selektiert werden. Zur Überprüfung der ER-Klassifizierung verwendeten wir ein genetisches System, das die direkte Visualisierung neu synthetisierter Fracht beim Eintritt in das ERES in vivo ermöglicht (7, 23). Als Fracht wählten wir das mit grünem Fluoreszenzprotein (GFP) markierte, C26-Ceramid-basierte GPI-AP Gas1 und das mit Nahinfrarot-Fluoreszenzprotein (iRFP) markierte Transmembranprotein Mid2, die beide die Plasmamembran binden (24–26). In der temperatursensitiven Mutante sec31-1 werden diese beiden Frachten unter einem Galactose-induzierbaren Promotor und einem konstitutiven ERES-Marker exprimiert. Bei der extremen Temperatur (37 °C) führt die sec31-1-Mutation, die die Funktion des COPII-Hüllproteins Sec31 beeinträchtigt und dadurch die COPII-Keimung und den ER-Export hemmt, zu einer Akkumulation neu synthetisierter Fracht im ER (23). Nach Abkühlung auf eine niedrige Temperatur (24 °C) erholten sich die sec31-1-Mutantenzellen aus dem Sekretionsgebiet, und die akkumulierte, neu synthetisierte Fracht wurde aus dem ER exportiert. CLIM-Visualisierungen zeigten, dass sich der Großteil des neu synthetisierten Gas1-GFP und Mid2-iRFP nach Inkubation bei 37 °C und anschließender Freisetzung bei 24 °C für 5 Minuten weiterhin im ER der sec31-1-Mutantenzellen anreicherte (Abbildung 1). Da Mid2-iRFP über die gesamte ER-Membran verteilt ist, Gas1-GFP sich jedoch in diskontinuierlichen Bereichen der ER-Membran konzentriert, ist ihre Verteilung völlig unterschiedlich (Abbildung 1, A bis C und Film S1). Darüber hinaus enthält der Gas1-GFP-Cluster, wie in Abbildung 1D dargestellt, kein Mid2-iRFP. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass GPI-AP- und Transmembranproteine ​​frühzeitig in verschiedene ER-Membranregionen getrennt wurden. Der Gas1-GFP-Cluster grenzt an eine spezifische ERES, die mit dem COPII-Hüllprotein Sec13 von mCherry markiert ist (Abbildung 1, E und F, und Film S1) (23).
sec31-1-Zellen exprimieren Galactose-induzierte Sekrete, ein langkettiges (C26) Ceramid-GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, grün) und das Transmembranprotein Mid2-iRFP (TMP, blau). Dieses wurde mit dem konstruktiven ERES-Marker Sec13-mCherry (ERES, magenta) markiert. Die Zellen wurden 30 Minuten bei 37 °C inkubiert, anschließend auf 24 °C abgekühlt und 5 Minuten später mittels SCLIM abgebildet. (A bis C) zeigen ein repräsentatives überlagertes oder einzelnes 2D-Bild einer Ebene (A), ein 2D-Projektionsbild von 10 z-Schnitten (B) oder ein 3D-Bild der Zellhemisphäre mit Fracht- und ERES-Markern (C). Maßstabsbalken: 1 μm (A und B). Die Skaleneinheit beträgt 0,551 μm (C). Gas1-GFP wurde in diskreten ER-Regionen oder Clustern detektiert, während Mid2-iRFP in der gesamten ER-Membran nachgewiesen wurde (C). (D) Die Grafik zeigt die relative Fluoreszenzintensität von Gas1-GFP und Mid2-iRFP im Gas1-GFP-Cluster entlang der weißen Pfeillinie (links). AU, willkürliche Einheit. (E und F) zeigen das 3D-Bild, das die Gas1-GFP- und ERES-Markierungen kombiniert. Gas1-GFP-Cluster wurden in der Nähe der spezifischen ERES detektiert. Die Skaleneinheit beträgt 0,551 μm. (F) Der weiße Pfeil markiert den mit der ERES assoziierten Gas1-GFP-Cluster. Die mittleren und rechten Abbildungen zeigen das vergrößerte, kombinierte 3D-Bild und eine gedrehte Ansicht des ausgewählten Gas1-GFP-Clusters.
Die enge räumliche Beziehung zwischen dem Gas1-GFP-Cluster und einem spezifischen ERES deutet darauf hin, dass Gas1-GFP selektiv in ERES eindringen kann. Dies unterscheidet sich von der Selektivität, die Mid2-iRFP beim Verlassen des ER nutzt. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, quantifizierten wir das ERES-Verhältnis für jeweils nur ein oder zwei Frachtmoleküle (Abb. 2, A bis C). Wir fanden heraus, dass die meisten ERES (70 %) nur ein Frachtmolekül enthalten. Die untere Abbildung in Abb. 2C zeigt zwei typische Beispiele für ERES mit ausschließlich Gas1-GFP (Abb. 1) bzw. ausschließlich Mid2-iRFP (Abb. 2). Im Gegensatz dazu enthalten etwa 20 % der ERES zwei Frachtmoleküle, die sich im selben Bereich überlappen. Es zeigte sich, dass einige ERES (10 %) zwar zwei Frachtmoleküle enthielten, diese jedoch in klar getrennten Bereichen lokalisiert waren. Diese statistische Analyse belegt somit, dass GPI-AP Gas1-GFP und das Transmembranprotein Mid2-iRFP nach dem Export aus dem ER auf unterschiedliche ERES verteilt werden (Abb. 2D). Diese Sortierungseffizienz stimmt sehr gut mit der vorherigen biochemischen Analyse (6) und morphologischen Bestimmung (7) überein. Wir können auch das Verhalten der eingeschlossenen Fracht beim Eintritt in die ERES beobachten (Abbildung 2E und Video S2). Abbildung 2E zeigt, dass nur ein kleiner Teil von Gas1-GFP (Panel 3) oder Mid2-iRFP (Panel 4) von einer Seite in die ERES eintritt und in einem abgegrenzten Bereich verbleibt. Panel 5 in Abbildung 2E zeigt, dass Gas1-GFP und Mid2-iRFP zwar gelegentlich in derselben ERES vorkommen, aber von verschiedenen Seiten eintreten und sich in separaten Bereichen konzentrieren, die möglicherweise unterschiedliche COPII-Vesikel darstellen. Wir bestätigten außerdem, dass die beobachtete Trennung und Klassifizierung von C26-Ceramid-basiertem GPI-AP Gas1 als selektive ERES spezifisch ist, da eine andere Transmembran-Sekretionsfracht, das GFP-markierte Plasmamembranprotein Axl2 (27), ein ähnliches Verhalten wie Mid2-iRFP zeigt (Abbildung S1 und Video S3). Das neu synthetisierte Axl2-GFP verteilt sich wie Mid2-iRFP durch die ER-Membran (Abb. S1, A und B) und ist in den meisten ERES mit Mid2-iRFP kolokalisiert (Abb. S1, B bis D). Abbildung 1, Panels 1 und 2, S1C, zeigt zwei typische Beispiele für ERES, in denen sich zwei Transmembranproteine ​​überlappen. In diesen Fällen gelangen beide Proteine ​​gemeinsam in die ERES (Abb. S1E, Panel 3 und Video S3).
Die sec31-1-Zellen, die Galactose-induzierbare Sekrete, Gas1-GFP (GPI-AP, grün) und Mid2-iRFP (TMP, blau) sowie konstitutiv ERES-markiertes Sec13-mCherry (ERES, magenta) exprimieren, wurden bei 37 °C inkubiert. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37 °C wurden sie auf 24 °C abgekühlt, um die Sekretionsblockade aufzuheben, und nach weiteren 20 Minuten mit SCLIM abgebildet. (A bis C) Repräsentative 2D-Projektionsbilder (A; Maßstabsbalken: 1 μm) bzw. 3D-Bilder der Zellhemisphäre (B und C; Maßstabseinheit: 0,456 μm) der Fracht und 10 z-Schnitte, die durch ERES markiert sind. Die untere Abbildung in (B) und die Abbildung in (C) zeigen bearbeitete Bilder, die nur die in ERES (magenta) vorhandenen Güter [Gas1-GFP (grau) und Mid2-iRFP (hellblau)] darstellen. (C) Offener Pfeil: ERES trägt nur ein Frachtmolekül (1 bis 4). Grauer Pfeil: ERES enthält segregiertes Frachtmolekül (5). Weißer Pfeil: ERES enthält kolokalisiertes Frachtmolekül. Darunter: Das ausgewählte einzelne ERES enthält nur Gas1-GFP (1) oder Mid2-iRFP (2). Maßstabsbalken: 100 nm. (D) Quantifizierung der in (C) beschriebenen Mikrofotografie. Durchschnittlicher Prozentsatz der ERES, die nur ein Frachtmolekül (Gas1-GFP oder Mid2-iRFP), segregiertes Frachtmolekül oder überlappendes Frachtmolekül enthalten. In drei unabhängigen Experimenten, n = 432 in 54 Zellen. Fehlerbalken = Standardabweichung. Zweiseitiger ungepaarter t-Test. *** P = 0,0002. (E) 3D-Bild des ausgewählten ERES mit isoliertem Frachtmolekül, markiert mit (C). Gas1-GFP (grün) (3) oder Mid2-iRFP (blau) (4) tritt von einer Seite in das ERES (magenta) ein und ist auf einen kleinen Bereich innerhalb des ERES beschränkt. Manchmal gelangen beide Frachtarten von derselben Seite in das gleiche ERES (5) und werden auf einen isolierten Bereich innerhalb des ERES beschränkt. Maßstab: 100 nm.
Anschließend testeten wir die Hypothese, dass das in der ER-Membran vorhandene langkettige Ceramid (C26) die spezifische Clusterbildung und Sortierung von Gas1 in selektive ERES steuert. Zu diesem Zweck verwendeten wir einen modifizierten Hefestamm GhLag1, in dem die beiden endogenen Ceramidsynthasen Lag1 und Lac1 durch GhLag1 (das Lag1-Homolog der Baumwolle) ersetzt wurden. Dies führte zu einem Hefestamm mit einer kürzeren Zellmembran-Ceramidkette als der Wildtyp (Abbildung 3A) (28). Massenspektrometrische (MS) Analysen zeigten, dass im Wildtyp 95 % des Gesamtceramids aus sehr langkettigem (C26) Ceramid bestehen, während in GhLag1 85 % des Ceramids sehr langkettig (C18 und C16) sind. Im Wildtyp hingegen besteht das Ceramid nur zu 2 % aus sehr langkettigem (C26) Ceramid. Obwohl C18- und C16-Ceramide die bisher hauptsächlich in der GhLag1-Membran nachgewiesenen Ceramide sind, bestätigte die MS-Analyse, dass der GPI-Anker von Gas1-GFP, exprimiert im GhLag1-Stamm, auch C26-Ceramid enthält, vergleichbar mit Wildtyp-Lipiden. Die Qualität ist identisch (Abb. 3A) (26). Dies bedeutet, dass das Ceramid-Remodellierungsenzym Cwh43 hochselektiv für C26-Ceramid ist. Wie in Abbildung 26 gezeigt, integriert es bevorzugt geringe Mengen an C26-Ceramid in den GPI-Anker des GhLag1-Stamms. S2 (29). Die Zellmembran von GhLag1 enthält jedoch im Wesentlichen nur C18-C16-Ceramid, während Gas1-GFP auch C26-Ceramid aufweist. Dies macht diesen Stamm zu einem idealen Werkzeug, um die Frage der Acylkettenlänge von Membranceramiden im ER und deren hypothetische Rolle bei der Klassifizierung und Sortierung zu untersuchen. Zunächst untersuchten wir mittels konventioneller Fluoreszenzmikroskopie die Fähigkeit von C26 Gas1-GFP, in GhLag1 mit einem temperatursensitiven Mutantenallel von sec31-1 Cluster zu bilden. In diesem Fall liegt im ER-Membran-Ceramid ausschließlich die lange (C18-C16)-Kette vor (Abb. 3). Wir beobachteten, dass in sec31-1 der größte Teil des Gas1-GFP in Clustern konzentriert war, während es in sec31-1 GhLag1 mit der langen (C18-C16)-Ceramid-ER-Membran größtenteils nicht geclustert vorlag und über die gesamte ER-Membran verteilt war. Da die C26-Ceramid-basierte Clusterbildung eng mit spezifischen ER-Export-Sekretionsstellen (ERES) zusammenhängt (Abb. 1), untersuchten wir anschließend, ob dieser Prozess auch die Funktion des ER-Exportproteinmechanismus involviert. GPI-AP nutzt ein spezielles COPII-System für den ER-Export, das aktiv durch die strukturelle Umgestaltung des Glykananteils des GPI-Ankers durch Ted1 reguliert wird (30, 31). Das rekombinante GPI-Glykan wird vom Transmembran-Frachtrezeptor-p24-Komplex erkannt, der wiederum selektiv Lst1 rekrutiert. Lst1 ist eine spezifische Isoform der Haupt-COPII-Frachtbindungsuntereinheit Sec24, wodurch GPI-AP-reiche COPII-Vesikel gebildet werden. Dies ist notwendig (31–33). Daher konstruierten wir eine Doppelmutante, die die Deletion dieser einzelnen Proteine ​​(der p24-Komplexkomponente Emp24, des GPI-Glykan-Remodellierungsenzyms Ted1 und der spezifischen COPII-Untereinheit Lst1) mit dem sec31-1-Mutantenstamm kombinierte, und untersuchten, ob die Bildung von Gas1-Cluster-GFP möglich ist (Abbildung 3). Wir beobachteten, dass Gas1-GFP in sec31-1emp24Δ und sec31-1ted1Δ, wie bereits in sec31-1 GhLag1 gezeigt, überwiegend unclustert vorliegt und über die gesamte ER-Membran verteilt ist, während es in sec31-1lst1Δ dem Verhalten von sec31-1 ähnelt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Clusterbildung von Gas1-GFP neben dem Vorhandensein von C26-Ceramid in der ER-Membran auch die Bindung an den p24-Komplex erfordert und keine spezifische Rekrutierung von Lst1 voraussetzt. Anschließend untersuchten wir die Möglichkeit, dass die Kettenlänge des Ceramids in der ER-Membran die Bindung von Gas1-GFP an p24 reguliert. Wir fanden jedoch heraus, dass das Vorhandensein von C18-C16-Ceramid in der Membran weder die vom p24-Komplex rekonstruierten GPI-Glykane (Abbildungen S3 und S4, A und B) noch die Bindung an GPI-AP und die Fähigkeit zum Export von GPI-AP beeinflusst. Rekrutierung des COPII-Subtyps Lst1 (Abbildung S4C). Daher benötigt die C26-Ceramid-abhängige Clusterbildung keine Proteininteraktionen mit verschiedenen ER-Exportproteinmechanismen, sondern unterstützt einen alternativen, durch die Lipidlänge gesteuerten Sortierungsmechanismus. Anschließend analysierten wir, ob die Länge der Ceramid-Acylkette in der ER-Membran für die effektive Klassifizierung von Gas1-GFP als selektives ERES wichtig ist. Da Gas1 im GhLag1-Stamm mit kurzkettigem Ceramid das ER verlässt und in die Plasmamembran eintritt (Abbildung S5), gehen wir davon aus, dass Gas1 im GhLag1-Stamm umgeleitet und durch die Membran transportiert werden kann, wenn die Sortierung durch die Länge der Ceramid-Acylkette gesteuert wird. ERES-Güter mit derselben Membran.
(A) Die Zellmembran von GhLag1 enthält hauptsächlich kürzere C18-C16-Ceramide, während der GPI-Anker von Gas1-GFP weiterhin das gleiche C26-IPC wie Wildtypzellen aufweist. Oben: Analyse der Acylkettenlänge von Ceramid in der Zellmembran von Wildtyp- (Wt) und GhLag1p-Stämmen mittels Massenspektrometrie (MS). Die Daten geben den prozentualen Anteil des Gesamtceramids an. Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken = Standardabweichung (SD). Zweiseitiger ungepaarter t-Test. **** P < 0,0001. Unten: MS-Analyse der Acylkettenlänge des im Gas1-GFP (GPI-IPC)-GPI-Anker vorhandenen IPC, exprimiert in Wildtyp- und GhLag1p-Stämmen. Die Daten geben den prozentualen Anteil des gesamten IPC-Signals an. Mittelwert aus fünf unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken = Standardabweichung (SD). Zweiseitiger ungepaarter t-Test. ns, nicht signifikant. P = 0,9134. (B) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von sec31-1-, sec31-1 GhLag1-, sec31-1emp24Δ-, sec31-1ted1Δ- und sec31-1lst1Δ-Zellen, die Galactose-induziertes Gas1-GFP exprimieren, wurden 30 Minuten bei 37 °C inkubiert und anschließend auf 24 °C abgekühlt. Für die routinemäßige Fluoreszenzmikroskopie wurde eine Analyse durchgeführt. Weißer Pfeil: ER-Gas1-GFP-Cluster. Offener Pfeil: Nicht-clustered Gas1-GFP ist über die gesamte ER-Membran verteilt und zeigt die für das ER charakteristische Kernringfärbung. Maßstabsbalken: 5 μm. (C) Quantifizierung der in (B) beschriebenen Mikrofotografie. Durchschnittlicher Prozentsatz der Zellen mit punktförmiger Gas1-GFP-Struktur. Drei unabhängige Experimente, n ≥ 300 Zellen. Fehlerbalken = Standardabweichung. Zweiseitiger ungepaarter t-Test. **** P < 0,0001.
Um dieses Problem direkt zu lösen, führten wir eine SCLIM-Visualisierung von Gas1-GFP und Mid2-iRFP in GhLag1 mit dem temperatursensitiven sec31-1-Mutantenallel durch (Abbildung 4 und Film S4). Nachdem das ER bei 37 °C gehalten und anschließend bei 24 °C freigesetzt wurde, war der größte Teil des neu synthetisierten Gas1-GFP nicht geclustert, sondern über die gesamte ER-Membran verteilt, wie mit herkömmlichen Mikroskopen beobachtet wurde (Abbildung 4, A und B). Darüber hinaus enthielt ein großer Anteil der ERES (67 %) zwei verschiedene Frachtarten, die gemeinsam lokalisiert waren (Abbildung 4D). Abbildung 4C, Panels 1 und 2, zeigt zwei typische Beispiele von ERES mit überlappenden Gas1-GFP- und Mid2-GFP-Molekülen. Beide Frachtarten wurden zudem in dieselbe ERES rekrutiert (Abbildung 4E, Panel 3 und Film S4). Unsere Ergebnisse deuten daher darauf hin, dass die Länge der Ceramid-Acylkette in der ER-Membran ein wichtiger Faktor für die Aggregation und Klassifizierung von ER-Proteinen ist.
Sec31-1 GhLag1-Zellen, die Galactose-induzierte Sekrete, Gas1-GFP (GPI-AP, grün) und Mid2-iRFP (TMP, blau) sowie konstitutiv ERES-markiertes Sec13-mCherry (ERES, magenta) exprimieren, werden bei 37 °C inkubiert. Nach 30 Minuten wird die Temperatur auf 24 °C gesenkt, um die Sekrete freizusetzen. Anschließend erfolgt die Bildgebung mit SCLIM nach weiteren 20 Minuten. (A bis C) Repräsentative 2D-Projektionsbilder (A; Maßstabsbalken: 1 μm) bzw. 3D-Bilder der Zellhemisphäre (B und C; Maßstabseinheit: 0,45 μm) der 10 z-Schnitte, die mit Fracht und ERES markiert sind. Die untere Abbildung in (B) und die Abbildung in (C) zeigen bearbeitete Bilder, die nur die in ERES (magenta) enthaltenen Güter [Gas1-GFP (grau) und Mid2-iRFP (hellblau)] darstellen. (C) Weißer Pfeil: Überlappung von ERES und Gütern. Offener Pfeil: ERES enthält nur ein Molekül. Unteres Bildfeld: Das ausgewählte ERES enthält überlappende Moleküle (1 und 2), die in (C) markiert sind. Maßstabsbalken: 100 nm. (D) Quantifizierung der in (C) beschriebenen Mikrofotografie. In den sec31-1- und sec31-1 GhLag1-Einheiten ist jeweils nur ein Molekül (Gas1-GFP oder Mid2-iRFP) enthalten. Angegeben ist der durchschnittliche Anteil isolierter und überlappender Moleküle im ERES. Die Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten mit n = 432 in 54 Zellen (sec31-1) und n = 430 in 47 Zellen (sec31-1 GhLag1). Fehlerbalken = Standardabweichung. Zweiseitiger ungepaarter t-Test. *** P = 0,0002 (sec31-1) und ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D-Darstellung des ausgewählten ERES mit überlappendem Molekül (3), das in (C) markiert ist. Gas1-GFP (grün) und Mid2-iRFP (blau) nähern sich ERES (magenta) von derselben Seite und verbleiben im selben ERES-Bereich. Maßstabsbalken: 100 nm.
Diese Studie liefert direkte In-vivo-Beweise dafür, dass lipidbasierte Proteinfrachten im Sekretionsweg selektiven Exportorten zugeordnet werden und zeigt die Bedeutung der Acylkettenlänge für diese Klassifizierungsselektivität auf. Mithilfe der leistungsstarken und hochmodernen Mikroskopietechnik SCLIM demonstrierten wir das neu synthetisierte Gas1-GFP (ein wichtiges Plasmamembran-GPI-AP mit einer sehr langen Acylkette (C26) im Ceramid-Lipidanteil) in Hefe. Die in diskreten ER-Bereichen geclusterten Regionen sind mit spezifischen ERES assoziiert, während transmembranäre sekretierte Proteine ​​über die gesamte ER-Membran verteilt sind (Abbildung 1). Darüber hinaus gelangen diese beiden Frachttypen selektiv in unterschiedliche ERES (Abbildung 2). Wird die Acylkettenlänge des zellulären Ceramids in der Membran von C26 auf C18-C16 reduziert, wird der Gas1-GFP-Cluster in die diskrete ER-Region aufgelöst, und Gas1-GFP wird umgeleitet, um das ER zusammen mit dem transmembranären Protein durch dasselbe ERES zu verlassen (Abbildung 3 und 4).
Obwohl GPI-AP einen spezialisierten Proteinmechanismus für den Austritt aus dem ER nutzt, fanden wir heraus, dass die C26-Ceramid-abhängige Trennung nicht auf unterschiedlichen Proteininteraktionen beruht, die zu einer Spezialisierung des ER-Sekretionssystems (ERES) führen könnten (Abbildungen S4 und S5). Stattdessen unterstützen unsere Ergebnisse einen alternativen Klassifizierungsmechanismus, der durch lipidbasierte Proteinclusterbildung und den anschließenden Ausschluss anderer Frachten bedingt ist. Unsere Beobachtungen zeigen, dass die mit einem spezifischen ERES assoziierte Gas1-GFP-Region bzw. deren Cluster das transmembranäre sezernierte Protein Mid2-iRFP nicht enthält. Dies deutet darauf hin, dass der C26-Ceramid-abhängige GPI-AP-Cluster den Eintritt in das entsprechende ERES erleichtert und gleichzeitig transmembranäre Sekretionen ausschließt, die in dieses spezifische ERES gelangen (Abbildungen 1 und 2). Im Gegensatz dazu führt das Vorhandensein von C18-C16-Ceramiden in der ER-Membran nicht zur Bildung von GPI-AP-Regionen oder -Clustern, sodass diese transmembranäre sezernierte Proteine ​​nicht ausschließen oder im selben ERES ersetzen (Abbildungen 3 und 4). Daher schlagen wir vor, dass C26-Ceramid die Trennung und Klassifizierung durch die Erleichterung der Clusterbildung von Proteinen, die mit spezifischen ERES verknüpft sind, vorantreibt.
Wie wird diese C26-Ceramid-abhängige Clusterbildung in einem spezifischen ER-Bereich erreicht? Die Tendenz von Membran-Ceramid zur lateralen Trennung könnte dazu führen, dass GPI-AP und C26-Ceramid in der unregelmäßigeren Lipidumgebung der ER-Membran, die kürzere und ungesättigte Glycerolipide enthält, kleine und vorübergehend geordnete Lipidcluster bilden (17, 18). Diese kleinen temporären Cluster können nach Bindung an den p24-Komplex zu größeren, stabileren Clustern fusionieren (34). In Übereinstimmung damit konnten wir zeigen, dass C26 Gas1-GFP mit dem p24-Komplex interagieren muss, um größere, sichtbare Cluster zu bilden (Abbildung 3). Der p24-Komplex ist ein heterozygoter Oligomer, der in Hefe aus vier verschiedenen p24-Transmembranproteinen besteht (35). Er ermöglicht multivalente Bindungen, die zur Vernetzung kleiner GPI-AP-Cluster und damit zur Bildung größerer, stabiler Cluster führen können (34). Die Interaktion zwischen den Protein-Ektodomänen von GPI-APs kann ebenfalls zu deren Aggregation beitragen, wie während ihres Golgi-Transports in polarisierten Epithelzellen von Säugetieren gezeigt wurde (36). Ist jedoch C18-C16-Ceramid in der ER-Membran vorhanden, bilden sich bei der Bindung des p24-Komplexes an Gas1-GFP keine großen, voneinander getrennten Cluster. Der zugrundeliegende Mechanismus hängt möglicherweise von den spezifischen physikalischen und chemischen Eigenschaften des langkettigen Acylceramids ab. Biophysikalische Untersuchungen an künstlichen Membranen zeigen, dass zwar sowohl langkettige (C24) als auch kurzkettige (C18-C16) Acylceramide Phasentrennung verursachen können, aber nur langkettige Acylceramide (C24) eine hohe Krümmung und Filmbiegung zur Umformung des Films durch gegenseitige Referenzierung fördern (17, 37, 38). Es wurde gezeigt, dass die Transmembranhelix von TMED2, dem humanen Homolog von Emp24, selektiv mit C18-Ceramid-basiertem Sphingomyelin in den zytoplasmatischen Lobuli interagiert (39). Mithilfe von Molekulardynamik-Simulationen (MD) fanden wir heraus, dass sich sowohl C18- als auch C26-Ceramide um die zytoplasmatischen Lobuli der Emp24-Transmembranhelix anreichern und ähnliche Präferenzen aufweisen (Abbildung S6). Dies deutet darauf hin, dass die Transmembranhelix von Emp24 zu einer asymmetrischen Lipidverteilung in der Membran führen kann. Dieses Ergebnis basiert auf aktuellen Untersuchungen an Säugetierzellen. Ähnliche MD-Simulationen zeigen auch das Vorhandensein von Etherlipiden (40). Daher vermuten wir, dass C26-Ceramid in den beiden Lobuli von ER26 lokal angereichert ist. Wenn GPI-AP in den luminalen Lobuli direkt an multivalentes p24 bindet und sich C26-Ceramid um p24 in den cytoplasmatischen Lobuli anreichert, kann dies die begleitende Proteinaggregation und Membrankrümmung fördern, die durch die Finger (41) erzeugt wird. Dies führt zur Trennung von GPI-AP in diskrete Bereiche in der Nähe von ERES, was wiederum die stark gekrümmten Bereiche der ER-Membran begünstigt (42). Frühere Berichte stützten den vorgeschlagenen Mechanismus (43, 44). Die multivalente Bindung von Oligolektinen, Pathogenen oder Antikörpern an Ceramid-basierte Glycosphingolipide (GSL) auf der Plasmamembran löst eine starke GSL-Aggregation aus, verstärkt die Phasentrennung und verursacht Membranverformung und Internalisierung (44). Iwabuchi et al. (43) fanden heraus, dass in Gegenwart langer (C24), nicht aber kurzer (C16) Acylketten der an GSL-Lactosylceramid gebundene multivalente Ligand die Bildung großer Cluster und Membraninvaginationen induzierte und dass die Cytoplasma-Lyn-vermittelte Signaltransduktion auf den Membranblättern in gekoppelten Neutrophilen durch Acylketten interdigitiert wird.
In polarisierten Epithelzellen von Säugetieren reguliert die Konzentration des Anti-Golgi-Netzwerks (TGN) an der apikalen Plasmamembran die Trennung und das Sortieren von GPI-AP (10, 45). Diese Aggregation wird durch die Oligomerisierung von GPI-AP angetrieben (36), könnte aber auch von der Ceramidkettenlänge in Hefe abhängen. Obwohl GPI-AP in Säugetieren einen Etherlipid-basierten Anker besitzt und sich seine chemische Struktur stark von der des langkettigen Acylceramids unterscheidet, zeigte eine aktuelle Studie, dass beide Lipide evolutionär ähnliche physikalische und chemische Eigenschaften und Funktionen aufweisen (40). Daher könnte der Etherlipidanteil in Säugetierzellen dem C26-Ceramid in Hefe ähneln und die Rolle spielen, mit dem langkettigen Ceramid in der Membran zu assoziieren, um die Aggregation und das Sortieren von GPI-AP zu fördern. Obwohl diese Möglichkeit noch direkt untersucht werden muss, deuten frühere Befunde darauf hin, dass der Transport von langkettigem Ceramid zum Golgi-Apparat nicht durch zytoplasmatische Transferproteine ​​erfolgt, sondern – ähnlich wie bei Hefen – von der Synthese von GPI-Ankern abhängt. Daher scheint der evolutionär konservative Mechanismus in der Lage zu sein, sehr langkettiges Ceramid und GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) selektiv im selben Transportvesikel zu kotransportieren.
In polarisierten Epithelzellsystemen von Hefen und Säugetieren erfolgen die Aggregation und Trennung von GPI-APs von anderen Plasmamembranproteinen, bevor diese die Zelloberfläche erreichen. Paladino et al. (48) fanden heraus, dass die Clusterbildung von GPI-APs im TGN polarisierter Epithelzellen von Säugetieren nicht nur für die selektive Zuordnung von GPI-APs zur apikalen Plasmamembran notwendig ist, sondern auch die Clusterorganisation und die biologische Aktivität der GPI-APs reguliert. In Hefen zeigte diese Studie, dass der C26-Ceramid-abhängige GPI-AP-Cluster im ER die Clusterorganisation und die funktionelle Aktivität von GPI-APs auf der Plasmamembran regulieren kann (24, 49). Im Einklang mit diesem Modell reagieren GhLag1-Zellen allergisch auf GPI-Inhibitoren oder Medikamente, die die Zellwandintegrität beeinträchtigen (28). Die Notwendigkeit funktioneller Gas1-GFP-Cluster (49) des an der Spitze des Zellmembrans projizierten Ceramids bei der Paarung von Hefezellen deutet auf mögliche physiologische Konsequenzen eines GPI-AP-Fehlers in hLag1-Zellen hin. Die Frage, ob die funktionelle Organisation der Zelloberfläche vom ER aus durch eine auf der Lipidlänge basierende Sortiermethode programmiert wurde, wird Gegenstand unserer zukünftigen Forschung sein.
Die in dieser Arbeit verwendeten Saccharomyces cerevisiae-Stämme sind in Tabelle S1 aufgeführt. Die SCLIM-Stämme MMY1583 und MMY1635 für die Lebendzellmikroskopie wurden auf Basis von W303 konstruiert. Diese Stämme, die Sec13-mCherry mit einem Fluoreszenzprotein-Tag exprimieren, wurden mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit dem Plasmid pFA6a als Template erzeugt (23). Der Stamm, der Mid2-iRFP unter der Kontrolle des GAL1-Promotors mit einem Fluoreszenzprotein markiert exprimiert, wurde wie folgt konstruiert: PCR-Amplifikation der iRFP-KanMx-Sequenz aus dem Vektor pKTiRFP-KAN (Geschenk von E. O'Shea, Addgene-Plasmidnummer 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; RRID: Addgene_64687) und Insertion in den C-Terminus des endogenen Mid2. Nachdem die Mid2-iRFP-Genomsequenz amplifiziert und in den GAL1-Promotor kloniert worden war, wurde sie in die NotI-SacI-Schnittstelle des Integrationsplasmids pRS306 integriert. Das resultierende Plasmid pRGS7 wurde mit PstI linearisiert, um in den URA3-Locus zu integrieren.
Das Gas1-GFP-Fusionsgen wird unter der Kontrolle des GAL1-Promotors im Centromer-Plasmid (CEN) exprimiert, das wie folgt konstruiert wurde. Die Gas1-GFP-Sequenz wurde mittels PCR aus dem Plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (Geschenk von L. Popolo) amplifiziert und in die XmaI–XhoI-Schnittstelle des CEN-Plasmids pBEVY-GL LEU2 (Geschenk von C. Miller; Addgene-Plasmidnummer 51225; http://n2t.net/addgene:51225; RRID: Addgene_51225) kloniert. Das resultierende Plasmid wurde pRGS6 genannt. Das Axl2-GFP-Fusionsgen wird ebenfalls unter der Kontrolle des GAL1-Promotors des Vektors pBEVY-GL LEU2 exprimiert und wie folgt konstruiert. Die Axl2-GFP-Sequenz wurde mittels PCR aus dem Plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) amplifiziert und in die BamHI-PstI-Schnittstelle des Vektors pBEVY-GL LEU2 kloniert. Das resultierende Plasmid wurde pRGS12 genannt. Die Sequenz der in dieser Studie verwendeten Oligonukleotide ist in Tabelle S2 aufgeführt.
Der Stamm wurde mit 0,2 % Adenin und 2 % Glucose [YP-Dextrose (YPD)], 2 % Raffinose [YP-Raffinose], Hefeextrakt-Protein-p (YP)-Medium (1 % Hefeextrakt und 2 % Protein-ept) [YPR)] oder 2 % Galactose [YP-Galactose (YPG)] als Kohlenstoffquelle ergänzt. Alternativ wurde ein synthetisches Minimalmedium (0,15 % Hefe-Stickstoffbasis und 0,5 % Ammoniumsulfat) verwendet, um die für die Ernährung benötigten Aminosäuren und Basen zu ergänzen. Dieses Medium enthielt entweder 2 % Glucose (synthetisches Glucose-Minimalmedium) oder 2 % Galactose (synthetisches Galactose-Minimalmedium) als Kohlenstoffquelle.
Für die Echtzeit-Bildgebung wurden temperatursensitive sec31-1-Mutantenzellen, die das Konstrukt unter dem GAL1-Promotor exprimierten, über Nacht in YPR-Medium bei 24 °C bis zur mittleren logarithmischen Wachstumsphase kultiviert. Nach einstündiger Induktion in YPG bei 24 °C wurden die Zellen 30 Minuten in SG bei 37 °C inkubiert und anschließend zur Aufhebung der Sekretionsblockade auf 24 °C überführt. Die Zellen wurden mit Concanavalin A auf einem Objektträger fixiert und mittels SCLIM abgebildet. SCLIM ist eine Kombination aus einem inversen Fluoreszenzmikroskop Olympus IX-71 und einem UPlanSApo 100×1,4 Öl-Objektiv (Olympus), einem schnellen, hochauflösenden Rotationsscheiben-Konfokalmikroskop (Yokogawa Electric), einem kundenspezifischen Spektrometer und einer kundenspezifischen Kühlung. Der Bildverstärker des Systems (Hamamatsu Photonics) ermöglicht eine Vergrößerung von ×266,7 und ist mit einer CCD-Kamera (Hamamatsu Photonics) zur Elektronenvervielfachung ausgestattet (21). Die Bildaufnahme erfolgt mittels einer eigens entwickelten Software (Yokogawa Electric). Für die 3D-Bilder wurde ein eigens entwickelter piezoelektrischer Aktor verwendet, um das Objektiv vertikal zu vibrieren. Die optischen Komponenten wurden in einem Abstand von 100 nm gestapelt. Das Z-Stapel-Bild wird in 3D-Voxeldaten umgewandelt, und die theoretische Punktspreizfunktion des rotierenden Scheibenkonfokalmikroskops wird mittels der Volocity-Software (PerkinElmer) zur Dekonvolutionsverarbeitung verwendet. Durch die automatische Schwellenwertbestimmung der Volocity-Software für die Kolokalisationsanalyse wurde ERES einschließlich Fracht vermessen. Die Linienabtastanalyse erfolgte mit der MetaMorph-Software (Molecular Devices).
Verwenden Sie die Software GraphPad Prism, um die statistische Signifikanz zu bestimmen. Beim zweiseitigen t-Test nach Student und der einfachen einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) gelten Unterschiede zwischen Gruppen als signifikant bei einem p-Wert < 0,05 (*).
Für die Fluoreszenzmikroskopie von Gas1-GFP wurden Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase über Nacht in YPD kultiviert, durch Zentrifugation geerntet, zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und mindestens 15 Minuten auf Eis inkubiert. Die weitere mikroskopische Untersuchung erfolgte wie zuvor beschrieben (Check (24)). Die Bildaufnahme wurde mit einem Leica DMi8-Mikroskop (HCX PL APO 1003/1.40 Öl PH3 CS), ausgestattet mit einem Objektiv, einem L5 (GFP)-Filter, einer Hamamatsu-Kamera und der Software Application Suite X (LAS X), durchgeführt.
Die Proben wurden mit SDS-Probenpuffer 10 Minuten lang bei 65 °C denaturiert und anschließend mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt. Für die Immunoblot-Analyse wurden 10 μl Probe pro Spur aufgetragen. Primäre Antikörper: Es wurden folgende Antikörper verwendet: polyklonaler Kaninchen-Anti-Gas1-Antikörper (1:3000), polyklonaler Kaninchen-Anti-Emp24-Antikörper (1:500) und polyklonaler Kaninchen-Anti-GFP-Antikörper (1:3000; freundlicherweise zur Verfügung gestellt von H. Riezman). Der monoklonale Maus-Anti-Pgk1-Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:5000 verwendet (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von J. de la Cruz). Sekundäre Antikörper: Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulin G (IgG) in einer Verdünnung von 1:3000 (Pierce). HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG wurde in einer Verdünnung von 1:3000 (Pierce) verwendet. Die Immunantwortzone wurde mittels Chemilumineszenz-Methode mit dem SuperSignal West Pico-Reagenz (Thermo Fisher Scientific) sichtbar gemacht.
Wie in (31) beschrieben, wurde ein natürliches Immunpräzipitationsexperiment mit der angereicherten ER-Fraktion durchgeführt. Dazu wurden Hefezellen zweimal mit TNE-Puffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und Proteaseinhibitor-Cocktail] bei 600 nm (OD₆₀₀ 100) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit Glasperlen aufgeschlossen und Zelltrümmer sowie Glasperlen durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wurde 15 Minuten bei 4 °C und 17.000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde in TNE resuspendiert und Digitalissaponin bis zu einer Endkonzentration von 1 % zugegeben. Die Suspension wurde 1 Stunde bei 4 °C unter Rotation inkubiert und anschließend die unlöslichen Bestandteile durch Zentrifugation bei 4 °C und 13.000 g für 60 Minuten entfernt. Für die Gas1-GFP-Immunpräzipitation wurde die Probe zunächst 1 Stunde bei 4 °C mit leeren Agarose-Beads (ChromoTek) vorinkubiert und anschließend 3 Stunden bei 4 °C mit GFP-Trap_A (ChromoTek) inkubiert. Die immunpräzipitierten Beads wurden fünfmal mit TNE, das 0,2 % Digoxigenin enthielt, gewaschen, mit SDS-Probenpuffer eluiert, mittels SDS-PAGE aufgetrennt und durch Immunoblotting analysiert.
Wie in (31) beschrieben, wurde die Vernetzungsbestimmung an der angereicherten ER-Fraktion durchgeführt. Kurz gesagt, die angereicherte ER-Fraktion wurde mit 0,5 mM Dithiobis(succinimidylpropionat) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20 °C, 20 min) inkubiert. Die Vernetzungsreaktion wurde durch Zugabe von Glycin (50 mM Endkonzentration, 5 min, 20 °C) gestoppt.
Wie bereits beschrieben (50), wurde eine MS-Analyse von Ceramid in Wildtyp- und GhLag1-Stämmen durchgeführt. Kurz gesagt, wurden die Zellen in YPD bei 30 °C bis zur exponentiellen Wachstumsphase (3 bis 4 OD600-Einheiten/ml) kultiviert und 25 × 10⁷ Zellen geerntet. Der Zellstoffwechsel wurde mit Trichloressigsäure gestoppt. Als Extraktionsmittel wurde Ethanol, Wasser, Ether, Pyridin und 4,2 N Ammoniaklösung (15:15:5:1:0,018 v/v) sowie 1,2 nmol interner Standard (C17-Ceramid, 860517, Avanti Polar Lipid) verwendet. Die Extrakte wurden mit Monomethylamin-Reagenz (Methanol, Wasser, n-Butanol und Methylaminlösung, 4:3:1:5 v/v) einer milden alkalischen Hydrolyse unterzogen und anschließend mit wassergesättigtem n-Butanol entsalzt. Abschließend wurde der Extrakt in einem Lösungsmittelgemisch für den positiven Modus [Chloroform/Methanol/Wasser (2:7:1) + 5 mM Ammoniumacetat] resuspendiert und in das Massenspektrometer injiziert. Die Identifizierung und Quantifizierung der Sphingolipidmoleküle erfolgte mittels Multi-Reaktions-Monitoring (MRM). Das TSQ Vantage Tertiär-Quadrupol-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) ist mit einer robotischen Nanoflow-Ionenquelle Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) für die Lipidanalyse ausgestattet. Die Kollisionsenergie wurde für jede Ceramidkategorie optimiert. Die MS-Daten wurden im positiven Modus erfasst. Für jede biologische Replikation wurde das Lipidsignal als Median aus drei unabhängigen Messungen bestimmt.
Wie in (31) beschrieben, wurden die Gas1-GFP-exprimierenden Zellen (800 × 10⁷) einer natürlichen Immunpräzipitation unterzogen. Das gereinigte Gas1-GFP wurde mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran transferiert. Das Protein wurde durch Färbung der PVDF-Membran mit Amidschwarz sichtbar gemacht. Die Gas1-GFP-Bande wurde von der PVDF-Membran ausgeschnitten und fünfmal mit Methanol und einmal mit LC-MS-Wasser gewaschen. Durch Inkubation des Membranstreifens mit 500 μl 0,3 M NaOAc-Puffer (pH 4,0) und 500 μl frisch gelöster 1 M Natriumnitritlösung für 3 Stunden bei 37 °C wird die Lipidfraktion von Gas1-GFP freigesetzt und lysiert. Freisetzung von Inosinphosphat-Ceramid zwischen Glucosamin und Inositol (51). Anschließend wurde der Membranstreifen viermal mit LC-MS-Wasser gewaschen, bei Raumtemperatur getrocknet und bis zur Analyse unter Stickstoffatmosphäre bei -80 °C gelagert. Als Kontrolle wurde für jedes Experiment eine leere PVDF-Membranprobe verwendet. Das aus Gas1-GFP extrahierte Lipid wurde anschließend wie beschrieben (50) mittels Massenspektrometrie analysiert. Kurz gesagt, wurden GPI-Lipid-haltige PVDF-Streifen in 75 μl Negativionen-Lösungsmittel [Chloroform/Methanol (1:2) + 5 mM Ammoniumacetat] resuspendiert und einer Elektrospray-Ionisations-(ESI)-MRM/MS-Analyse von Sphingolipid-Spezies (TSQ Vantage) unterzogen. Die Massenspektrometrie-Daten wurden in diesem Fall im Negativionenmodus erfasst.
Wie bereits erwähnt, wurde der Lipidanteil des GPI-Ankers vom [3H]-Inositol-markierten GPI-AP (16) abgetrennt. Die Lipide wurden mittels Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Laufmittelsystems (55:45:10 Chloroform-Methanol-0,25 % KCl) getrennt und mit FLA-7000 (Fujifilm) sichtbar gemacht.
Die Gas1-GFP-exprimierenden Zellen (600 × 10⁷) wurden zweimal mit TNE-Puffer gewaschen, mit Glasperlen aufgeschlossen und anschließend zentrifugiert, um Zelltrümmer und Glasperlen zu entfernen. Der Überstand wurde dann 1 Stunde bei 17.000 g und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde mit TNE gewaschen und 1 Stunde bei 37 °C mit 1 U PI-PLC (Invitrogen) in TNE mit 0,2 % Digitalissaponin inkubiert. Nach der Enzymbehandlung wurde die Membran durch Zentrifugation 1 Stunde bei 17.000 g und 4 °C abgetrennt. Zur Immunpräzipitation von Gas1-GFP wurde der Überstand über Nacht bei 4 °C mit GFP-Trap_A (ChromoTek) inkubiert. Das gereinigte Gas1-GFP wurde mittels SDS-PAGE aufgetrennt und mit Coomassie-Brillantblau gefärbt. Das Gas1-GFP-gefärbte Band wurde aus dem grauen Bereich um das Aquädukt ausgeschnitten. Nach Alkylierung mit Iodacetamid und Reduktion mit Dithiothreitol erfolgte die In-Gel-Verdauung mit Trypsin. Tryptische Peptide und Peptide mit GPI-Glykanen wurden extrahiert und getrocknet. Das getrocknete Peptid wurde in 20 μl Wasser gelöst. Eine Portion (8 μl) wurde in die LC injiziert. Zur Peptidtrennung unter spezifischen Gradientenbedingungen wurde eine Octadecylsilan (ODS)-Säule (Develosil 300ODS-HG-5; Innendurchmesser 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Präfektur Aichi, Japan) verwendet. Die mobile Phase bestand aus Lösungsmittel A (0,08 % Ameisensäure) und Lösungsmittel B (0,15 % Ameisensäure in 80 % Acetonitril). Zur Elution der Säule mit Lösungsmittel A wurde ein Accela-HPLC-System (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts, USA) verwendet. Die Elution erfolgte innerhalb von 55 Minuten bei einer Flussrate von 50 μl/min für 5 Minuten, anschließend wurde die Konzentration von Lösungsmittel B auf 40 % erhöht. Das Eluat wurde kontinuierlich in die ESI-Ionenquelle eingeleitet und die tryptischen Peptide sowie Peptide mit GPI-Glykanen mittels LTQ Orbitrap XL (Hybrid-Linear-Ionenfalle-Orbitrap-Massenspektrometer; Thermo Fisher Scientific) analysiert. Im MS-Aufbau betrug die Spannung der Kapillarquelle 4,5 kV und die Temperatur der Transferkapillare 300 °C. Die Kapillarspannung und die Tubuslinsenspannung wurden auf 15 V bzw. 50 V eingestellt. Die MS-Daten wurden im Positivionenmodus (Auflösung 60.000; Massengenauigkeit 10 ppm) in einem Massenbereich von 300/m/z Masse/Ladungs-Verhältnis (m/z) 3000 erfasst. Die MS/MS-Daten wurden mittels der Ionenfalle im LTQ Orbitrap XL gewonnen [die ersten 3 Ziffern, von denen die Daten abhängen, kollisionsinduzierte Dissoziation (CID)].
MD-Simulationen wurden mit der Software GROMACS (52) und dem Kraftfeld MARTINI 2 (53–55) durchgeführt. Anschließend wurde mit dem CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) eine Doppelschicht aus Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC) und Cer C18 bzw. DOPC und Cer C26 erstellt. Die Topologie und die Koordinaten von Cer C26 wurden aus DXCE abgeleitet, indem die überflüssigen Beads des Sphingosin-Schwanzes entfernt wurden. Die Doppelschicht wurde wie unten beschrieben balanciert und simuliert. Die resultierenden Koordinaten wurden verwendet, um ein System mit Emp24 zu erstellen. Die Transmembrandomäne von Hefe-Emp24 (Aminosäuren 173 bis 193) wurde mithilfe des Visual MD (VMD)-Tools Molecular Structure (58) als α-Helix konstruiert. Nach Entfernung der überlappenden Lipide wurde das Protein grob granuliert und mit CHARMM GUI in die Doppelschicht eingefügt. Das finale System enthält entweder 1202 DOPC und 302 Cer C26 oder 1197 DOPC und 295 Cer C18 und Emp24. Das System wird auf eine Konzentration von 0,150 M ionisiert. Für zwei Doppelschichtzusammensetzungen wurden jeweils vier unabhängige Replikate angefertigt.
Die Lipiddoppelschicht wird mithilfe des CHARMM-GUI-Prozesses balanciert. Dieser Prozess beinhaltet 405.000 Schritte zur Minimierung und anschließenden Balancierung, wobei die Positionsbeschränkungen schrittweise reduziert und eliminiert und der Zeitschritt von 0,005 ps auf 0,02 ps erhöht werden. Nach der Äquilibrierung werden 6 µs mit einem Zeitschritt von 0,02 ps erzeugt. Nach dem Einfügen von Emp24 wird derselbe CHARMM-GUI-Prozess zur Minimierung und Balancierung des Systems verwendet und anschließend 8 s lang im Produktionsmodus ausgeführt.
Bei allen Systemen wird der Druck während des Ausgleichsprozesses mittels eines Berendsen-Barostaten (59) und während des Produktionsprozesses mittels eines Parrinello-Rahman-Barostaten (60) geregelt. Der mittlere Druck beträgt in allen Fällen 1 bar, und es wird ein semi-isotropes Druckkopplungsschema verwendet. Im Ausgleichs- und Produktionsprozess wird ein Thermostat (61) mit Geschwindigkeitsrekalibrierung eingesetzt, um die Temperatur von Protein-, Lipid- und Lösungsmittelpartikeln jeweils zu koppeln. Die Zieltemperatur beträgt während des gesamten Prozesses 310 K. Die nicht-kovalente Wechselwirkung wird durch Generierung einer Paarungsliste mithilfe des Verlet-Schemas mit einer Puffertoleranz von 0,005 berechnet. Der Coulomb-Term wird unter Verwendung des Reaktionsfelds und eines Abschneideabstands von 1,1 nm berechnet. Der Van-der-Waals-Term verwendet ein Abschneideschema mit einem Abschneideabstand von 1,1 nm, und für die Potentialdrift wird das Verlet-Abschneideschema (62) verwendet.
Mithilfe von VMD wird die Grenzwellenlänge zwischen DOPC-Phosphat-Beads bzw. Ceramid-AM1-Beads und dem Protein auf 0,7 nm festgelegt und die Anzahl der mit dem Protein interagierenden Lipide berechnet. Der Depletions-Anreicherungs-Faktor (DE-Faktor) wird gemäß folgender Formel (63) berechnet: DE-Faktor = (Gesamtmenge der Lipide im Protein / 0,7) / (Menge an Ceramid in den Gesamtlipiden).
Der angegebene Wert ist ein Mittelwert, die Fehlerbalken stellen vier unabhängige Standardfehler dar. Die statistische Signifikanz des DE-Faktors wird mittels t-Test berechnet [(Mittelwert DE-Faktor - 1)/SE]. Der p-Wert wird anhand der einseitigen Verteilung ermittelt.
Das GROMACS-Tool wurde verwendet, um die laterale 2D-Dichtekarte des Emp24-haltigen Systems innerhalb der letzten 250 ns der Aufzeichnung zu berechnen. Um die Anreicherungs-/Verarmungskarte von Ceramid zu erhalten, wurde die Dichtekarte von Ceramid durch die Summe der Dichtekarten von Ceramid und DOPC und anschließend durch die Ceramidkonzentration im Körper dividiert. Es wurde dieselbe Farbskala verwendet.
Ergänzendes Material zu diesem Artikel finden Sie unter http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
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3D-Hochauflösungs-Echtzeitbildgebung zeigt die Bedeutung der Ceramidkettenlänge für die Proteinsortierung an selektiven Ausgabestellen.
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