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Ban-Lan-Gen-Granulat mildert die durch Dextransulfat-Natrium induzierte chronisch-rezidivierende Colitis bei Mäusen durch Modulation der Darmmikrobiota und Wiederherstellung der intestinalen SCFA-abgeleiteten GLP-1-Produktion.
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Peking University Shenzhen Hospital Department of Pharmacy, Shenzhen, Volksrepublik China; 2Shenzhen University Health Science Center School of Pharmacy, Shenzhen, Volksrepublik China; 3Guizhou Medical University Engineering Technology Research Center of Ethnic Medicine and Traditional Chinese Medicine Development and Application Ministry of Education, Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmacy, Guizhou Medical University, Guiyang, Volksrepublik China; 4 Department of Gastroenterology, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen, Volksrepublik China; 5 School of Pharmacy, Guizhou Medical University, State Key Laboratory of Medicinal Plant Function and Application, Guiyang; 6 Abteilung für Labormedizin, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen, China [email protected] Shen Xiangchun, Fakultät für Pharmazie, Medizinische Universität Guizhou, Guizhou, Volksrepublik China, 550004, E-Mail [email protected] Ziel: Die GLP-1-basierte Therapie stellt eine neue Behandlungsoption für chronisch-entzündliche Darmerkrankungen dar. Ban-Lan-Gen (BLG)-Granulat ist ein bekanntes antivirales Präparat der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) mit potenzieller entzündungshemmender Wirkung bei der Behandlung verschiedener Entzündungszustände. Seine entzündungshemmende Wirkung bei Colitis und sein Wirkmechanismus sind jedoch noch unklar. METHODEN: Es wurde eine durch Dextransulfat-Natrium (DSS) induzierte chronisch-rezidivierende Colitis bei Mäusen etabliert. Krankheitsaktivitätsindizes, histologische Schädigungsmarker und die Konzentrationen proinflammatorischer Zytokine wurden bestimmt, um die Schutzwirkung von BLG zu beurteilen. Die Auswirkungen von BLG auf die Darmmikrobiota und den Darm wurden anhand der Serum-GLP-1-Konzentrationen sowie der Konzentrationen von Gcg, GPR41 und GRP43 im Kolon charakterisiert. Expression, Zusammensetzung der Darmmikrobiota, SCFA-Konzentration im Stuhl und GLP-1-Freisetzung aus primären Dickdarmepithelzellen von Mäusen (SCFA-abgeleitete GLP-1-Produktion). Ergebnisse: Die BLG-Behandlung reduzierte signifikant den Gewichtsverlust, den DAI, die Dickdarmverkürzung, die Dickdarmgewebeschädigung und die Konzentrationen der proinflammatorischen Zytokine TNF-α, IL-1β und IL-6 im Dickdarmgewebe. Darüber hinaus konnte die BLG-Behandlung die Expression von Gcg, GPR41 und GRP43 im Dickdarm sowie die Serum-GLP-1-Konzentration bei Colitis-Mäusen signifikant wiederherstellen. Dies geschah durch die Erhöhung der SCFA-produzierenden Bakterien wie Akkermansia und Prevotellaceae_UCG-001 und die Reduktion der Bakterien wie Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas und Oscillibacter. Zusätzlich erhöhte die BLG-Behandlung signifikant die SCFA-Konzentration im Stuhl von Colitis-Mäusen. Gleichzeitig zeigten In-vitro-Experimente, dass der Fäkalextrakt von mit BLG behandelten Mäusen die GLP-1-Sekretion primärer kleiner muriner Dickdarmepithelzellen stark stimulieren kann. Schlussfolgerung: Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass BLG eine antikolitisartige Wirkung besitzt. BLG hat das Potenzial, als Therapie entwickelt zu werden, zumindest teilweise durch Modulation der Darmmikrobiota und Wiederherstellung der intestinalen SCFA-abgeleiteten GLP-1-Produktion. Vielversprechende Medikamente für chronisch rezidivierende Kolitis. Schlüsselwörter: Kolitis, Ban-Lan-Gen-Granulat, Darmmikrobiota, kurzkettige Fettsäuren, GLP-1
Colitis ulcerosa (CU) ist eine chronisch-entzündliche Darmerkrankung, die durch wiederkehrenden Durchfall, Bauchschmerzen, Gewichtsverlust und blutig-schleimigen Stuhl gekennzeichnet ist.¹ In letzter Zeit ist die Prävalenz von CU auch in Ländern mit zuvor niedriger Inzidenz, darunter China, aufgrund der zunehmenden Verbreitung westlicher Lebensstile gestiegen.² Dieser Anstieg stellt ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit dar und hat schwerwiegende Auswirkungen auf die Arbeitsfähigkeit und Lebensqualität der Betroffenen. Die Pathogenese der CU ist nach wie vor weitgehend ungeklärt, es gilt jedoch als allgemein anerkannt, dass genetische Faktoren, Umweltfaktoren, die Darmmikrobiota und das Immunsystem zur Entwicklung der CU beitragen.³ Bislang gibt es keine Heilung für CU. Ziel der Behandlung ist es, die klinischen Symptome zu kontrollieren, eine Remission herbeizuführen und aufrechtzuerhalten, die Schleimhautheilung zu fördern und Rezidive zu reduzieren. Zu den klassischen Therapien gehören Aminosalicylate, Kortikosteroide, Immunsuppressiva und Biologika. Aufgrund ihrer vielfältigen Nebenwirkungen können diese Medikamente jedoch nicht immer die gewünschte Wirkung erzielen. Nebenwirkungen.4 Jüngste Fallstudien haben gezeigt, dass die traditionelle chinesische Medizin (TCM) ein großes Potenzial bei der Linderung von Colitis ulcerosa mit geringer Toxizität aufweist, was darauf hindeutet, dass die Entwicklung neuer TCM-Therapien eine vielversprechende Behandlungsstrategie für Colitis ulcerosa darstellt.5-7
Banlangen-Granulat (BLG) ist ein traditionelles chinesisches Arzneimittel, das aus dem wässrigen Extrakt der Banlangen-Wurzel hergestellt wird.⁸ Neben seiner antiviralen Wirksamkeit zeigt BLG auch ein potenzielles entzündungshemmendes Potenzial bei der Behandlung verschiedener Entzündungskrankheiten.^9,10 Darüber hinaus wurden Glucosinolate (R,S-Goitrin, Progoitrin, Epiprorubin und Glucosid) sowie Nukleoside (Hypoxanthin, Adenosin, Uridin und Guanosin) und Indigo-Alkaloide wie Indigo und Indirubin aus wässrigen Extrakten von Radix isatidis isoliert und identifiziert.^11,12 Frühere Studien haben die starke antikolitisierende Wirkung von Adenosin, Uridin und Indirubin in verschiedenen Tiermodellen der Kolitis belegt.^13–17 Bislang liegen jedoch keine evidenzbasierten Studien zur Wirksamkeit von BLG bei Kolitis vor. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die protektive Wirkung von BLG auf Dextransulfat-Natrium. (DSS)-induzierte chronisch rezidivierende Kolitis bei C57BL/6 Mäusen und stellten fest, dass die orale Verabreichung von BLG die DSS-induzierte chronisch rezidivierende Kolitis bei Mäusen signifikant abschwächte. Entzündungen und ihre regulatorischen Mechanismen sind mit der Modulation der Darmmikrobiota und der Wiederherstellung der aus dem Darm stammenden Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1)-Produktion verbunden.
BLG-Granulat (zuckerfrei, NMPA-zugelassen Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Peking, China; Chargennummer: 20110966) wurde in Apotheken erworben. DSS (Molekulargewicht: 36.000–50.000 Dalton) wurde von MP Biologicals (Santa Ana, USA) bezogen. Sulfasalazin (SASP) (≥ 98 % Reinheit), Hämatoxylin und Eosin wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Luminex-ELISA-Kits für Maus-TNF-α, IL-1β und IL-6 wurden von R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) bezogen. Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure wurden von Aladdin Industries (Shanghai, China) bezogen. 2-Ethylbuttersäure wurde von Merck KGaA bezogen. (Darmstadt, Deutschland).
Sechs bis acht Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse (Körpergewicht 18–22 g) wurden von Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Peking, China) bezogen und in einer Umgebung von 22 ± 2 °C mit einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Die Mäuse erhielten eine Woche lang Standard-Nagerfutter und hatten freien Zugang zu Trinkwasser, um sich an die neue Umgebung zu gewöhnen. Anschließend wurden die Mäuse zufällig in vier Gruppen eingeteilt: Kontrollgruppe, DSS-Modellgruppe, SASP-behandelte Gruppe (200 mg/kg, oral) und BLG-behandelte Gruppe (1 g/kg, oral). Wie in Abbildung 1A dargestellt, wurde gemäß unserer vorherigen Studie eine experimentelle chronisch-rezidivierende Kolitis in den Mäusen durch drei Zyklen mit 1,8 % DSS über 5 Tage, gefolgt von destilliertem Wasser über 7 Tage, induziert.¹⁸ Die Mäuse der SASP- und BLG-behandelten Gruppen wurden ab Tag 1 täglich mit SASP bzw. BLG behandelt. 0. Gemäß Vorversuchen wurde die Dosis von BLG auf 1 g/kg festgelegt. Die Dosis von SASP wurde gemäß der Literatur⁴ auf 200 mg/kg festgelegt. Die Kontrollgruppe und die DSS-Modellgruppe erhielten während des gesamten Versuchs die gleiche Wassermenge.
Abbildung 1: BLG lindert DSS-induzierte chronisch-rezidivierende Kolitis bei Mäusen. (A) Versuchsaufbau der chronisch-rezidivierenden Kolitis und Behandlung, (B) Körpergewichtsveränderung, (C) Krankheitsaktivitätsindex (DAI), (D) Kolonlänge, (E) repräsentatives Bild des Kolons, (F) H&E-Färbung des Kolons (100-fache Vergrößerung) und (G) histologischer Score. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) (n = 6) dargestellt. ##p < 0,01 oder ###p < 0,001 vs. Kontrollgruppe (Con); *p < 0,05 oder **p < 0,01 oder ***p < 0,001 vs. DSS-Gruppe.
Körpergewicht, Stuhlkonsistenz und rektale Blutungen wurden täglich erfasst. Der Krankheitsaktivitätsindex (DAI) wurde, wie bereits beschrieben, durch Kombination der Werte für Körpergewicht, Stuhlkonsistenz und rektale Blutungen bestimmt.¹⁹ Am Ende des Experiments wurden alle Mäuse euthanasiert und Blut, Kot und Dickdarm für weitere Experimente entnommen.
Kolongewebe wurde in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Es wurden 5 µm dicke Schnitte angefertigt und mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) gefärbt, anschließend verblindet und wie zuvor beschrieben beurteilt.19
Die Gesamt-RNA aus Kolongewebe wurde mit Trizol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) extrahiert, gefolgt von einer cDNA-Extraktion mit reverser Transkriptase (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japan). Die quantitative PCR wurde mit einem Echtzeit-PCR-System und SYBR Green Master (Roche, Basel, Schweiz) durchgeführt. Die Zielgen-Transkripte wurden auf β-Actin normalisiert und die Daten mittels der 2^-ΔΔCT-Methode analysiert. Die Genprimersequenzen sind in Tabelle 1 dargestellt.
Die Isolierung und Kultivierung primärer Dickdarmepithelzellen von Mäusen erfolgte wie bereits beschrieben.²⁰ Kurz gesagt, wurden die Dickdärme von 6–8 Wochen alten Mäusen nach Tötung durch Genickbruch entnommen, längs aufgeschnitten, mit Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, ohne Calcium und Magnesium) behandelt und in 0,5–1 mm große Stücke geschnitten. Anschließend wurden die Gewebe mit 0,4 mg/ml Kollagenase XI (Sigma, Poole, UK) in DMEM-freiem Medium digeriert und 5 min bei 300 × g und Raumtemperatur zentrifugiert. Das Pellet wurde in DMEM-Medium (supplementiert mit 10 % fötalem Kälberserum, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin) bei 37 °C resuspendiert und durch ein Nylonnetz (Porengröße ~250 µm) filtriert. Aliquots der Dickdarmepithelzellen wurden in Glasbodenschalen gegeben. und wurden 2 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 mit Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure und Mausfäkalextrakten inkubiert.
Kolongewebe wurde mit PBS homogenisiert, und die Konzentrationen der Zytokine IL-6, TNF-α und IL-1β im Kolongewebe wurden mittels Luminex-ELISA-Kits (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) bestimmt. Ebenso wurden die GLP-1-Konzentrationen im Serum und im Kulturmedium primärer muriner Kolonepithelzellen mit einem ELISA-Kit (Bioswamp, Wuhan, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt.
Die Gesamt-DNA aus Fäzes wurde mit einem DNA-Extraktionskit (Tiangen, China) extrahiert. Qualität und Quantität der DNA wurden anhand der Absorptionsverhältnisse bei 260 nm/280 nm bzw. 260 nm/230 nm bestimmt. Anschließend wurden die extrahierte DNA und die spezifischen Primer 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) und 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) zur Amplifikation der V3-V4-Regionen des 16S-rRNA-Gens in verschiedenen Bereichen verwendet. Die PCR-Produkte wurden mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Deutschland) gereinigt, mittels Real-Time-PCR quantifiziert und mit der Illumina MiSeq PE300 Sequenzierungsplattform (Illumina Inc., CA, USA) sequenziert. Die bioinformatische Datenverarbeitung erfolgte gemäß zuvor publizierten Protokollen.^21,22 Kurz gesagt, wurden die Rohdaten mit Cutadapt (V1.9.1) gefiltert. Die OTUs wurden mittels … geclustert. UPARSE (Version 7.0.1001) mit einem Ähnlichkeitsgrenzwert von 97 % wurde verwendet, und UCHIME wurde zur Entfernung chimärer Sequenzen eingesetzt. Die Analyse und Klassifizierung der Gemeinschaftszusammensetzung erfolgte mithilfe des RDP-Klassifikators (http://rdp.cme.msu.edu/) auf Basis der SILVA-Ribosomen-RNA-Gendatenbank.
Die Konzentrationen kurzkettiger Fettsäuren (Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure) wurden wie zuvor von Tao et al. beschrieben, jedoch mit einigen Modifikationen, gemessen.23 Kurz gesagt, wurden 100 mg Fäzes zunächst in 0,4 ml deionisiertem Wasser suspendiert, gefolgt von 0,1 ml 50%iger Schwefelsäure und 0,5 ml 2-Ethylbuttersäure (interner Standard), dann homogenisiert und bei 4 °C erhitzt. Die Proben wurden 15 Minuten bei 12.000 U/min und Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 0,5 ml Ether extrahiert und zur Analyse in den Gaschromatographen (GC) injiziert. Die gaschromatographische Analyse (GC) erfolgte mit einem GC-2010 Plus Gaschromatographen (Shimadzu, Inc.), ausgestattet mit einem Flammenionisationsdetektor (FID). Die Trennung wurde mit einer ZKAT-624-Säule (30 m × 0,53 mm × 0,3 μm; Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., China) durchgeführt. Die Datenerfassung erfolgte mit der GC-Solution-Software (Shimadzu, Inc.). Das Splitverhältnis betrug 10:1, als Trägergas wurde Stickstoff verwendet, die Flussrate lag bei 6 ml/min. Das Injektionsvolumen betrug 1 μl. Die Temperatur von Injektor und Detektor betrug 300 °C. Die Ofentemperatur wurde 13,5 Minuten bei 140 °C gehalten und anschließend erhöht. 250 °C mit einer Aufheizrate von 120 °C/min; die Temperatur wurde 5 Minuten lang gehalten.
Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Die Signifikanz der Daten wurde mittels einer einfaktoriellen ANOVA mit anschließendem Duncan-Test ermittelt. Alle Berechnungen wurden mit der Software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) durchgeführt; ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Es ist bekannt, dass Colitis ulcerosa (CU) eine chronisch rezidivierende Kolitis mit starken Bauchschmerzen, Durchfall und Blutungen ist. Daher wurde eine DSS-induzierte chronisch rezidivierende Kolitis bei Mäusen etabliert, um die Wirksamkeit von BLG gegen Kolitis zu untersuchen (Abb. 1A). Im Vergleich zur Kontrollgruppe wiesen die Mäuse der DSS-Modellgruppe ein signifikant reduziertes Körpergewicht und einen höheren DAI-Wert auf. Diese Veränderungen waren nach 24-tägiger BLG-Behandlung signifikant reversibel (Abb. 1B und C). Die Verkürzung des Kolons ist ein wichtiges Kennzeichen von CU. Wie in Abb. 1D und E dargestellt, war die Kolonlänge der mit DSS behandelten Mäuse signifikant verkürzt, was durch die BLG-Behandlung jedoch behoben wurde. Anschließend wurde eine histopathologische Analyse durchgeführt, um die Kolonentzündung zu beurteilen. H&E-gefärbte Bilder und pathologische Scores zeigten, dass die DSS-Gabe die Kolonarchitektur signifikant beeinträchtigte und zu Kryptenzerstörung führte, während die BLG-Behandlung die Kryptenzerstörung und die pathologischen Scores signifikant reduzierte (Abb. 1F und G). Bemerkenswert ist die schützende Wirkung von BLG in einer Dosis von Die Wirkung von BLG bei einer Dosis von 1 g/kg war vergleichbar mit der von SASP bei einer Dosis von 200 mg/kg. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass BLG die Schwere der durch DSS induzierten chronisch rezidivierenden Colitis bei Mäusen wirksam reduziert.
TNF-α, IL-1β und IL-6 sind wichtige Entzündungsmarker bei Dickdarmentzündungen. Wie in Abbildung 2A dargestellt, führte DSS im Vergleich zur Kontrollgruppe zu einem signifikanten Anstieg der Genexpression von TNF-α, IL-1β und IL-6 im Dickdarm. Die Gabe von BLG konnte diese DSS-vermittelten Veränderungen signifikant reduzieren. Anschließend bestimmten wir mittels ELISA die Konzentrationen der Entzündungszytokine TNF-α, IL-1β und IL-6 im Dickdarmgewebe. Die Ergebnisse zeigten ebenfalls einen signifikanten Anstieg der TNF-α-, IL-1β- und IL-6-Konzentrationen im Dickdarm von mit DSS behandelten Mäusen, während die BLG-Behandlung diesen Anstieg abschwächte (Abbildung 2B).
Abbildung 2: BLG hemmt die Genexpression und Produktion der proinflammatorischen Zytokine TNF-α, IL-1β und IL-6 im Kolon von DSS-behandelten Mäusen. (A) Genexpression von TNF-α, IL-1β und IL-6 im Kolon; (B) Proteinspiegel von TNF-α, IL-1β und IL-6 im Kolon. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt (n = 4–6). #p < 0,05 oder ##p < 0,01 oder ###p < 0,001 vs. Kontrollgruppe (Con); *p < 0,05 oder **p < 0,01 vs. DSS-Gruppe.
Eine Dysbiose des Darmmikrobioms spielt eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Colitis ulcerosa.²⁴ Um zu untersuchen, ob BLG die Darmmikrobiota von DSS-behandelten Mäusen beeinflusst, wurde eine 16S-rRNA-Sequenzierung durchgeführt, um die bakterielle Gemeinschaft des Darminhalts zu analysieren. Das Venn-Diagramm zeigt, dass die drei Gruppen 385 OTUs gemeinsam haben. Gleichzeitig wies jede Gruppe einzigartige OTUs auf (Abb. 3A). Darüber hinaus zeigten der Chao1-Index und der Shannon-Index (Abb. 3B und C), dass die Diversität der Darmmikrobiota in BLG-behandelten Mäusen reduziert war, da der Shannon-Index in der BLG-Gruppe signifikant abnahm. Mithilfe der Hauptkomponentenanalyse (PCA) und der Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) wurden Cluster-Muster zwischen den drei Gruppen ermittelt. Die Ergebnisse zeigten, dass sich die Gemeinschaftsstruktur der DSS-behandelten Mäuse nach der BLG-Behandlung deutlich differenzierte (Abb. 3D und E). Diese Daten legen nahe, dass die BLG-Behandlung die Gemeinschaftsstruktur von Mäusen mit DSS-induzierter Colitis signifikant beeinflusst.
Abbildung 3: BLG verändert die Diversität der Darmmikrobiota in Mäusen mit DSS-induzierter Kolitis. (A) Venn-Diagramm der OTUs, (B) Chao1-Index, (C) Shannon-Reichtumsindex, (D) PCA-Score-Plot der OTUs, (E) PCoA-Score-Diagramm der OTUs. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) (n = 6) dargestellt. **p < 0,01 vs. DSS-Gruppe.
Um spezifische Veränderungen der fäkalen Mikrobiota zu untersuchen, analysierten wir die Zusammensetzung der Darmmikrobiota auf allen taxonomischen Ebenen. Wie in Abbildung 4A dargestellt, waren Firmicutes und Bacteroidetes die Hauptstämme in allen Gruppen, gefolgt von Verrucomicrobia. Die relative Häufigkeit von Firmicutes und das Verhältnis von Firmicutes zu Bacteroidetes waren in den fäkalen mikrobiellen Gemeinschaften von DSS-behandelten Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen signifikant erhöht. Diese Veränderungen wurden durch die BLG-Behandlung signifikant rückgängig gemacht. Insbesondere erhöhte die BLG-Behandlung die relative Häufigkeit von Verrucobacterium im Kot von Mäusen mit DSS-induzierter Kolitis signifikant. Auf Ebene der Darmmikrobiota waren die fäkalen mikrobiellen Gemeinschaften von Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae und Prevotellaceae besiedelt (Abb. 4B). Im Vergleich zur DSS-Gruppe erhöhte die Reduktion von BLG die Häufigkeit von Akkermansiaceae, verringerte jedoch die Häufigkeit von Lachnospiraceae und Ruminococcaceae. Auf Gattungsebene war die fäkale Mikrobiota insbesondere von Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia und Prevotellaceae_UCG-001 besiedelt (Abb. 4C). Dieser Befund belegt zudem, dass die BLG-Behandlung das durch die DSS-Belastung hervorgerufene Ungleichgewicht der Mikrobiota effektiv umkehrte. Dieses Ungleichgewicht war durch eine Abnahme von Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas und Oscillibacter sowie eine Zunahme von Akkermansia und Prevotellaceae_UCG-001 gekennzeichnet.
Abbildung 4: BLG verändert die Zusammensetzung der Darmmikrobiota in DSS-induzierten Colitis-Mäusen. (A) Zusammensetzung der Darmmikrobiota auf Phylum-Ebene; (B) Zusammensetzung der Darmmikrobiota auf Familienebene; (C) Zusammensetzung der Darmmikrobiota auf Gattungsebene. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) (n = 6) dargestellt. #p < 0,05 oder ###p < 0,001 vs. Kontrollgruppe (Con); *p < 0,05 oder **p < 0,01 oder ***p < 0,001 vs. DSS-Gruppe.
Da kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) die Hauptmetaboliten von Akkermansia und Prevotellaceae_UCG-001 sind und Acetat, Propionat und Butyrat die am häufigsten vorkommenden SCFAs im Darmlumen darstellen (25–27), befinden wir uns noch in der Phase unserer Studie. Wie in Abbildung 5 dargestellt, waren die Konzentrationen von Acetat, Propionat und Butyrat im Stuhl der mit DSS behandelten Gruppe signifikant reduziert, während die BLG-Behandlung diese Reduktion weitgehend unterdrücken konnte.
Abbildung 5. BLG erhöht die Konzentration kurzkettiger Fettsäuren (SCFAs) im Kot von Mäusen mit DSS-induzierter Kolitis. (A) Essigsäuregehalt im Kot; (B) Propionsäuregehalt im Kot; (C) Buttersäuregehalt im Kot. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) (n = 6) dargestellt. #p < 0,05 oder ##p < 0,01 vs. Kontrollgruppe (Con); *p < 0,05 oder **p < 0,01 vs. DSS-Gruppe.
Wir berechneten außerdem den Pearson-Korrelationskoeffizienten zwischen den differentiellen SCFA-Werten auf Gattungsebene und der fäkalen Mikrobiota. Wie in Abbildung 6 dargestellt, korrelierte Akkermansia positiv mit der Produktion von Propionsäure (Pearson = 0,4866) und Buttersäure (Pearson = 0,6192). Im Gegensatz dazu waren Enteromonas und Oscillobacter negativ mit der Acetatproduktion assoziiert (Pearson-Korrelationskoeffizienten: 0,4709 bzw. 0,5104). Ebenso korrelierte Ruminococcaceae_UCG-014 negativ mit der Produktion von Propionsäure (Pearson = 0,4508) und Buttersäure (Pearson = 0,5842).
Abbildung 6 Pearson-Korrelationsanalyse zwischen differenziellen SCFAs und Darmmikroben. (A) Enteromonas mit Essigsäure; (B) Concussion bacillus mit Essigsäure; (C) Akkermansia vs. Propionsäure; (D) Ruminococcus_UCG-014 mit Propionsäure; (E) Akkermansia mit Buttersäure; (F) Ruminococcus_UCG-014 mit Buttersäure.
Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) ist ein zelltypspezifisches posttranslationales Produkt von Proglucagon (Gcg) mit entzündungshemmenden Eigenschaften.²⁸ Wie in Abbildung 7 dargestellt, führte DSS zu einer signifikanten Abnahme der Gcg-mRNA-Expression. Die Behandlung des Kolons mit BLG konnte die DSS-induzierte Gcg-Reduktion im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant umkehren (Abb. 7A). Gleichzeitig war der GLP-1-Serumspiegel in der DSS-behandelten Gruppe signifikant reduziert, und die BLG-Behandlung konnte diese Reduktion weitgehend verhindern (Abb. 7B). Da kurzkettige Fettsäuren die GLP-1-Sekretion über die Aktivierung der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren 43 (GRP43) und 41 (GRP41) stimulieren können, untersuchten wir auch GRP41 und GRP43 im Kolon von Colitis-Mäusen. Dabei stellten wir fest, dass die mRNA-Expression von GRP43 und GRP41 im Kolon nach DSS-Gabe signifikant verringert war und die BLG-Behandlung diese Reduktion effektiv aufheben konnte. (Abbildung 7C und D).
Abbildung 7: BLG erhöht die Serum-GLP-1-Konzentration und die mRNA-Expression von Gcg, GPR41 und GRP43 im Kolon von DSS-behandelten Mäusen. (A) Gcg-mRNA-Expression im Kolongewebe; (B) GLP-1-Konzentration im Serum; (C) GPR41-mRNA-Expression im Kolongewebe; (D) GPR43-mRNA-Expression im Kolongewebe. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) (n = 5–6) dargestellt. #p < 0,05 oder ##p < 0,01 vs. Kontrollgruppe (Con); *p < 0,05 vs. DSS-Gruppe.
Da die BLG-Behandlung die Serum-GLP-1-Konzentration, die Gcg-mRNA-Expression im Kolon und die SCFA-Konzentration im Stuhl von DSS-behandelten Mäusen erhöhen konnte, untersuchten wir die Wirkung von Acetat, Propionat und Butyrat sowie von Kontrollmäusen (F-Con), DSS-Kolitis-Mäusen (F-Con-DSS) und BLG-behandelten Kolitis-Mäusen (F-BLG) auf die GLP-1-Freisetzung aus primären murinen Kolonepithelzellen. Wie in Abbildung 8A dargestellt, stimulierten primäre murine Kolonepithelzellen, die mit jeweils 2 mM Essigsäure, Propionsäure bzw. Buttersäure behandelt wurden, die GLP-1-Freisetzung signifikant, was mit früheren Studien übereinstimmt.^29,30 Ebenso stimulierten alle F-Con-, F-DSS- und F-BLG-Gruppen (entsprechend 0,25 g Stuhl) die GLP-1-Freisetzung aus primären murinen Kolonepithelzellen deutlich. Bemerkenswerterweise war die Menge an GLP-1, die von F-DSS-behandelten primären murinen Kolonepithelzellen freigesetzt wurde, … Die Anzahl der Zellen war deutlich geringer als die der mit F-Con und F-BLG behandelten primären Dickdarmepithelzellen der Maus (Abbildung 8B). Diese Daten legen nahe, dass die BLG-Behandlung die aus kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) stammende GLP-1-Produktion im Darm signifikant wiederherstellte.
Abbildung 8: BLG-abgeleitete kurzkettige Fettsäuren (SCFA) stimulieren die GLP-1-Freisetzung aus primären murinen Kolonepithelzellen. (A) Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure stimulierten die GLP-1-Freisetzung aus primären murinen Kolonepithelzellen; (B) Fäkalextrakte F-Con, F-DSS und F-BLG stimulierten primäre murine Kolonepithelzellen. Freigesetzte GLP-1-Menge: Aliquots von Kolonepithelzellen wurden in Petrischalen mit Glasboden gegeben und jeweils mit 2 mM Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure und den Fäkalextrakten F-Con, F-DSS und F-BLG (entsprechend 0,25 g Fäzes) behandelt. Die Zellen wurden jeweils 2 Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert. Die Freisetzung von GLP-1 aus primären murinen Kolonepithelzellen wurde mittels ELISA bestimmt. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) (n = 3) dargestellt. #p < 0,05 bzw. ##p < 0,01 vs. Kontrolle bzw. F-Con; *p < 0,05 vs. F-DSS.
Abkürzungen: Ace, Essigsäure; Pro, Propionsäure; however, Buttersäure; F-Con, Fäkalextrakt von Kontrollmäusen; F-DSS, Fäkalextrakt von Colitis-Mäusen; F-BLG, aus BLG-behandeltem Dickdarm Fäkalextrakte von entzündeten Mäusen.
Die von der Weltgesundheitsorganisation als schwer behandelbare Krankheit eingestufte Colitis ulcerosa entwickelt sich zu einer globalen Gefahr; Wirksame Methoden zur Vorhersage, Prävention und Behandlung der Erkrankung sind jedoch weiterhin begrenzt. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Erforschung und Entwicklung neuer, sicherer und wirksamer Therapiestrategien für Colitis ulcerosa (CU). Traditionelle chinesische Arzneimittel (TCM) stellen eine vielversprechende Option dar, da viele TCM-Präparate in der chinesischen Bevölkerung über Jahrhunderte hinweg bei der Behandlung von CU wirksam waren und es sich dabei aus biologischen organischen und natürlichen Materialien handelt, die größtenteils unschädlich für Mensch und Tier sind.^31,32 Ziel dieser Studie war es, ein sicheres und wirksames TCM-Präparat zur Behandlung von CU zu finden und dessen Wirkmechanismus zu erforschen. BLG ist eine bekannte chinesische Kräuterrezeptur zur Behandlung von Grippe.^8,33 Arbeiten in unserem und anderen Laboren haben gezeigt, dass Indigo, ein verarbeitetes TCM-Produkt aus demselben Rohmaterial wie BLG, eine signifikante Wirksamkeit bei der Behandlung von CU bei Mensch und Tier aufweist.^4,34 Die antikolitis-Wirkung von BLG und ihr Wirkmechanismus sind jedoch unklar. In der vorliegenden Studie zeigen unsere Ergebnisse, dass BLG die DSS-induzierte Dickdarmentzündung wirksam abschwächt, was mit … zusammenhängt. Modulation der Darmmikrobiota und Wiederherstellung der aus dem Darm stammenden GLP-1-Produktion.
Es ist bekannt, dass Colitis ulcerosa durch rezidivierende Phasen mit typischen klinischen Merkmalen wie Gewichtsverlust, Diarrhö, rektalen Blutungen und ausgedehnten Schädigungen der Dickdarmschleimhaut gekennzeichnet ist.³⁵ Daher wurde eine chronisch rezidivierende Colitis durch die Gabe von drei Zyklen 1,8%iger DSS über fünf Tage, gefolgt von sieben Tagen Trinkwasser, induziert. Wie in Abbildung 1B dargestellt, deuteten schwankender Gewichtsverlust und DAI-Werte auf eine erfolgreiche Induktion der chronisch rezidivierenden Colitis hin. Mäuse der mit BLG behandelten Gruppe zeigten ab Tag 8 eine beschleunigte Erholung, die sich signifikant von Tag 24 unterschied. Dieselben Veränderungen wurden auch im DAI-Wert beobachtet, was auf eine Verbesserung des klinischen Zustands der Colitis hindeutet. Hinsichtlich Dickdarmschädigung und Entzündungsstatus verbesserten sich Dickdarmlänge, Dickdarmgewebeschädigung sowie Genexpression und Produktion der proinflammatorischen Zytokine TNF-α, IL-1β und IL-6 im Dickdarmgewebe nach der BLG-Behandlung ebenfalls deutlich. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse eindeutig, dass BLG bei der Behandlung der chronischen Colitis ulcerosa wirksam ist. rezidivierende Colitis bei Mäusen.
Wie entfaltet BLG seine pharmakologischen Wirkungen? Zahlreiche frühere Studien haben gezeigt, dass die Darmmikrobiota eine Schlüsselrolle in der Pathogenese der Colitis ulcerosa spielt, und mikrobiombasierte sowie mikrobiomgerichtete Therapien haben sich als vielversprechende Behandlungsstrategie für Colitis ulcerosa etabliert. In der vorliegenden Studie konnten wir zeigen, dass die Behandlung mit BLG zu signifikanten Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota führte. Dies deutet darauf hin, dass die Schutzwirkung von BLG gegen DSS-induzierte Kolitis mit der Modulation der Darmmikrobiota zusammenhängt. Diese Beobachtung steht im Einklang mit der Annahme, dass die Reprogrammierung der Homöostase der Darmmikrobiota ein wichtiger Ansatz zum Verständnis der Wirksamkeit von TCM-Präparaten ist.^36,37 Akkermansia ist ein gramnegatives und strikt anaerobes Bakterium, das in der Schleimschicht des Darms lebt, Muzine abbaut, Propionsäure produziert, die Differenzierung von Becherzellen stimuliert und die Schleimhaut erhält. Funktion der Barriereintegrität.26 Zahlreiche klinische und tierexperimentelle Daten deuten darauf hin, dass Akkermansia stark mit einer gesunden Schleimhaut assoziiert ist,38 und die orale Verabreichung von Akkermansia spp. kann die Schleimhautentzündung deutlich verbessern.³⁹ Unsere aktuellen Daten deuten darauf hin, dass die relative Häufigkeit von Akkermansia nach BLG-Behandlung signifikant erhöht ist. Darüber hinaus ist Prevotellaceae_UCG-001 ein SCFA-produzierendes Bakterium.²⁷ Mehrere Studien zeigten, dass Prevotellaceae_UCG-001 in geringer relativer Häufigkeit im Kot von Tieren mit Colitis gefunden wurde.^40,41 Unsere aktuellen Daten zeigen auch, dass die BLG-Behandlung die relative Häufigkeit von Prevotellaceae_UCG-001 im Kolon von DSS-behandelten Mäusen signifikant erhöhen kann. Im Gegensatz dazu ist Oscillibacter ein mesophiles, strikt anaerobes Bakterium.⁴² Es wurde berichtet, dass die relative Häufigkeit von Oscillibacter in UC-Mäusen signifikant erhöht war und signifikant positiv mit den IL-6- und IL-1β-Spiegeln sowie den pathologischen Scores korrelierte.^43,44 Bemerkenswerterweise reduzierte die BLG-Behandlung die relative Häufigkeit von Oscillibacter im Kot von DSS-behandelten Mäusen signifikant. BLG-veränderte Bakterien produzierten am meisten kurzkettige Fettsäuren (SCFA). Zahlreiche frühere Studien haben die potenziell positiven Effekte von SCFA auf Dickdarmentzündungen und den Schutz der Integrität des Darmepithels gezeigt.^45,46 Unsere aktuellen Daten zeigen ebenfalls, dass die Konzentrationen von SCFA-Acetat, -Propionat und -Butyrat im Kot von DSS-behandelten Mäusen, die mit BLG behandelt wurden, deutlich erhöht waren. Zusammengenommen belegen diese Ergebnisse eindeutig, dass die BLG-Behandlung die Anzahl der DSS-induzierten SCFA-produzierenden Bakterien in Mäusen mit chronisch-rezidivierender Colitis effektiv erhöhen kann.
GLP-1 ist ein Inkretin, das hauptsächlich im Ileum und Kolon produziert wird und eine wichtige Rolle bei der Verzögerung der Magenentleerung und der Senkung des postprandialen Blutzuckerspiegels spielt.⁴⁷ Es gibt Hinweise darauf, dass Dipeptidylpeptidase (DPP)-4, ein GLP-1-Rezeptoragonist, und eine GLP-1-Nanomedizin die intestinale Entzündung bei Mäusen wirksam lindern können.^48–51 Wie in früheren Studien berichtet, korrelierten hohe SCFA-Konzentrationen mit erhöhten Plasma-GLP-1-Spiegeln bei Menschen und Mäusen.⁵² Unsere aktuellen Daten zeigen, dass nach BLG-Behandlung die Serum-GLP-1-Spiegel und die Gcg-mRNA-Expression signifikant erhöht waren. Ebenso war die GLP-1-Sekretion in Kolonkulturen nach Stimulation mit Fäkalextrakten von BLG-behandelten Colitis-Mäusen im Vergleich zur Stimulation mit Fäkalextrakten von DSS-behandelten Colitis-Mäusen signifikant erhöht. Wie beeinflussen SCFAs die Freisetzung von GLP-1? Gwen Tolhurst et al. Es wurde berichtet, dass kurzkettige Fettsäuren (SCFA) die GLP-1-Sekretion über GRP43 und GPR41 stimulieren können.²⁹ Unsere aktuellen Daten zeigen ebenfalls, dass die Behandlung mit BLG die mRNA-Expression von GRP43 und GPR41 im Kolon von DSS-behandelten Mäusen signifikant erhöht. Diese Daten legen nahe, dass die Behandlung mit BLG die durch SCFA geförderte GLP-1-Produktion durch Aktivierung von GRP43 und GPR41 wiederherstellen kann.
BLG ist in China ein Langzeit-Rezeptarzneimittel. Die maximal tolerierte Dosis von BLG bei Kunming-Mäusen beträgt 80 g/kg, und es wurde keine akute Toxizität beobachtet.⁵³ Die derzeit empfohlene Dosis von BLG (ohne Zucker) für Menschen liegt bei 9–15 g/Tag (3-mal täglich). Unsere Studie zeigte, dass BLG in einer Dosis von 1 g/kg die DSS-induzierte chronisch-rezidivierende Colitis bei Mäusen linderte. Diese Dosis entspricht in etwa der klinisch verwendeten BLG-Dosis. Unsere Studie ergab außerdem, dass der Wirkmechanismus zumindest teilweise durch Veränderungen der Darmmikrobiota, insbesondere von SCFA-produzierenden Bakterien wie Akkermansia und Prevotellaceae_UCG-001, vermittelt wird, um die GLP-1-Produktion im Darm wiederherzustellen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass BLG als potenzielles Therapeutikum zur Behandlung von Colitis weiter untersucht werden sollte. Der genaue Mechanismus, durch den es die Darmmikrobiota moduliert, muss jedoch noch durch Untersuchungen an mikrobiota-defizienten Mäusen und fäkalen Bakterientransplantationen bestätigt werden.
Ace, Essigsäure; But, Buttersäure; BLG, Pandan; DSS, Dextransulfat-Natrium; DAI, Krankheitsaktivitätsindex; DPP, Dipeptidylpeptidase; FID, Flammenionisationsdetektor; F-Con, Kontroll-Fäkalextrakte von Mäusen; F-DSS, Fäkalextrakte von DSS-Kolitis-Mäusen; F-BLG, Fäkalextrakte von BLG-behandelten Kolitis-Mäusen; GLP-1, Glucagon-ähnliches Peptid-1; Gcg, Glucagon; Gaschromatographie, Gaschromatographie; GRP43, G-Protein-gekoppelter Rezeptor 43; GRP41, G-Protein-gekoppelter Rezeptor 41; H&E, Hämatoxylin-Eosin; HBSS, Hanks' Balanced Salt Solution; OTC, rezeptfreies Tetracyclin; PCA, Hauptkomponentenanalyse; PCoA, Hauptkoordinatenanalyse; Pro, Propionsäure; SASP, Sulfasalazin; SCFA, kurzkettige Fettsäuren; Traditionelle Chinesische Medizin UC, Colitis ulcerosa.
Alle Versuchsprotokolle wurden von der Tierethikkommission des Peking University Shenzhen-Hong Kong University of Science and Technology Medical Center (Shenzhen, China) gemäß den institutionellen Richtlinien und Tierschutzbestimmungen genehmigt (Ethiknummer A2020157).
Alle Autoren haben maßgeblich zur Konzeption und Gestaltung, zur Datenerhebung oder zur Datenanalyse und -interpretation beigetragen; sie haben an der Erstellung des Artikels mitgewirkt oder wichtige inhaltliche Aspekte kritisch überarbeitet; sie haben der Einreichung des Manuskripts bei der Zeitschrift zugestimmt; sie haben schließlich die zur Veröffentlichung freigegebene Version genehmigt; sie sind für alle Aspekte der Arbeit verantwortlich.
Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (81560676 und 81660479), dem First-Class-Projekt der Universität Shenzhen (86000000210), dem Shenzhen Science and Technology Innovation Committee Fund (JCYJ20210324093810026), dem Guangdong Provincial Medical Science and Technology Research Fund (A2020157 und A2020272), dem Guizhou Medical University Pharmacy Guizhou Province Funded by Key Laboratory (YWZJ2020-01) und dem Peking University Shenzhen Hospital (JCYJ2018009).
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