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Im Gegensatz zu Wirbeltieren geht man allgemein davon aus, dass Insekten keine männlichen Sexualhormone besitzen. Bei Anopheles gambiae scheint sich das Ecdyson-Steroid 20-Hydroxyecdyson (20E) so entwickelt zu haben, dass es die Eientwicklung steuert, wenn es von Weibchen synthetisiert wird², und eine Paarungsrefraktärperiode auslöst, wenn es sexuell von Männchen übertragen wird³. Da Eientwicklung und Paarung essenzielle Fortpflanzungsmerkmale sind, könnte das Verständnis, wie weibliche Anopheles-Mücken diese Hormonsignale integrieren, die Entwicklung neuer Malariabekämpfungsprogramme erleichtern. Wir zeigen hier, dass diese Fortpflanzungsfunktionen durch verschiedene Sexualhormone über ein komplexes Netzwerk von Ecdysteroid-aktivierenden/inaktivierenden Enzymen reguliert werden. Wir identifizierten ein männchenspezifisches oxidiertes Ecdyson, 3-Dehydro-20E (3D20E), das die Elternschaft schützt, indem es die sexuelle Empfänglichkeit der Weibchen nach der sexuellen Übertragung unterdrückt und durch Dephosphorylierung aktiviert wird. Bemerkenswerterweise führt die Übertragung von 3D20E auch zu einer verminderten sexuellen Empfänglichkeit der Weibchen. Es induziert die Expression von Reproduktionsgenen, die die Eientwicklung während einer Plasmodium-Infektion aufrechterhalten und so die Gesundheit infizierter Weibchen sichern. Das von Weibchen produzierte 20E löst keine sexuelle Reaktion aus, ermöglicht es aber paarungsbereiten Individuen, Eier zu legen, nachdem 20E-hemmende Kinasen inhibiert wurden. Die Identifizierung dieses männchenspezifischen Insektensteroidhormons und seine Rolle bei der Regulierung der sexuellen Empfänglichkeit, Fruchtbarkeit und Interaktion von Weibchen mit Plasmodium deuten auf das Potenzial hin, den Fortpflanzungserfolg malariaübertragender Mücken zu reduzieren.
Malariafälle und -todesfälle nehmen aufgrund der weit verbreiteten Insektizidresistenz bei Anopheles-Mücken, dem einzigen Überträger der Malariaerreger beim Menschen, wieder zu⁴. Die Paarungsbiologie dieser Mücken stellt ein besonders attraktives Ziel für neuartige Maßnahmen zur Malariabekämpfung dar, da sich die Weibchen nur einmal paaren⁵; die Sterilisierung dieses einzelnen Paarungsereignisses hätte ein großes Potenzial zur Reduzierung der Mückenpopulationen in der Natur.
Frauen werden sexuell unfruchtbar, nachdem sie von Männern hohe Konzentrationen an Steroidhormonen erhalten haben. Studien haben gezeigt, dass der Auslöser für Schwierigkeiten bei der weiteren Paarung 20-Hydroxyecdyson (20E) ist, ein Steroidhormon, das vor allem als Regulator des Häutungszyklus im Larvenstadium bekannt ist. Die Fähigkeit der Männchen, 20E zu synthetisieren und zu übertragen, hat sich speziell bei Anopheles-Arten der Untergattung Cellia entwickelt, die in Afrika verbreitet ist und die gefährlichsten Malariaüberträger, darunter Anopheles gambiae, umfasst. Dies ist besonders bemerkenswert, da bei diesen Arten auch die Weibchen nach jeder Blutmahlzeit 20E produzieren und 20E den Oogenesezyklus steuert (siehe Ref. 8). Es ist jedoch wenig darüber bekannt, wie Weibchen Signale aus zwei verschiedenen Ecdysonquellen (Übertragung durch Männchen und Auslösung der Blutmahlzeit) integrieren, ohne ihre eigene Paarungsfähigkeit zu beeinträchtigen. Wenn das von den Weibchen produzierte 20E tatsächlich sexuelle Intoleranz auslöst, wird dies führt bei Jungfernstichen zur Unfruchtbarkeit, ein bei diesen Mücken sehr häufiges Verhalten⁵.
Eine mögliche Erklärung ist, dass A. gambiae-Männchen ein modifiziertes, männchenspezifisches Ecdyson übertragen, welches eine Signalkaskade im weiblichen Fortpflanzungstrakt aktiviert und so zu Paarungsinstabilität führt. Obwohl Wirbeltiere über mehrere Steroidhormone wie Östrogen und Androgen verfügen (siehe Übersicht in Ref. 9), sind uns androgene Steroide bei Insekten bisher nicht bekannt.
Wir untersuchten das Steroidhormonspektrum in den männlichen akzessorischen Geschlechtsdrüsen (MAG) geschlechtsreifer A. gambiae, um mögliche modifizierende Steroide zu identifizieren. Mithilfe der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MS/MS) anstelle der zuvor verwendeten, weniger spezifischen Methode wiesen wir Ecdyson (E) und 20E in diesem Gewebe nach und bestätigten damit frühere Ergebnisse. Die Probe wurde jedoch von oxidierten phosphorylierten Steroiden dominiert, die der Formel 3-Dehydro-20E-22-phosphat (3D20E22P)¹² (Abbildung 1) entsprechen. Weitere Formen sind 3-Dehydro-20E (3D20E) und 20E-22-phosphat (20E22P). Die HPLC-MS/MS-Signalintensität von 3D20E22P war zwei Größenordnungen höher als die seiner dephosphorylierten Form 3D20E und drei Größenordnungen höher als die seiner phosphorylierten Form 20E. als E und 20E (Abbildung 1). Obwohl sie auch in anderen Körperteilen und im unteren Fortpflanzungstrakt (LRT; Abb. 1a im Anhang) vorkommen, analysierten wir Ecdysteroide auch in frisch geschlüpften (<1 Tag alten) Männchen und Weibchen und wiesen 3D20E und 3D20E22P ausschließlich in den MAG nach; E, 20E und 20E22P waren in beiden Geschlechtern vorhanden (Abb. 1b im Anhang). Diese Daten legen nahe, dass adulte Männchen von A. gambiae hohe Konzentrationen modifizierender Hormone in ihren MAG produzieren, die von Weibchen nicht synthetisiert werden.
MAG und weibliche LRT (einschließlich Vorhöfe, Samenbläschen und Parovarium) wurden von 4 Tage alten, unbegatteten Männchen sowie von unbegatteten und begatteten Weibchen (0,5, 3 und 12 Stunden nach der Befruchtung) präpariert. Ecdyson in diesen Geweben wurde mittels HPLC-MS/MS analysiert (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts; ungepaarter t-Test, zweiseitig, FDR-korrigiert; NS, nicht signifikant; *P < 0,05, **P < 0,01). 3D20E: 3 Stunden vs. 0,5 Stunden, P = 0,035; 12 Stunden vs. 3 Stunden, P = 0,0015; 12 Stunden vs. 0,5 Stunden, P = 0,030. 3D20E22P: 3 Stunden vs. 0,5 Stunden, P = 0,25; 12 Stunden vs. 3 Stunden, P = 0,0032; 12 Stunden vs. 0,5 Stunden, P = 0,015). Die Daten stammen aus drei biologischen Replikaten. Die Peakfläche für jedes untersuchte Ecdyson wurde berechnet und auf die Anzahl der Mücken normiert. Ecdyson ist farblich wie folgt dargestellt: E, grün; 20E, orange; 20E22P, violett; 3D20E, blau; 3D20E22P, pink. Die vergrößerte Skala der y-Achse zeigt niedrigere Ecdyson-Werte.
Um zu untersuchen, ob 3D20E22P und 3D20E während der Paarung übertragen werden, sezierten wir weibliche LRTs zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Paarung. Obwohl bei Jungfern kein Ecdyson nachweisbar war, beobachteten wir unmittelbar nach der Paarung (0,5 h post coupleing, hpm) erhebliche Mengen an 3D20E22P in den LRTs, deren Konzentration mit der Zeit abnahm, während die 3D20E-Konzentration signifikant anstieg (Abb. 1). Mithilfe von chemisch synthetisiertem 3D20E als Standard stellten wir fest, dass die Konzentration dieses Steroidhormons in den LRTs während der Paarung mindestens 100-mal höher war als die von 20E (Ergänzende Datentabelle 1). Demnach ist 3D20E22P das wichtigste männliche Ecdyson, das während der Paarung in die weiblichen LRTs übertragen wird, und seine dephosphorylierte Form, 3D20E, ist kurz nach der Paarung in hoher Konzentration vorhanden. Dies deutet auf eine wichtige Rolle des letztgenannten Ecdysons in der weiblichen Biologie nach der Paarung hin.
Nach der Erstellung eines neuen RNA-Sequenzierungsdatensatzes (RNA-seq) (Abb. 2a) mithilfe einer eigens entwickelten Bioinformatik-Pipeline suchten wir nach Ecdyson-Kinase (EcK), Ecdyson-Oxidase (EO) und dem Gen für die Ecdyson-20E-modifizierte Phosphatase (EPP). EPP wird in reproduktiven Geweben exprimiert. Wir identifizierten ein Kandidatengen für EPP und zwei potenzielle EcK-Gene (EcK1 und EcK2), konnten jedoch kein geeignetes Kandidatengen für EO finden. Bemerkenswerterweise wurden einzelne EPP-Gene in gambischen MAGs in hohen Konzentrationen (98,9. Perzentil) exprimiert, nicht aber in weiblichen LRTs (Abb. 2b), entgegen unseren Erwartungen, da in diesem weiblichen Gewebe eine Dephosphorylierung von 3D20E22P stattfindet. Daher vermuten wir, dass männliches EPP während der Paarung übertragen wird. Tatsächlich verwendeten wir in vivo eine stabile Isotopenmarkierung, um das weibliche Protein nach der Paarung zu maskieren. Identifiziert durch MS im weiblichen Atrium (Abb. 2c und Ergänzungstabelle 1). Das Vorhandensein von EPP in MAG und begatteten (aber nicht jungfräulichen) weiblichen LRT wurde auch mit spezifischen Antikörpern bestätigt (Abb. 2d).
a) Eine eigens entwickelte Bioinformatik-Pipeline durchsuchte die reproduktiven Gewebe beider Geschlechter nach Genen, die für EcKs, EOs und EPPs kodieren. Die Zahlen neben den Pfeilen geben die Anzahl der männlichen und weiblichen Kandidaten in jedem Schritt an. Diese Analyse identifizierte ein EPP-Gen (EPP) und ein EcK-Gen (EcK1), die in Männchen exprimiert werden, sowie ein EcK-Gen (EcK2), das in beiden Geschlechtern exprimiert wird, aber kein Kandidatengen für EO liefert. b) Heatmap zum Vergleich der Kandidatengenexpression in Geweben von unbegatteten (V) und sich paarenden (M) Anopheles gambiae und Anopheles albicans. Spca, Befruchtung; MAGs, akzessorische Drüsen bei Männchen. Andere Körperteile, einschließlich Brüste, Flügel, Beine, Fettkörper und innere Organe beider Geschlechter sowie Eierstöcke bei Weibchen. EcK2 wird sowohl im MAG als auch in den Vorhöfen von Gambia stark exprimiert, während EPP nur im MAG vorkommt. c) Proteomanalyse der Translokation der männlichen Ejakulatgruppe in die weiblichen Vorhöfe 3, 12 und 24 Stunden nach der Befruchtung (hpm), die die 67 häufigsten Proteine ​​zeigt. Weibchen wurden mit einer 15N-haltigen Diät aufgezogen, um alle Proteine ​​zu markieren (und zu maskieren). Nicht markierte Männchen wurden mit markierten Weibchen verpaart, und die LRTs der Weibchen wurden 3, 12 und 24 hpm für die proteomische Analyse präpariert (siehe Ergänzungstabelle 1 für eine vollständige Liste der Ejakulatproteine). Einsatz: EPP, Eck1 und EcK2 wurden im MAG von Jungfernmännchen durch proteomische Analyse dieser Gewebe nachgewiesen. d) EPP wurde mittels Western Blot im MAG und LRT von verpaarten Weibchen nachgewiesen, aber Nicht in jungfräulichen Weibchen oder Männchen oder im übrigen weiblichen Körper. Die Membranen wurden gleichzeitig mit Anti-Aktin- (Ladekontrolle) und Anti-EPP-Antikörpern untersucht. Alle Männchen sind jungfräulich. Die Geldaten sind in Abbildung S1 (Zusatzmaterial) dargestellt. Western Blots wurden zweimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.
Die Ecdysteroid-Phosphophosphatase-Aktivität von EPP wurde nach Inkubation mittels HPLC-MS/MS mit aus MAG isoliertem 3D20E22P verifiziert (Ergänzende Abbildung 2a). Des Weiteren beobachteten wir nach der Silenzierung von EPP durch RNA-Interferenz (RNAi) eine starke Reduktion der Phosphatase-Aktivität im Fortpflanzungsgewebe dieser Männchen (Abb. 3a). Weibchen, die sich mit EPP-silenzierten Männchen verpaart hatten, wiesen trotz partieller Genstilllegung einen signifikant geringeren Anteil an dephosphoryliertem 3D20E auf (Abb. 3b) (Ergänzende Abbildung 2b,c). Im Gegensatz dazu konnten wir in denselben Mücken keine signifikanten Veränderungen im Verhältnis von 20E22P zu 20E feststellen, was darauf hindeuten könnte, dass das Enzym spezifisch für 3D20E22P ist (Abb. 3b).
a) Verminderte Phosphataseaktivität in MAG durch EPP-Silencing mittels doppelsträngiger EPP-RNA (dsEPP) oder doppelsträngiger GFP-RNA (dsGFP) als Kontrollen. Zwanzig MAG-Pools wurden pro Replikation verwendet (P = 0,0046, gepaarter t-Test, zweiseitig), dargestellt durch separate Punkte. b) Weibchen, die sich mit EPP-silenced Männchen verpaart haben, wiesen 3 Stunden nach der Paarung einen signifikant geringeren Anteil an dephosphoryliertem 3D20E auf (P = 0,0043, ungepaarter t-Test, zweiseitig), während die 20E-Werte unbeeinflusst blieben (P = 0,063, ungepaart). t-Test, zweiseitig). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts aus drei Gruppen mit jeweils 13, 16 und 19 Weibchen dargestellt.c, Weibchen, die sich mit EPP-silenced Männchen paarten, wiesen signifikant höhere Raten an erneuter Paarung auf (P = 0,0002, Fisher-Exakt-Test, zweiseitig). Die Weibchen wurden zunächst zur Paarung gezwungen, um ihren Paarungsstatus sicherzustellen; Zwei Tage später wurden sie mit anderen Männchen, die transgene Spermien trugen, in Kontakt gebracht, um die Wiederpaarungsrate mittels quantitativer PCR-Detektion des Transgens zu bestimmen. Blutgesaugte Weibchen, die sich mit EPP-silenced Männchen paarten, zeigten eine signifikant reduzierte Fruchtbarkeit (P < 0,0001; Mann-Whitney-Test, zweiseitig) und eine leicht reduzierte Eizahl (P = 0,088; Mann-Whitney-Test, zweiseitig), während die Laichrate nicht beeinflusst wurde (P = 0,94; Fisher-Exakt-Test, zweiseitig). In allen Abbildungen steht n für die Anzahl biologisch unabhängiger Mückenproben. NS: nicht signifikant. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Anschließend untersuchten wir, ob die Dephosphorylierung von Ecdyson für die Induktion von Paarungsresistenz bei Weibchen von Bedeutung ist. Weibchen, die sich mit EPP-depletierten Männchen gepaart hatten, paarten sich deutlich häufiger (44,9 %) erneut als Kontrollweibchen (10,4 %), wenn sie weiteren (transgenen) Männchen ausgesetzt wurden (Abb. 3c). Wir beobachteten außerdem eine signifikante Abnahme der Fruchtbarkeit (Abb. 3d, links) und eine leichte Abnahme der Anzahl der von diesen Weibchen gelegten Eier (Abb. 3d, Mitte), während der Anteil der von den Weibchen gelegten Eier (eine weitere durch die Paarung ausgelöste Reaktion) unbeeinflusst blieb (Abb. 3d, rechts). Angesichts der beobachteten Spezifität von EPP für 3D20E22P legen diese Ergebnisse nahe, dass die Aktivierung von 3D20E durch während der Paarung übertragenes EPP eine wichtige Rolle bei der Abschaltung der Empfänglichkeit der Weibchen für weitere Paarungen spielen könnte – ein Verhalten, das zuvor der sexuellen Übertragung von 20E zugeschrieben wurde. Daher ist dieses männchenspezifische Hormon möglicherweise ein wichtiger Faktor für die Aktivierung von 3D20E. hat auch einen starken Einfluss auf die weibliche Fruchtbarkeit.
Als Nächstes verglichen wir die Aktivitäten von 20E und 3D20E in Injektionsexperimenten an geschlechtsreifen Jungfern unter Verwendung von chemisch synthetisiertem 3D20E (Abb. 4a–c) und kommerziell erhältlichem 20E. Wir beobachteten, dass 3D20E bei beiden Konzentrationen deutlich wirksamer als 20E war, die Empfänglichkeit der Weibchen für die Paarung zu unterdrücken (Abb. 4d). Bemerkenswerterweise induzierte die Hälfte des physiologischen Spiegels von 3D20E im LRT (1.066 pg nach der Injektion vs. 2.022 pg nach der Paarung) einen Anteil refraktärer Weibchen, der 20-mal höher war als der physiologische Spiegel von 20E (361 pg nach der Injektion) 24 Stunden nach der Injektion der höchsten Konzentration von 18 pg nach der Paarung; (Ergänzende Datentabelle 1). Dieses Ergebnis stützt die Annahme, dass die sexuelle Übertragung von 20E keine Paarungsrefraktärperioden verursacht, und deutet zudem darauf hin, dass 3D20E ein wichtiger Faktor für die Aufrechterhaltung der Eltern-Kind-Beziehung ist. 3D20E war in Eiablageversuchen mit unbegatteten Weibchen auch signifikant aktiver als 20E (Abb. 4e), was darauf schließen lässt, dass die normale Eiablagerate, die wir nach partieller EPP-Stilllegung beobachteten, auf die Restaktivität von 3D20E zurückzuführen ist, die weiterhin durch paarungsinduzierte weibliche Faktoren hervorgerufen wird.
(a, b) 3D20E wurde chemisch aus 20E (a) mit sehr hoher Ausbeute synthetisiert (Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts aus drei unabhängigen Synthesereaktionen dargestellt) (b). c) Das Massenspektrum (untere Hälfte) stimmt exakt mit dem in den LRT begatteter Weibchen gefundenen Ecdyson überein (obere Hälfte). d) Im Vergleich zu 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisher-Exakt-Test, zweiseitig) und 10%igem Ethanol (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisher-Exakt-Test, zweiseitig) war 20E nur bei höheren Dosen signifikant höher als die Kontrollgruppe (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,0001; Fisher-Exakt-Test, zweiseitig). 0,54; Fisher-Exakt-Test, zweiseitig). Die Injektion von 3D20E führte bei jungfräulichen Weibchen zu signifikant höheren Laichraten als die 10%ige Ethanol-Kontrolle (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Fisher-Exakt-Test, zweiseitig), während 20E im Vergleich zur Kontrolle nur bei höheren Dosen signifikant höhere Laichraten induzierte (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Fisher-Exakt-Test, zweiseitig). 3D20E induzierte bei höheren Dosen signifikant höhere Laichraten als 20E (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Fisher-Exakt-Test, zweiseitig). In allen Abbildungen steht n für die Anzahl biologisch unabhängiger Mücken. samples.NS, nicht signifikant.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Die Daten stammen aus drei Replikaten.
In früheren Studien konnten wir zeigen, dass die sexuelle Übertragung von Steroidhormonen die Expression von MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) induziert, einem weiblichen Reproduktionsgen, das A. gambiae-Weibchen vor einer Infektion mit P. falciparum, dem tödlichsten menschlichen Malariaerreger, schützt. Angesichts der Bedeutung von MISO für die reproduktive Fitness von Anopheles in Malaria-Endemiegebieten untersuchten wir, welches der Hormone – 3D20E oder 20E – die Expression dieses Gens auslöst. Wir fanden heraus, dass die Injektion von 20E zwar spezifisch oder stärker einige nukleäre Hormonrezeptoren (HR) wie HR3 und HR4 sowie typische nachgeschaltete Steroidziele wie die dotterbildenden Gene Vg14, 15 und 16 induzierte, MISO jedoch durch 3D20E stärker induziert wurde (Ergänzende Abbildung 3). Die sexuelle Übertragung dieses androgenen Steroidhormons scheint demnach Mechanismen auszulösen, die … diese schützen Weibchen vor den Kosten einer parasitären Infektion. Darüber hinaus beeinflusst 3D20E beide Isoformen des Östrogenrezeptors EcR unterschiedlich, indem es EcR-A induziert und EcR-B reprimiert. Zudem aktiviert es verstärkt andere Paarungs-induzierende Gene, darunter HPX15, welches die weibliche Fruchtbarkeit beeinflusst. Dies könnte die signifikante Unfruchtbarkeit von Weibchen erklären, die mit EPP-silenced Männchen verpaart wurden (Ergänzende Abbildung 3). Diese Daten deuten auf die Existenz von nachgeschalteten Signalwegen hin, die bevorzugt durch zwei Ecdysonhormone aktiviert werden und möglicherweise geschlechtsspezifische Funktionen vermitteln.
Anschließend untersuchten wir die Funktion der beiden in unserer Bioinformatik-Pipeline identifizierten EcK-Gene. Die Inaktivierung von EcK1 oder EcK2 führte zu einer signifikanten Mortalität bei Männchen (Ergänzende Abbildung 4a), was darauf hindeutet, dass die Phosphorylierung und damit die Inaktivierung von Ecdyson für das Überleben wichtig ist. Da EcK2 stärker exprimiert wurde als EcK1 und in MAGs mittels Proteomik nachgewiesen werden konnte (Abb. 2b,c und Ergänzende Tabelle 2), validierten wir seine Ecdysteroid-Kinase-Aktivität durch Inkubation mit 20E, was zur Phosphorylierung von 20E22P führte (Ergänzende Abbildung 2b). Bei Verwendung von 3D20E als Substrat konnten wir das phosphorylierte Produkt 3D20E22P nicht nachweisen (Ergänzende Abbildung 4c), was darauf hindeutet, dass 20E und nicht 3D20E das bevorzugte Zielprotein von EcK2 sein könnte.
Laut unserer RNA-Seq-Analyse war EcK2 auch im LRT jungfräulicher Weibchen stark exprimiert, wo es nach der Paarung abgeschaltet wurde (Abb. 2b). Wir bestätigten diese Daten und stellten fest, dass die EcK2-Expression durch die Blutmahlzeit nicht beeinflusst wurde (Ergänzende Abbildung 5a). In Erweiterung unserer anfänglichen MS-Experimente stellten wir fest, dass der Peak von 20E22P eng mit dem Peak von 20E korrelierte (22–26 Stunden nach der Blutmahlzeit; Ergänzende Abbildung 5b). Die Hemmung von EcK2 in jungfräulichen Weibchen führte zu einer Verdreifachung des relativen Verhältnisses von 20E zu 20E22P 26 Stunden nach der Blutmahlzeit (Ergänzende Abbildungen 2c und 5c), was bestätigt, dass EcK2 auch 20E in Weibchen phosphoryliert. Bemerkenswerterweise behielten EcK2-depletierte Jungfern ihre volle sexuelle Empfänglichkeit bei (Ergänzende Abbildung 5d,e), was weiter darauf hindeutet, dass die weibliche Produktion von 20E induziert keine Paarungsrefraktärzeit. Allerdings wiesen diese Weibchen im Vergleich zu den Kontrolltieren signifikant erhöhte Eiproduktionsraten auf, wobei über 30 % der Jungfern Eier legten (Ergänzende Abbildung 5f). Wurde doppelsträngige Eck2-RNA (dsEcK2) nach der Blutmahlzeit injiziert, erfolgte kein Laichen, da der durch die Blutaufnahme bedingte 20E-Peak zu diesem Zeitpunkt bereits abgeklungen war. Insgesamt stützen diese Ergebnisse ein Modell, demzufolge nach der Blutmahlzeit produziertes 20E das Laichen auslösen kann, jedoch nur, wenn die Laichblockade (EcK2 und möglicherweise weitere Faktoren) durch die Paarung aufgehoben wird. Weder 20E- noch 3D20E-Injektionen hemmten die EcK2-Expression in Jungfern (Ergänzende Abbildung 5g), was darauf hindeutet, dass andere Faktoren die Hemmung dieser Kinase vermitteln. Die 20E-Konzentrationen nach der Blutmahlzeit reichten jedoch nicht aus, um Paarungsunbehagen auszulösen, wurden aber durch hohe Titer sexuell aktiver Proteine ​​effektiv ausgelöst. übertragen 3D20E.
Unsere Ergebnisse liefern wichtige Einblicke in die Mechanismen, die den Fortpflanzungserfolg von A. gambiae regulieren. Es hat sich ein Modell herausgebildet, in dem Männchen hohe Konzentrationen von 3D20E synthetisieren, einem männchenspezifischen, modifizierten Ecdyson, das die Vaterschaft sichert, indem es Weibchen gegenüber weiterer Paarung desensibilisiert. Gleichzeitig haben diese Malariavektoren auch ein effizientes System entwickelt, um 3D20E in Weibchen als Reaktion auf die sexuelle Übertragung des männchenspezifischen EPP zu aktivieren. Unseres Wissens ist dies das erste Beispiel eines männlich- und weibchendominierten Steroidhormonsystems, das eine einzigartige und entscheidende Funktion bei Insekten erfüllt. Eine männchenspezifische Ecdysonfunktion wurde postuliert, aber nicht eindeutig nachgewiesen. Beispielsweise besagt eine weitgehend widerlegte Hypothese¹⁸, dass diese Funktionen vom 20E-Vorläufer E1 übernommen werden könnten. Es ist bekannt, dass bei Drosophila die Monandrie durch die sexuelle Übertragung kleiner Sexualpeptide^19,20 ausgelöst wird, die mit Neuronen interagieren, welche das Weibchen innervieren. reproduktiver Trakt über spezifische Sexualpeptidrezeptoren21,22. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die nachgeschalteten Signalkaskaden zu bestimmen, die von 3D20E in A. gambiae-Weibchen kontrolliert werden, und um festzustellen, ob diese Kaskaden zwischen Mücken und Drosophila konserviert werden können.
Angesichts der in unserer Studie identifizierten wichtigen Rolle von 3D20E für die Fruchtbarkeit und das Verhalten von Weibchen eröffnen die Wege der 3D20E-Synthese und -Aktivierung neue Möglichkeiten für zukünftige Strategien zur Mückenbekämpfung. Dazu gehört beispielsweise die Erzeugung konkurrenzfähiger steriler Männchen im Rahmen von Sterile-Insekten-Technologien, die für die Freisetzung in die freie Natur oder zur Nachahmung von 3D20E beim Paarungsverhalten von Jungfern eingesetzt werden könnten. Die männchenspezifische Funktion von 3D20E könnte sich entwickelt haben, als A. gambiae und andere Cellia-Arten die Fähigkeit erwarben, ihr Sperma zu Paarungspfropfen zu koagulieren. Dies ermöglicht den effizienten Transfer großer Mengen an Hormonen und hormonaktivierenden Enzymen. Die Evolution von 3D20E, die Monandrie ermöglicht, bietet Weibchen wiederum einen Mechanismus (durch hohe Expression von MISO), um ihre reproduktive Fitness in Gebieten mit hoher Malaria-Prävalenz zu fördern, was indirekt zur Plasmodium-Übertragung beiträgt. Da gezeigt wurde, dass weibliches 20E tiefgreifende Auswirkungen auf das Überleben und Wachstum von P. falciparum in weiblichen Anopheles-Mücken hat,²⁴ ist dies sowohl für Männchen als auch für Weibchen von Bedeutung. Steroidhormonwege spielen heute eine Schlüsselrolle bei den Wechselwirkungen zwischen Mücken und Parasiten.
A. gambiae G3-Stämme wurden unter Standardbedingungen für Insekten gezüchtet (26–28 °C, 65–80 % relative Luftfeuchtigkeit, 12:12 h Licht/Dunkel-Zyklus). Die Larven wurden mit pulverisiertem Fischfutter (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets und Tetra Pond Sticks im Verhältnis 7:7:2) gefüttert. Adulte Mücken erhielten ad libitum 10%ige Dextroselösung und wöchentlich menschliches Blut (zur Untersuchung von Blutbestandteilen). Jungfräuliche Mücken wurden durch Geschlechtertrennung im Puppenstadium nach mikroskopischer Untersuchung der Geschlechter gewonnen. Männchen mit dem DsRed-Transgen wurden bereits beschrieben.
Die Experimente zur erzwungenen Paarung wurden gemäß zuvor beschriebenen Protokollen durchgeführt. Für die natürliche Paarung wurden 4 Tage alte Jungfernweibchen im Verhältnis 1:3 mit geschlechtsreifen Jungfernmännchen für zwei Nächte zusammengehalten. Bei Experimenten, in denen Männchen mit dsEPP injiziert wurden, erfolgte die gemeinsame Unterbringung am 3.-4. Tag nach der Injektion, wenn die Phosphataseaktivität maximal gehemmt war (Ergänzende Abbildung 2b).
Mückengewebe, Restkadaver (übriger Körper) oder ganze Körper wurden in 100%igem Methanol präpariert und mit einer Kugelmühle (2 mm Glasperlen, 2400 U/min, 90 s) homogenisiert. Die Gewebemengen und Methanolvolumina waren wie folgt: Rest des Körpers, 50 µl in 1000 µl; MAG, 50–100 µl in 80 µl; weibliche LRT, 25–50 µl in 80 µl. Das Präzipitat wurde einer zweiten Methanolextraktion mit dem gleichen Volumen Methanol unterzogen. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt. Das Methanol beider Extraktionen wurde vereinigt und unter Stickstoffstrom getrocknet, anschließend in folgenden Volumina von 80%igem Methanol in Wasser resuspendiert: Rest des Körpers, 50 µl; MAG und weibliche LRT, 30 µl.
Die Proben wurden mit einem Massenspektrometer (ID-X, Thermo Fisher) analysiert, das an ein LC-System (Vanquish, Thermo Fisher) gekoppelt war. 5 µl der Probe wurden auf eine 3 µm, 100 × 4,6 mm Säule (Inspire C8, Dikma) injiziert, die auf 25 °C temperiert war. Als mobile Phasen für die LC dienten A (Wasser, 0,1 % Ameisensäure) und B (Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure). Der LC-Gradient verlief wie folgt: 5 % B für 1 Minute, anschließend Anstieg auf 100 % B über 11 Minuten. Nach 8 Minuten bei 100 % B wurde die Säule für 4 Minuten mit 5 % B reäquilibriert. Die Flussrate betrug 0,3 ml min⁻¹. Die Ionisierung in der MS-Quelle erfolgte mittels beheizter Elektrospray-Ionisation im positiven und negativen Modus.
Das Massenspektrometer misst Daten im m/z-Bereich von 350 bis 680 mit einer Auflösung von 60.000 im Full-MS-Modus. MS/MS-Daten wurden für [M + H]+ (alle Zielmoleküle), [M - H₂O + H]+ (alle Zielmoleküle) und [M - H]- (phosphorylierte Zielmoleküle) erfasst. Die MS/MS-Daten dienten der Bestätigung der Ecdyson-Eigenschaften von Zielmolekülen, für die kein Standard verfügbar war. Zur Identifizierung nicht-zielgerichteter Ecdysteroide wurden MS/MS-Daten aller HPLC-Peaks mit einer relativen Häufigkeit von >15 % analysiert. Die Quantifizierung erfolgte anhand von Standardkurven, die aus reinen Standards (20E, 3D20E) erstellt wurden, um absolute Mengen zu berechnen, oder durch Verdünnungen einer spezifischen Probe (alle anderen Zielmoleküle), um deren Äquivalenz zu den in einem männlichen Individuum gefundenen Mengen zu berechnen. Für 3D20E wurde die Quantifizierung über die Summe der folgenden Addukte durchgeführt: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-. [M + NO3]-. Die Daten wurden mit Tracefinder (Version 4.1) extrahiert und quantifiziert. Die MS/MS-Daten wurden mit Xcalibur (Version 4.4) analysiert. Die MS-Spektren von E, 20E und 3D20E wurden mit den jeweiligen Standards verglichen. 3D20E22P wurde durch Derivatisierung mit Girards Reagenz analysiert. 20E22P wurde über das m/z-Verhältnis analysiert.
3D20E22P wurde aus MAG aufgereinigt. Die Aufreinigung erfolgte im analytischen Maßstab mittels Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPLC, Acquity, Waters) mit einem Quadrupol-Massenspektrometer (QDa, Acquity, Waters) unter den gleichen LC-Bedingungen wie bei der HPLC-MS/MS-Analyse. Die Fraktionssammlung wurde ausgelöst, sobald das m/z-Verhältnis von 3D20E22P bei der zuvor bestimmten Retentionszeit detektiert wurde. Die Reinheit der extrahierten Verbindungen wurde anschließend wie oben beschrieben mittels HPLC-MS/MS überprüft.
Die Gesamt-RNA wurde aus 10–12 reproduktiven Geweben oder anderen Körperteilen (ohne Kopf) mit TRI-Reagenz (Thermo Fisher) gemäß den Herstellerangaben extrahiert. Die RNA wurde mit TURBO DNase (Thermo Fisher) behandelt. Die cDNA-Synthese erfolgte mit Moloney-Mausleukämievirus-Reverser Transkriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) gemäß den Herstellerangaben. Die Primer für die quantitative Reverse-Transkriptions-PCR (RT-qPCR; Tabelle 2 im Anhang) wurden bereits publiziert²⁴ oder mit Primer-BLAST²⁶ entworfen. Bevorzugt wurden Produkte mit einer Größe von 70–150 bp, die Exon-Exon-Übergänge überspannen oder Exons trennen. cDNA-Proben aus drei bis vier biologischen Replikaten wurden für die RT-qPCR vierfach mit Wasser verdünnt. Die Quantifizierung erfolgte in 15 µl-Replikaten mit 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), Primern und 5 µl … Verdünnte cDNA. Die Reaktionen wurden auf einem QuantStudio 6 Pro Echtzeit-PCR-System (Thermo Fisher) durchgeführt und die Daten mit Design and Analysis (Version 2.4.3) erfasst und analysiert. Wie in dieser Studie gezeigt, wurden die relativen Mengen auf das ribosomale Gen RpL19 (AGAP004422) normalisiert, dessen Expression sich durch Blutmahlzeiten 27 oder Paarung 3 nicht signifikant veränderte.
Die RNA-Qualität wurde mit einem Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent) überprüft. Illumina-Paired-End-Bibliotheken wurden am Broad Institute des MIT und der Harvard University erstellt und sequenziert. Die Sequenzierungsdaten wurden mit HISAT2 (Version 2.0.5) und Standardparametern auf das A. gambiae-Genom (PEST-Stamm, Version 4.12) ausgerichtet. Reads mit einem MAPQ-Score (Mapping Quality) < 30 wurden mit Samtools (Version 1.3.1) entfernt. Die Anzahl der auf Gene gemappten Reads wurde mit htseq-count (Version 0.9.1) und Standardparametern bestimmt. Normalisierte Read-Counts wurden berechnet und die differentielle Genexpression mit dem DESeq2-Paket (Version 1.28.1) in R (Version 4.0.3) analysiert.
Ecdyson-modifizierende Genkandidaten wurden identifiziert, indem zunächst das A. gambiae-Genom mithilfe des PSI-BLAST-Algorithmus (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) unter Verwendung der Standardparameter und der folgenden Abfrageproteinsequenzen durchsucht wurde: von Bombyx mori (Zugangsnummer NP_001038956.1), Musca domestica (Zugangsnummer XP_005182020.1, XP_005175332.1 und XP_011294434.1) und Microplitis demolitor (Zugangsnummer XP_008552646.1 und XP_008552645.1) EcK von B. mori (Zugangsnummer NP_001036900), Drosophila melanogaster (Zugangsnummer NP_651202), Apis mellifera (Zugangsnummer XP_394838) und Acyrthosiphon pisum (Zugangsnummer XP_001947166); sowie EPP von B. mori (Zugangsnummer XP_001947166) NP_001177919.1 und NP_001243996.1) und EO von D. melanogaster (Zugangsnummer NP_572986.1) (Schritt 1). Anschließend werden Treffer anhand einer hohen mRNA-Expression (>100 Fragmente/Kilobase Exons pro Million zugeordneter Reads (FPKM) oder >85 %) im reproduktiven Gewebe (weibliche LRT oder MAG) in Gambia gefiltert (Schritt 2). Um die Spezifität zu verbessern, wählten wir Kandidatenenzyme aus, die auch im Fortpflanzungsgewebe von A. albimanus exprimiert werden, einer Anopheles-Art, die während der Paarung kein Ecdyson synthetisiert oder überträgt. Kandidatengene wurden anhand ihrer geringen Expression (<100 FPKM oder <85. Perzentil) im Fortpflanzungsgewebe von A. albimanus gefiltert (Schritt 3). Im letzten Filter (Schritt 4) müssen Kandidatengene mindestens eines der folgenden Kriterien erfüllen: (1) signifikante Hochregulierung nach der Paarung (P < 0,05) gemäß der Analyse differentiell exprimierter Gene und (2) Expression in nicht-reproduktiven Geweben (< 85 % oder <100 FPKM).
Wir modifizierten zuvor beschriebene Methoden^28,29,30, um eine Isotopenmarkierung des gesamten Organismus zu erreichen. Kurz gesagt, wurde Wildtyp-Saccharomyces cerevisiae Typ II (YSC2, Sigma) in Hefe-Stickstoffbasis (BD Difco, DF0335) getestet, die (w/v) 2 % Glucose (G7528, Sigma), 1,7 % aminosäurefreies Ammoniumsulfat und 5 % ¹⁵N-Ammoniumsulfat (NLM-713, >99 %, Cambridge Isotope Laboratories) als einzige Stickstoffquelle enthielt. Die Hefe wurde durch Zentrifugation gewonnen und Mückenlarven bis zur Verpuppung ad libitum gefüttert. Um die Mortalität im vierten Larvenstadium zu verhindern, wurde Fischmehl (0,5 mg pro 300 Larven) zugesetzt. Anschließend wurden nur Weibchen in Paarungsexperimenten mit unmarkierten Männchen verwendet, um das während der Paarung übertragene männliche Proteom zu analysieren.
Vier bis sechs Tage alte, mit 15N markierte Jungfernweibchen wurden zur Paarung mit gleichaltrigen, unmarkierten Jungfernmännchen gezwungen. Die erfolgreiche Paarung wurde durch den Nachweis von Paarungspfropfen mittels Epifluoreszenzmikroskopie bestätigt. Nach 3, 12 und 24 Stunden wurden die Atrien von 45–55 begatteten Weibchen in 50 µl Ammoniumbicarbonatpuffer (pH 7,8) präpariert und mit einem Pistill homogenisiert. Das Homogenat wurde zentrifugiert und der Überstand mit 50 µl 0,1% RapiGest (186001860, Waters) in 50 mM Ammoniumbicarbonat versetzt. Überstand und Pellet jeder Probe wurden auf Trockeneis schockgefroren und über Nacht an das MacCoss-Labor der University of Washington versandt, wo die Probenvorbereitung für LC-MS/MS abgeschlossen wurde. Das Pellet wurde in 50 µl 0,1% RapiGest resuspendiert. 50 mM Ammoniumbicarbonat und Ultraschallbehandlung im Wasserbad. Die Proteinkonzentration des Pellets und des Überstands wurde mittels BCA-Assay bestimmt. Die Proben wurden mit 5 mM Dithiothreitol (DTT; Sigma) reduziert, mit 15 mM Iodacetamid (Sigma) alkyliert und 1 Stunde bei 37 °C (1:0, 50) mit Trypsin (Trypsin:Substrat-Verhältnis) inkubiert. RapiGest wurde durch Zugabe von 200 mM HCl lysiert, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C für 45 Minuten und Zentrifugation bei 14.000 U/min für 10 Minuten bei 4 °C, um Zelltrümmer zu entfernen. Die Proben wurden mittels Dual-Mode-Festphasenextraktion (Oasis MCX-Kartuschen, Waters) gewaschen und in 0,1 % Ameisensäure für eine Endproteinkonzentration von 0,33 µg/µl resuspendiert. Unmarkiertes MAG Die Proteome von Jungfernmännchen wurden in ähnlicher Weise analysiert. Für jede Probe wurden zwei analytische Replikate analysiert. Anschließend wurde jeweils 1 µg mittels Flüssigkeitschromatographie analysiert. Hierfür wurde eine 25 cm lange Quarzglaskapillarsäule mit 75 µm Partikelgröße und einer 4 cm langen Quarzglaskapillar-Kasil1 (PQ)-Fritte als Anreicherungselement verwendet, die mit Jupiter C12-Umkehrphasenharz (Phenomenex) gepackt war. Die Analyse erfolgte über 180 Minuten. Probenaufschluss – Die MS/MS-Analyse erfolgte mit einem Q-Exactive HF Massenspektrometer (Thermo Fisher) und einem nanoACQUITY UPLC-System (Waters). Die für jeden Lauf generierten Daten wurden mit Proteowizard (Version 3.0.20287) und Comet31 (Version 3.2) in das mzML-Format konvertiert. Hierfür wurde die FASTA-Datenbank mit Proteinsequenzen von Anopheles gambiae (VectorBase Version 54) und Anopheles coluzzi verwendet. Zusätzlich wurde eine Suche in Mali-NIH (VectorBase Version 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, März 2021), A. gambiae RNA-Seq und in Drei-Rahmen-Translationen bekannter humaner Kontaminanten durchgeführt. Die FDR-Werte für die Peptidzuordnung wurden mit Percolator32 (Version 3.05) und einem Schwellenwert von 0,01 bestimmt. Die Peptide wurden anschließend mittels Protein-Parsimonie in Limelight33 zu Proteinen assembliert. (Version 2.2.0). Die relative Proteinhäufigkeit wurde anhand des normalisierten spektralen Häufigkeitsfaktors (NSAF) geschätzt, der für jedes Protein in jedem Lauf wie zuvor beschrieben berechnet wurde. Der NSAF jedes Proteins wurde über Proben aus zwei verschiedenen biologischen Replikaten gemittelt. Die ¹⁵N-Markierung maskierte das weibliche Proteom erfolgreich, obwohl eine geringe Menge unmarkierten Proteins in den markierten Jungfern nachgewiesen werden konnte. Eine Reduktion männlicher Proteine ​​(1–5 Spektren) in weiblichen Rohproben wurde nur in technischen Läufen beobachtet, bei denen Rohproben nach männlichen/Paarungsproben analysiert wurden. Dies ist auf eine HPLC-Verschleppung zurückzuführen. Gelegentlich als Kontaminanten in markierten Jungfern gefundene Proteine ​​sind in Tabelle S1 (Zusatzmaterial) aufgeführt.
Zwei antigene Peptide, QTTDRVAPAPDQQQ (innerhalb des Isotyps PA) und MESDGTTPSGDSEQ (innerhalb der Isotypen PA und PB), wurden in Genscript exprimiert. Die beiden Peptide wurden kombiniert, an das Trägerprotein KLH konjugiert und Neuseeland-Kaninchen injiziert. Die Kaninchen wurden nach der vierten Injektion getötet, und das Gesamt-IgG wurde mittels Affinitätsreinigung isoliert. IgG des EPP-spezifischsten Kaninchens wurde für weitere Western-Blot-Analysen verwendet.
Für Western Blots wurden MAG- (n = 10, wobei n die Anzahl der biologisch unabhängigen Mückenproben angibt) und weibliche LRT-Mücken (n = 30) von 4 Tage alten Jungfernmännchen und Jungfern- oder zwangsverpaarten Weibchen (< 10 Tage nach der Paarung) verwendet. Proteinextraktionspuffer (50 mM Tris, pH 8,0; 1 % NP-40; 0,25 % Natriumdesoxycholat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche)) wurde separat zugegeben. Die Proben wurden unmittelbar nach der Präparation mit einer Glaskugel (2 mm, 2400 U/min, 90 s) homogenisiert. Unlösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugation bei 20.000 g und 4 °C entfernt. Die Proteine ​​wurden mittels Bradford-Assay (Bio-Rad) quantifiziert. Anschließend wurden 20 µg MAG-Protein, 40 µg LRT-Protein und 20 µg LRT-Protein in die Western Blot-Analyse gegeben. Restprotein (µg) wurde denaturiert und mittels 10% Bis-Tris NuPAGE unter Verwendung von MOPS-Puffer aufgetrennt. Die Proteine ​​wurden mit dem iBlot2-Transfersystem (Thermo Fisher) auf Polyvinylidenfluorid-Membranen transferiert. Die Membranen wurden zweimal mit 1× PBS-T (0,1% Tween-20 in PBS) gewaschen und anschließend 1 Stunde bei 22 °C in Odyssey-Blockierungspuffer (Li-Cor) blockiert. Die Membranen wurden über Nacht bei 4 °C mit einem spezifischen polyklonalen Kaninchen-Anti-EPP-Primärantikörper (1:700 in Blockierungspuffer) und einem monoklonalen Ratten-Anti-Actin-Primärantikörper MAC237 (Abeam; 1:4.000) geschüttelt. Nach dem Waschen mit PBS-T wurden die Membranen mit Sekundärantikörpern (Esel-Anti-Kaninchen 800CW und Ziege-Anti-Ratte 680LT (Li-Cor), jeweils 1:20.000) in Blockierungspuffer inkubiert. Die Membranen wurden 1 Stunde lang bei 22 °C in 0,01 % SDS und 0,2 % Tween-20 inkubiert. Anschließend wurden sie mit PBS-T gewaschen und mit einem Odyssey CLx-Scanner abgebildet. Die Bilder wurden in Image Studio (Version 5.2) aufgenommen und verarbeitet. Eine spezifische Bande, die der EPP-RA-Isoform (82 kDa) entspricht, konnte nicht detektiert werden.
Die kodierenden Regionen von EPP (als Isoform AGAP002463-RB mit Histidinphosphatase-Domäne, NCBI-Suche nach konservierten Domänen 34) und EcK2 (AGAP002181) wurden in das Plasmid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma) kloniert; Die Primer sind in Tabelle 2 der erweiterten Daten aufgeführt. Acht GS4-Linker (in Tandem) wurden vor dem C-terminalen 6xHis-Tag des pET-21a(+)-EcK2-Konstrukts eingefügt. Rekombinante Proteine ​​wurden mittels zellfreier E. coli-Proteinsynthese mit dem NEBExpress-Kit (New England BioLabs) hergestellt und anschließend mit NEBExpress-Ni-Spin-Säulen (New England BioLabs) aufgereinigt. Das Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Kontrollprotein wurde mit DNA-Template aus dem NEBExpress-Kit zur zellfreien E. coli-Proteinsynthese hergestellt. Die Proteine ​​wurden bis zu drei Monate in 50 % Glycerin in PBS bei -20 °C gelagert.
Die Phosphataseaktivität von EPP und Gewebeextrakten wurde mit 4-Nitrophenylphosphat (pNPP; Sigma-Aldrich) gemessen. Der Reaktionspuffer enthielt 25 mM Tris, 50 mM Essigsäure, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA und 1 mM DTT. Gewebe wurde im Reaktionspuffer homogenisiert und Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Enzym oder Gewebeextrakt zu Reaktionspuffer mit 2,5 mg/ml pNPP gestartet. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert, und die Menge des aus pNPP umgewandelten pNP wurde durch Messung der Absorption bei 405 nm zu verschiedenen Zeitpunkten quantifiziert.
Für die In-vitro-EcK-Aktivitätsbestimmung wurde das Protein mit 0,2 mg 20E oder 3D20E in 200 µl Puffer (pH 7,5), bestehend aus 10 mM HEPES-NaOH, 0,1 % BSA, 2 mM ATP und 10 mM MgCl₂, 2 h bei 27 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 800 µl Methanol gestoppt, anschließend 1 h bei -20 °C gekühlt und danach 10 min bei 4 °C und 20.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde mittels HPLC-MS/MS analysiert. Zur Hitzeinaktivierung der Proteine ​​der Kontrollgruppe wurden diese 20 min bei 95 °C in 50 % Glycerin in PBS inkubiert.
Für die In-vitro-EPP-Aktivitätsbestimmung wurde das Protein mit 3D20E22P (entsprechend der Menge in 18 MAG-Paaren, gereinigt mittels HPLC-MS/MS) in 100 µl Puffer (pH 7,5) inkubiert. Der Puffer enthielt 25 mM Tris, 50 mM Essigsäure, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA und 1 mM DTT. Die Inkubation erfolgte 3 Stunden bei 27 °C. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 400 µl Methanol gestoppt und 1 Stunde bei -20 °C gekühlt. Anschließend wurde 10 Minuten bei 4 °C und 20.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde mittels HPLC-MS/MS analysiert.
PCR-Fragmente für EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) und EcK2 (556 bp) wurden aus cDNA amplifiziert, die aus kopflosen Mückenkadavern beiderlei Geschlechts gewonnen wurde. Das PCR-Fragment der eGFP-Kontrolle (495 bp) wurde aus dem zuvor beschriebenen pCR2.1-eGFP amplifiziert; Die PCR-Primer sind in Tabelle 2 der erweiterten Daten aufgeführt. Das PCR-Fragment wurde zwischen die invertierten T7-Promotoren des Plasmids pL4440 inseriert. Die Plasmidkonstrukte wurden aus kompetenten NEB 5-α E. coli (New England Biolabs) gewonnen und vor der Verwendung durch DNA-Sequenzierung verifiziert (siehe Ergänzende Daten 1 für die Insertsequenz). Zur Amplifikation des Inserts aus dem pL4440-basierten Plasmid wurden Primer verwendet, die zum T7-Promotor passten (Tabelle 2 der erweiterten Daten). Die Größe des PCR-Produkts wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese bestätigt. dsRNA wurde von den PCR-Templates mit dem Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) transkribiert und gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den zuvor beschriebenen Modifikationen aufgereinigt.
Für die dsRNA-Injektion wurden 1380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) in einer Konzentration von 10 ng/nl innerhalb eines Tages nach dem Schlüpfen in den Thorax adulter Männchen oder Weibchen injiziert (Nanoject III, Drummond). Die Gen-Knockdown-Werte wurden in mindestens drei biologischen Replikaten mittels RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und RT-qPCR bestimmt. Für die Ecdyson-Injektion wurden 4 Tage alte, jungfräuliche, blutgesaugte Weibchen mit 0,13, 0,21 oder 0,63 µg 20E oder 3D20E (Nanoject III, Drummond) in Konzentrationen von 1,3 bzw. 2,1 ng/nl (abhängig vom Versuchsaufbau) oder 6,3 ng/nl injiziert. 10 % (v/v) Ethanol in Wasser; 100 nl 3D20E22P in 10 % Ethanol (entsprechend 75 % der Menge in einem Paar MAGs). Die Mücken wurden zufällig der Injektionsgruppe zugeordnet.
Für die Laichversuche wurden 3 Tage alte Weibchen ad libitum mit menschlichem Blut gefüttert. Teilweise oder nicht gesaugte Mücken wurden entfernt. Je nach Behandlung wurden die Weibchen mindestens 48 Stunden nach der Blutmahlzeit für vier Nächte in separate Laichbecher gesetzt. Die Eier wurden unter einem Stereomikroskop (Stemi 508, Zeiss) gezählt; bei begatteten Weibchen wurden Eier, aus denen Larven schlüpften, als befruchtet betrachtet.
Für die Paarungsversuche wurde den Weibchen je nach Behandlung mindestens zwei Tage Zeit gegeben, eine Paarungsresistenz zu entwickeln. Anschließend wurden gleichaltrige Wildtyp-Männchen in denselben Käfig gesetzt. Zwei Nächte später wurden die befruchteten Bläschen der Weibchen präpariert und die genomische DNA durch Einfrieren, Auftauen und Ultraschallbehandlung in einem Puffer mit 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA und 25 mM NaCl (pH 8,2) freigesetzt. Die Proben wurden 15 Minuten bei 55 °C und anschließend 10 Minuten bei 95 °C mit Proteinase K (0,86 µg/µl) inkubiert. Die rohen genomischen DNA-Präparationen wurden 10-fach verdünnt und mittels qPCR auf Y-Chromosom-Sequenzen untersucht; die Primer sind in Tabelle 2 der erweiterten Daten aufgeführt. Das Fehlen einer Y-Chromosom-Sequenz deutet auf keine Paarung hin.
Für die Wiederpaarungsversuche wurden zwangsverpaarte Weibchen auf das Vorhandensein von Kopulationspfropfen untersucht, um den Paarungsstatus zu bestätigen. Anschließend wurden sie zwei Tage lang in Abwesenheit von Männchen paarungsunfähig, wie bereits beschrieben³⁶. Männchen mit DsRed-transgenem Sperma wurden dann in die Käfige der Weibchen gesetzt. Zwei Nächte später wurden die Befruchtungsbläschen der Weibchen präpariert und die genomische DNA wie oben beschrieben isoliert und mittels qPCR auf das DsRed-Transgen untersucht; die Primer sind in Tabelle 2 der erweiterten Daten aufgeführt. Das Fehlen des DsRed-Transgens zeigte an, dass keine Wiederpaarung stattgefunden hatte.
3D20E wurde wie zuvor beschrieben synthetisiert³⁷. Kurz gesagt, wurden 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) in 10 ml Wasser gelöst und anschließend 30 mg Platinschwarz (in Pulverform, Sigma-Aldrich) hinzugegeben. Ein schwacher O₂-Strom wurde kontinuierlich in die Reaktionsmischung eingeleitet, die bei Raumtemperatur gerührt wurde. Nach 6 Stunden wurden 30 ml Methanol zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Mischung wurde zentrifugiert, um Katalysatorpartikel zu entfernen. Der Überstand wurde bei Raumtemperatur im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das getrocknete Reaktionsprodukt wurde in 10%igem Ethanol und Methanol gelöst und für die HPLC-MS/MS-Analyse verwendet. Die Umwandlungsrate (von 20E zu 3D20E) betrug ca. 97 % (Abb. 4b), und das Massenspektrum des synthetisierten 3D20E stimmte mit dem in begatteten Weibchen gefundenen überein (Abb. 4c).
Die Legende enthält detaillierte Angaben zu den durchgeführten statistischen Tests. GraphPad (Version 9.0) wurde für den Fisher-Exakt-Test, den Mantel-Cox-Test und den t-Test nach Student verwendet. Cochran-Mantel-Haenszel-Tests wurden mithilfe eines benutzerdefinierten R-Skripts (verfügbar unter https://github.com/duopeng/mantelhaen.test) durchgeführt. Die Datenverteilung wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test auf Normalverteilung geprüft (Signifikanzniveau: 0,05). Bei Nichterfüllung der Normalverteilungsanforderungen wurde der Mann-Whitney-Test angewendet. Überlebensdaten wurden mit dem Mantel-Cox-Test analysiert. Das DESeq2-Paket (Version 1.28.1) wurde für die differentielle Genexpressionsanalyse auf RNA-Seq-Ebene verwendet. Der horizontale Balken im Diagramm repräsentiert den Median. Ein p-Wert von 0,05 wurde als Signifikanzniveau für alle Tests festgelegt.
Weitere Informationen zum Studiendesign finden Sie in der Zusammenfassung des Nature Research Reports, die mit diesem Artikel verlinkt ist.
Die MS-Proteomikdaten wurden über das PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) mit der Datensatzkennung PXD032157 im ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) hinterlegt.
Der RNA-Seq-Datensatz ist in der Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) unter der Seriennummer GSE198665 hinterlegt.
Zusätzliche Datensätze, die im Rahmen dieser Studie generiert und/oder analysiert wurden, können auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren angefordert werden. Die Quelldaten sind in diesem Artikel enthalten.
De Loof, A. Ecdysteroide: Vernachlässigte Insekten-Sexualsteroide? Male: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-Hydroxyecdyson und die Ovarialentwicklung bei Anopheles stephens.J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).