Propionsäure (PPA), ein Antimykotikum und häufiger Futterzusatzstoff, verursacht bei Mäusen neurologische Entwicklungsstörungen, die mit gastrointestinalen Funktionsstörungen einhergehen und möglicherweise durch eine Dysbiose des Darmmikrobioms bedingt sind. Ein Zusammenhang zwischen der Aufnahme von PPA über die Nahrung und einer Dysbiose der Darmmikrobiota wurde vermutet, aber bisher nicht direkt untersucht. In der vorliegenden Studie untersuchten wir PPA-bedingte Veränderungen der Zusammensetzung des Darmmikrobioms, die zu einer Dysbiose führen könnten. Die Darmmikrobiome von Mäusen, die mit einer unbehandelten (n=9) bzw. einer PPA-angereicherten (n=13) Diät gefüttert wurden, wurden mittels Metagenomsequenzierung analysiert, um Unterschiede in der mikrobiellen Zusammensetzung und den bakteriellen Stoffwechselwegen zu erfassen. Die Aufnahme von PPA über die Nahrung war mit einer erhöhten Häufigkeit bestimmter Taxa verbunden, darunter verschiedene Bacteroides-, Prevotella- und Ruminococcus-Arten, die bereits zuvor mit der PPA-Produktion in Verbindung gebracht wurden. Die Mikrobiome der PPA-exponierten Mäuse wiesen zudem vermehrt Stoffwechselwege auf, die mit dem Lipidstoffwechsel und der Steroidhormonbiosynthese zusammenhängen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass PPA die Darmmikrobiota und die damit verbundenen Stoffwechselwege verändern kann. Diese beobachteten Veränderungen verdeutlichen, dass als unbedenklich eingestufte Konservierungsstoffe die Zusammensetzung der Darmmikrobiota und somit die menschliche Gesundheit beeinflussen können. Je nach analysierter Klassifizierungsebene wird P, G oder S ausgewählt. Um den Einfluss falsch positiver Klassifizierungen zu minimieren, wurde ein minimaler Schwellenwert für die relative Häufigkeit von 1e-4 (1/10.000 Reads) festgelegt. Vor der statistischen Analyse wurden die von Bracken angegebenen relativen Häufigkeiten (Anteil an den Gesamt-Reads) mittels zentrierter Log-Ratio-Transformation (CLR) transformiert (Aitchison, 1982). Die CLR-Methode wurde für die Datentransformation gewählt, da sie skaleninvariant und für nicht-sparsame Datensätze ausreichend ist (Gloor et al., 2017). Die CLR-Transformation verwendet den natürlichen Logarithmus. Die von Bracken angegebenen Zähldaten wurden mittels relativer Log-Expression (RLE) normalisiert (Anders und Huber, 2010). Die Abbildungen wurden mit einer Kombination aus Matplotlib v. 3.7.1, Seaborn v. 3.7.2 und sequenziellen Logarithmen erstellt (Gloor et al., 2017). 0.12.2 und stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Das Verhältnis von Bacillus zu Bacteroidetes wurde für jede Probe anhand normalisierter Bakterienzahlen berechnet. Die in den Tabellen angegebenen Werte sind auf vier Dezimalstellen gerundet. Der Simpson-Diversitätsindex wurde mit dem Skript alpha_diversity.py aus dem KrakenTools-Paket v. 1.2 (Lu et al., 2022) berechnet. Der Bracken-Bericht ist im Skript enthalten, und der Simpson-Index „Si“ wird für den Parameter -an angegeben. Signifikante Unterschiede in der Häufigkeit wurden als mittlere CLR-Differenzen ≥ 1 oder ≤ -1 definiert. Eine mittlere CLR-Differenz von ±1 bedeutet eine 2,7-fache Zunahme der Häufigkeit eines Probentyps. Das Vorzeichen (+/-) gibt an, ob das Taxon in der PPA-Probe bzw. in der Kontrollprobe häufiger vorkommt. Die Signifikanz wurde mittels Mann-Whitney-U-Test (Virtanen et al., 2020) ermittelt. Für die statistische Auswertung wurde Statsmodels v. 0.14 (Benjamini und Hochberg, 1995; Seabold und Perktold, 2010) verwendet. Zur Korrektur multipler Testungen wurde das Benjamini-Hochberg-Verfahren angewendet. Ein adjustierter p-Wert ≤ 0,05 wurde als Schwellenwert für statistische Signifikanz festgelegt.
Das menschliche Mikrobiom wird oft als „letztes Organ des Körpers“ bezeichnet und spielt eine entscheidende Rolle für die menschliche Gesundheit (Baquero und Nombela, 2012). Insbesondere das Darmmikrobiom ist für seinen systemweiten Einfluss und seine Beteiligung an vielen essenziellen Funktionen bekannt. Kommensale Bakterien sind im Darm zahlreich vorhanden, besiedeln verschiedene ökologische Nischen, nutzen Nährstoffe und konkurrieren mit potenziellen Krankheitserregern (Jandhyala et al., 2015). Verschiedene bakterielle Komponenten der Darmmikrobiota sind in der Lage, essenzielle Nährstoffe wie Vitamine zu produzieren und die Verdauung zu fördern (Rowland et al., 2018). Bakterielle Metabolite beeinflussen nachweislich auch die Gewebeentwicklung und verbessern Stoffwechsel- und Immunprozesse (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Die Zusammensetzung des menschlichen Darmmikrobioms ist äußerst vielfältig und hängt von genetischen und Umweltfaktoren wie Ernährung, Geschlecht, Medikamenteneinnahme und Gesundheitszustand ab (Kumbhare et al., 2019).
Die Ernährung der Mutter ist ein entscheidender Faktor für die fetale und neonatale Entwicklung und eine mögliche Quelle von Verbindungen, die diese beeinflussen können (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Eine dieser Verbindungen ist Propionsäure (PPA), ein kurzkettiges Fettsäure-Nebenprodukt der bakteriellen Fermentation und Lebensmittelzusatzstoff (den Besten et al., 2013). PPA besitzt antibakterielle und antimykotische Eigenschaften und wird daher als Lebensmittelkonservierungsmittel sowie in industriellen Anwendungen zur Hemmung von Schimmelpilz- und Bakterienwachstum eingesetzt (Wemmenhove et al., 2016). PPA hat unterschiedliche Wirkungen in verschiedenen Geweben. In der Leber wirkt PPA entzündungshemmend, indem es die Zytokin-Expression in Makrophagen beeinflusst (Kawasoe et al., 2022). Dieser regulatorische Effekt wurde auch in anderen Immunzellen beobachtet und führt zu einer Reduktion der Entzündung (Haase et al., 2021). Im Gehirn hingegen wurde der gegenteilige Effekt festgestellt. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Exposition gegenüber PPA bei Mäusen autismusähnliches Verhalten hervorruft (El-Ansary et al., 2012). Andere Studien belegen, dass PPA Gliose induzieren und proinflammatorische Signalwege im Gehirn aktivieren kann (Abdelli et al., 2019). Da PPA eine schwache Säure ist, kann sie durch das Darmepithel in den Blutkreislauf diffundieren und somit Barrieren wie die Blut-Hirn-Schranke und die Plazenta überwinden (Stinson et al., 2019). Dies unterstreicht die Bedeutung von PPA als regulatorisches, von Bakterien produziertes Stoffwechselprodukt. Obwohl die potenzielle Rolle von PPA als Risikofaktor für Autismus derzeit untersucht wird, könnten seine Auswirkungen auf Menschen mit Autismus über die Induktion neuronaler Differenzierung hinausgehen.
Gastrointestinale Symptome wie Durchfall und Verstopfung treten häufig bei Patienten mit neurologischen Entwicklungsstörungen auf (Cao et al., 2021). Frühere Studien haben gezeigt, dass sich das Mikrobiom von Patienten mit Autismus-Spektrum-Störungen (ASS) von dem gesunder Personen unterscheidet, was auf eine Dysbiose der Darmmikrobiota hindeutet (Finegold et al., 2010). Auch die Mikrobiom-Charakteristika von Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen, Adipositas, Alzheimer usw. unterscheiden sich von denen gesunder Personen (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Bislang konnte jedoch kein kausaler Zusammenhang zwischen dem Darmmikrobiom und neurologischen Erkrankungen oder Symptomen nachgewiesen werden (Yap et al., 2021), obwohl einige Bakterienarten vermutlich bei manchen dieser Krankheitszustände eine Rolle spielen. Beispielsweise sind Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio und andere Gattungen in der Darmflora von Patienten mit Autismus häufiger anzutreffen (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Bemerkenswerterweise besitzen einige Arten dieser Gattungen Gene, die mit der PPA-Produktion assoziiert sind (Reichardt et al., 2014; Yun und Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur und Dürre, 2023). Aufgrund der antimikrobiellen Eigenschaften von PPA könnte eine erhöhte PPA-Konzentration das Wachstum PPA-produzierender Bakterien fördern (Jacobson et al., 2018). Eine PFA-reiche Umgebung kann somit zu Veränderungen der Darmmikrobiota, einschließlich gastrointestinaler Krankheitserreger, führen, die möglicherweise Faktoren sind, die zu gastrointestinalen Symptomen führen.
Eine zentrale Frage der Mikrobiomforschung ist, ob Unterschiede in der mikrobiellen Zusammensetzung Ursache oder Symptom zugrundeliegender Erkrankungen sind. Der erste Schritt zur Aufklärung des komplexen Zusammenhangs zwischen Ernährung, Darmmikrobiom und neurologischen Erkrankungen besteht darin, die Auswirkungen der Ernährung auf die mikrobielle Zusammensetzung zu untersuchen. Zu diesem Zweck verglichen wir mittels Metagenomsequenzierung (Langsequenzierung) die Darmmikrobiome von Nachkommen von Mäusen, die entweder PPA-reich oder PPA-arm ernährt wurden. Die Nachkommen erhielten dieselbe Nahrung wie ihre Mütter. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine PPA-reiche Ernährung Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikroben und in mikrobiellen Stoffwechselwegen, insbesondere solchen, die mit dem PPA-Stoffwechsel und/oder der PPA-Produktion zusammenhängen, zur Folge haben würde.
In dieser Studie wurden transgene FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J-Mäuse (Jackson Laboratories) verwendet, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Kontrolle des gliazellenspezifischen GFAP-Promotors überexprimieren. Die Studie erfolgte gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Central Florida (UCF) (Tierversuchsgenehmigungsnummer: PROTO202000002). Nach dem Absetzen wurden die Mäuse einzeln in Käfigen mit 1–5 Tieren beiderlei Geschlechts gehalten. Sie erhielten ad libitum entweder eine gereinigte Kontrolldiät (modifizierte Standarddiät, 16 kcal% Fett) oder eine mit Natriumpropionat angereicherte Diät (modifizierte Standarddiät, 16 kcal% Fett, mit 5.000 ppm Natriumpropionat). Die verwendete Menge an Natriumpropionat entsprach 5.000 mg PFA/kg Gesamtfuttergewicht. Dies ist die höchste für die Verwendung als Lebensmittelkonservierungsmittel zugelassene PPA-Konzentration. Zur Vorbereitung dieser Studie wurden die Elterntiere vier Wochen vor der Paarung und während der gesamten Trächtigkeit der Muttertiere mit beiden Futtermitteln gefüttert. Die Nachkommen [22 Mäuse, 9 Kontrolltiere (6 Männchen, 3 Weibchen) und 13 PPA-Mäuse (4 Männchen, 9 Weibchen)] wurden entwöhnt und anschließend fünf Monate lang mit dem gleichen Futter wie die Muttertiere gefüttert. Im Alter von fünf Monaten wurden die Nachkommen getötet, und ihr Darminhalt wurde gesammelt und zunächst in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen bei -20 °C gelagert. Anschließend wurden sie bis zum vollständigen Abbau der Wirts-DNA und der Extraktion der mikrobiellen Nukleinsäuren bei -80 °C eingefroren.
Die Entfernung der Wirts-DNA erfolgte nach einem modifizierten Protokoll (Charalampous et al., 2019). Kurz gesagt, wurden die Fäkalien in 500 µl InhibitEX (Qiagen, Kat.-Nr./ID: 19593) überführt und eingefroren. Pro Extraktion wurden maximal 1–2 Fäkalienpellets verarbeitet. Die Fäkalien wurden anschließend mit einem Kunststoffstößel im Röhrchen mechanisch homogenisiert. Die Proben wurden 5 min bei 10.000 g zentrifugiert oder bis zur vollständigen Pelletierung. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet in 250 µl 1× PBS resuspendiert. Zur Lockerung der eukaryotischen Zellmembranen wurden 250 µl 4,4%ige Saponinlösung (TCI, Produktnummer S0019) als Detergens zugegeben. Die Proben wurden vorsichtig homogenisiert und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Zerstörung eukaryotischer Zellen wurden 350 μl nukleasefreies Wasser zur Probe gegeben, 30 s inkubiert und anschließend 12 μl 5 M NaCl hinzugefügt. Die Proben wurden dann 5 min bei 6000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet in 100 μl 1x PBS resuspendiert. Zur Entfernung der Wirts-DNA wurden 100 μl HL-SAN-Puffer (12,8568 g NaCl, 4 ml 1 M MgCl₂, 36 ml nukleasefreies Wasser) und 10 μl HL-SAN-Enzym (ArticZymes P/N 70910-202) hinzugegeben. Die Proben wurden durch Pipettieren gründlich vermischt und 30 min bei 37 °C und 800 U/min auf einem Eppendorf™ ThermoMixer C inkubiert. Nach der Inkubation wurde 3 min bei 6000 g zentrifugiert und zweimal mit 800 µl und 1000 µl 1x PBS gewaschen. Das Pellet wurde abschließend in 100 µl 1x PBS resuspendiert.
Die Gesamt-DNA der Bakterien wurde mit dem Monarch Genomic DNA Purification Kit von New England Biolabs (New England Biolabs, Ipswich, MA, Kat.-Nr. T3010L) isoliert. Die dem Kit beiliegende Standardarbeitsanweisung wurde leicht modifiziert. Nukleasefreies Wasser wurde vor der finalen Elution bei 60 °C inkubiert und gehalten. Zu jeder Probe wurden 10 µl Proteinase K und 3 µl RNase A gegeben. Anschließend wurden 100 µl Zelllysepuffer hinzugefügt und vorsichtig gemischt. Die Proben wurden dann in einem Eppendorf™ ThermoMixer C bei 56 °C und 1400 U/min für mindestens 1 Stunde und bis zu 3 Stunden inkubiert. Die inkubierten Proben wurden 3 Minuten bei 12.000 g zentrifugiert, und der Überstand jeder Probe wurde in ein separates 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 400 µl Bindungslösung überführt. Die Probenröhrchen wurden anschließend 5–10 Sekunden lang im Sekundentakt kurz vortexiert. Der gesamte Flüssigkeitsinhalt jeder Probe (ca. 600–700 µL) wurde in eine Filterkartusche überführt, die sich in einem Durchflussröhrchen befand. Die Röhrchen wurden 3 Minuten bei 1.000 g zentrifugiert, um die anfängliche DNA-Bindung zu ermöglichen, und anschließend 1 Minute bei 12.000 g zentrifugiert, um restliche Flüssigkeit zu entfernen. Die Probensäule wurde in ein neues Auffangröhrchen überführt und zweimal gewaschen. Für den ersten Waschgang wurden 500 µL Waschpuffer in jedes Röhrchen gegeben. Das Röhrchen wurde 3–5 Mal invertiert und anschließend 1 Minute bei 12.000 g zentrifugiert. Die Flüssigkeit aus dem Auffangröhrchen wurde verworfen und die Filterkartusche wieder in dasselbe Auffangröhrchen eingesetzt. Für den zweiten Waschgang wurden 500 µL Waschpuffer ohne Invertieren auf den Filter gegeben. Die Proben wurden 1 Minute bei 12.000 g zentrifugiert. Überführen Sie den Filter in ein 1,5-ml-LoBind®-Röhrchen und geben Sie 100 µl vorgewärmtes, nukleasefreies Wasser hinzu. Die Filter wurden 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 1 Minute bei 12.000 g zentrifugiert. Die eluierte DNA wurde bei -80 °C gelagert.
Die DNA-Konzentration wurde mit einem Qubit™ 4.0 Fluorometer quantifiziert. Die DNA-Präparation erfolgte mit dem Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (Kat.-Nr. Q33231) gemäß den Herstellerangaben. Die Verteilung der DNA-Fragmentlängen wurde mit einem Agilent™ 4150 oder 4200 TapeStation gemessen. Die DNA-Präparation erfolgte mit Agilent™ Genomic DNA Reagents (Kat.-Nr. 5067-5366) und Genomic DNA ScreenTape (Kat.-Nr. 5067-5365). Die Bibliothekspräparation wurde mit dem Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Die DNA-Sequenzierung erfolgte mit einem ONT GridION™ Mk1 Sequenzer mit einer Min106D Flow Cell (R 9.4.1). Die Sequenzierungseinstellungen waren: hohe Genauigkeit bei der Basenbestimmung, minimaler q-Wert von 9, Barcode-Einrichtung und Barcode-Trimmung. Die Proben wurden 72 Stunden lang sequenziert, anschließend wurden die Basenbestimmungsdaten zur weiteren Verarbeitung und Analyse übermittelt.
Die bioinformatische Datenverarbeitung erfolgte nach zuvor beschriebenen Methoden (Greenman et al., 2024). Die aus der Sequenzierung gewonnenen FASTQ-Dateien wurden für jede Probe in separate Verzeichnisse aufgeteilt. Vor der bioinformatischen Analyse wurden die Daten mit folgender Pipeline verarbeitet: Zunächst wurden die FASTQ-Dateien der Proben zu einer einzigen FASTQ-Datei zusammengeführt. Anschließend wurden Reads mit einer Länge von weniger als 1000 bp mithilfe von Filtlong v. 0.2.1 gefiltert, wobei der einzige geänderte Parameter die Option `--min_length 1000` war (Wick, 2024). Vor der weiteren Filterung wurde die Read-Qualität mit NanoPlot v. 1.41.3 und den folgenden Parametern überprüft: `--fastq --plots dot --N50 --o`.
Für die taxonomische Klassifizierung wurden Reads und assemblierte Contigs mit Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019) klassifiziert. Es wurden Berichte und Ausgabedateien für Reads bzw. Assemblierungen generiert. Die Option `--use-names` wurde zur Analyse von Reads und Assemblierungen verwendet. Die Optionen `--gzip-compressed` und `--paired` wurden für Read-Segmente angegeben. Die relative Häufigkeit von Taxa in Metagenomen wurde mit Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017) geschätzt. Zunächst wurde mit `bracken-build` und den folgenden Parametern eine Kmer-Datenbank mit 1000 Basen erstellt: `-d`
Die Genannotation und die Schätzung der relativen Häufigkeit erfolgten anhand einer modifizierten Version des von Maranga et al. (Maranga et al., 2023) beschriebenen Protokolls. Zunächst wurden Contigs mit einer Länge von weniger als 500 bp mithilfe von SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016) aus allen Assemblierungen entfernt. Die verbleibenden Assemblierungen wurden anschließend zu einem Pan-Metagenom kombiniert. Offene Leserahmen (ORFs) wurden mit Prodigal v. 1.0.1 (einer Parallelversion von Prodigal v. 2.6.3) und den folgenden Parametern identifiziert: -d
Die Gene wurden zunächst anhand der von eggNOG vergebenen Ortholog-Identifikatoren (KO) der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) gruppiert, um die Häufigkeit von Genwegen zu vergleichen. Gene ohne Knockout oder mit mehreren Knockouts wurden vor der Analyse ausgeschlossen. Anschließend wurde die durchschnittliche Häufigkeit jedes KO pro Probe berechnet und eine statistische Analyse durchgeführt. Gene des PPA-Stoffwechsels wurden als alle Gene definiert, denen in der Spalte „KEGG_Pathway“ die Zeile „ko00640“ zugewiesen wurde, was gemäß KEGG auf eine Rolle im Propionatstoffwechsel hinweist. Gene, die mit der PPA-Produktion assoziiert sind, sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Permutationstests wurden durchgeführt, um Gene des PPA-Stoffwechsels und der PPA-Produktion zu identifizieren, die in den jeweiligen Probentypen signifikant häufiger vorkamen. Für jedes analysierte Gen wurden tausend Permutationen durchgeführt. Ein p-Wert von 0,05 wurde als Grenzwert für die statistische Signifikanz festgelegt. Funktionelle Annotationen wurden einzelnen Genen innerhalb eines Clusters auf Basis der Annotationen repräsentativer Gene innerhalb des Clusters zugeordnet. Taxa, die mit dem PPA-Metabolismus und/oder der PPA-Produktion assoziiert sind, konnten durch Abgleich der Contig-IDs in den Kraken2-Ausgabedateien mit den gleichen Contig-IDs, die bei der funktionellen Annotation mit eggNOG beibehalten wurden, identifiziert werden. Die Signifikanzprüfung erfolgte mittels des zuvor beschriebenen Mann-Whitney-U-Tests. Die Korrektur für multiples Testen wurde mit dem Benjamini-Hochberg-Verfahren durchgeführt. Ein p-Wert von ≤ 0,05 wurde als Grenzwert für statistische Signifikanz festgelegt.
Die Diversität des Darmmikrobioms von Mäusen wurde mithilfe des Simpson-Diversitätsindex bestimmt. Zwischen den Kontroll- und PPA-Proben wurden keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Gattungs- und Artendiversität beobachtet (p-Wert für Gattung: 0,18, p-Wert für Art: 0,16) (Abbildung 1). Anschließend wurde die mikrobielle Zusammensetzung mittels Hauptkomponentenanalyse (PCA) verglichen. Abbildung 2 zeigt die Clusterung der Proben nach ihren Phyla. Dies deutet darauf hin, dass Unterschiede in der Artenzusammensetzung der Mikrobiome zwischen den PPA- und Kontrollproben bestanden. Diese Clusterung war auf Gattungsebene weniger ausgeprägt, was darauf schließen lässt, dass PPA bestimmte Bakterien beeinflusst (Ergänzende Abb. 1).
Abbildung 1. Alpha-Diversität der Gattungs- und Artenzusammensetzung des Darmmikrobioms der Maus. Boxplots zeigen die Simpson-Diversitätsindizes der Gattungen (A) und Arten (B) in PPA- und Kontrollproben. Die Signifikanz wurde mittels Mann-Whitney-U-Test ermittelt und eine Korrektur für multiples Testen nach Benjamini-Hochberg durchgeführt. ns: p-Wert nicht signifikant (p > 0,05).
Abbildung 2. Ergebnisse der Hauptkomponentenanalyse der Zusammensetzung des Darmmikrobioms von Mäusen auf Speziesebene. Die Hauptkomponentenanalyse zeigt die Verteilung der Proben auf ihre ersten beiden Hauptkomponenten. Die Farben kennzeichnen den Probentyp: PPA-exponierte Mäuse sind violett, Kontrollmäuse gelb dargestellt. Die erste und zweite Hauptkomponente sind auf der x- bzw. y-Achse abgetragen und als Anteil der erklärten Varianz angegeben.
Anhand von RLE-transformierten Zähldaten wurde eine signifikante Abnahme des medianen Bacteroidetes/Bacilli-Verhältnisses bei Kontroll- und PPA-Mäusen beobachtet (Kontrolle: 9,66, PPA: 3,02; p = 0,0011). Dieser Unterschied beruhte auf einer höheren Bacteroidetes-Abundanz bei PPA-Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen, obwohl der Unterschied nicht signifikant war (mittleres CLR der Kontrollen: 5,51, mittleres CLR der PPA-Gruppe: 6,62; p = 0,054), während die Bacteroidetes-Abundanz vergleichbar war (mittleres CLR der Kontrollen: 7,76, mittleres CLR der PPA-Gruppe: 7,60; p = 0,18).
Die Analyse der Häufigkeit taxonomischer Mitglieder des Darmmikrobioms ergab, dass sich ein Stamm und 77 Arten zwischen PPA- und Kontrollproben signifikant unterschieden (Ergänzungstabelle 2). Die Häufigkeit von 59 Arten war in den PPA-Proben signifikant höher als in den Kontrollproben, während die Häufigkeit von nur 16 Arten in den Kontrollproben höher war als in den PPA-Proben (Abbildung 3).
Abbildung 3. Unterschiedliche Häufigkeit von Taxa im Darmmikrobiom von PPA- und Kontrollmäusen. Vulkanplots zeigen Unterschiede in der Häufigkeit von Gattungen (A) bzw. Arten (B) zwischen PPA- und Kontrollproben. Graue Punkte weisen auf keine signifikanten Unterschiede in der Taxahäufigkeit hin. Farbige Punkte zeigen signifikante Unterschiede in der Häufigkeit an (p-Wert ≤ 0,05). Die 20 Taxa mit den größten Häufigkeitsunterschieden zwischen den Probentypen sind rot (Kontrollproben) bzw. hellblau (PPA-Proben) dargestellt. Gelbe und violette Punkte repräsentieren Taxa, die in Kontroll- bzw. PPA-Proben mindestens 2,7-mal häufiger vorkamen als in den Kontrollproben. Schwarze Punkte repräsentieren Taxa mit signifikant unterschiedlicher Häufigkeit (mittlere CLR-Differenzen zwischen -1 und 1). Die p-Werte wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test berechnet und mittels Benjamini-Hochberg-Korrektur für multiples Testen korrigiert. Fettgedruckte mittlere CLR-Differenzen kennzeichnen signifikante Häufigkeitsunterschiede.
Nach der Analyse der Zusammensetzung der Darmmikrobiota führten wir eine funktionelle Annotation des Mikrobioms durch. Nach dem Aussortieren von Genen geringer Qualität wurden insgesamt 378.355 einzigartige Gene in allen Proben identifiziert. Die transformierte Häufigkeit dieser Gene wurde für eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) verwendet. Die Ergebnisse zeigten eine starke Clusterbildung der Probentypen basierend auf ihren funktionellen Profilen (Abbildung 4).
Abbildung 4. Ergebnisse der Hauptkomponentenanalyse (PCA) anhand des funktionellen Profils des Darmmikrobioms der Maus. Die PCA-Darstellung zeigt die Verteilung der Proben auf die ersten beiden Hauptkomponenten. Die Farben kennzeichnen den Probentyp: PPA-exponierte Mäuse sind violett, Kontrollmäuse gelb dargestellt. Die erste und zweite Hauptkomponente sind auf der x- bzw. y-Achse abgetragen und als Anteil der erklärten Varianz angegeben.
Anschließend untersuchten wir die Häufigkeit von KEGG-Knockouts in verschiedenen Probentypen. Insgesamt wurden 3648 einzigartige Knockouts identifiziert, von denen 196 in Kontrollproben und 106 in PPA-Proben signifikant häufiger vorkamen (Abbildung 5). Insgesamt wurden 145 Gene in Kontrollproben und 61 Gene in PPA-Proben mit signifikant unterschiedlicher Häufigkeit detektiert. Stoffwechselwege des Lipid- und Aminozuckerstoffwechsels waren in PPA-Proben signifikant stärker angereichert (Ergänzungstabelle 3). Stoffwechselwege des Stickstoffstoffwechsels und von Schwefel-Relay-Systemen waren in Kontrollproben signifikant stärker angereichert (Ergänzungstabelle 3). Die Häufigkeit von Genen des Aminozucker-/Nukleotidstoffwechsels (ko:K21279) und des Inositolphosphatstoffwechsels (ko:K07291) war in PPA-Proben signifikant höher (Abbildung 5). In den Kontrollproben waren signifikant mehr Gene vorhanden, die mit dem Benzoatstoffwechsel (ko:K22270), dem Stickstoffstoffwechsel (ko:K00368) und der Glykolyse/Gluconeogenese (ko:K00131) in Zusammenhang stehen ( Abbildung 5 ).
Abb. 5. Unterschiedliche Häufigkeit von KOs im Darmmikrobiom von PPA- und Kontrollmäusen. Das Volcano-Plot zeigt die Unterschiede in der Häufigkeit funktioneller Gruppen (KOs). Graue Punkte kennzeichnen KOs, deren Häufigkeit sich zwischen den Probentypen nicht signifikant unterschied (p-Wert > 0,05). Farbige Punkte zeigen signifikante Häufigkeitsunterschiede an (p-Wert ≤ 0,05). Die 20 KOs mit den größten Häufigkeitsunterschieden zwischen den Probentypen sind rot und hellblau dargestellt und entsprechen den Kontroll- bzw. PPA-Proben. Gelbe und violette Punkte kennzeichnen KOs, die in Kontroll- bzw. PPA-Proben mindestens 2,7-mal häufiger vorkamen. Schwarze Punkte kennzeichnen KOs mit signifikant unterschiedlicher Häufigkeit (mittlere CLR-Differenz zwischen -1 und 1). Die p-Werte wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test berechnet und mittels Benjamini-Hochberg-Prozedur für multiple Vergleiche korrigiert. NaN bedeutet, dass die KO keinem KEGG-Signalweg angehört. Fettgedruckte mittlere CLR-Differenzwerte kennzeichnen signifikante Häufigkeitsunterschiede. Detaillierte Informationen zu den Stoffwechselwegen, zu denen die aufgeführten KOs gehören, finden Sie in der ergänzenden Tabelle 3.
Unter den annotierten Genen zeigten 1601 Gene signifikant unterschiedliche Expressionsstärken zwischen den Probentypen (p ≤ 0,05), wobei jedes Gen mindestens 2,7-fach häufiger vorkam. Von diesen Genen waren 4 in den Kontrollproben und 1597 in den PPA-Proben häufiger. Da PPA antimikrobielle Eigenschaften besitzt, untersuchten wir die Expressionsstärke von Genen, die am PPA-Metabolismus und der PPA-Produktion beteiligt sind, zwischen den Probentypen. Von den 1332 Genen, die mit dem PPA-Metabolismus in Zusammenhang stehen, waren 27 in den Kontrollproben und 12 in den PPA-Proben signifikant häufiger. Von den 223 Genen, die mit der PPA-Produktion in Zusammenhang stehen, war 1 Gen in den PPA-Proben signifikant häufiger. Abbildung 6A verdeutlicht die höhere Expression von Genen, die am PPA-Metabolismus beteiligt sind, mit signifikant höherer Expression in den Kontrollproben und großen Effektstärken, während Abbildung 6B einzelne Gene mit signifikant höherer Expression in den PPA-Proben hervorhebt.
Abb. 6. Unterschiedliche Häufigkeit von PPA-bezogenen Genen im Darmmikrobiom der Maus. Vulkanplots zeigen die Unterschiede in der Häufigkeit von Genen, die mit dem PPA-Metabolismus (A) und der PPA-Produktion (B) assoziiert sind. Graue Punkte kennzeichnen Gene, deren Häufigkeit sich zwischen den Probentypen nicht signifikant unterschied (p-Wert > 0,05). Farbige Punkte zeigen signifikante Unterschiede in der Häufigkeit an (p-Wert ≤ 0,05). Die 20 Gene mit den größten Häufigkeitsunterschieden sind rot bzw. hellblau dargestellt (Kontroll- bzw. PPA-Proben). Die Häufigkeit gelber und violetter Punkte war in Kontroll- und PPA-Proben mindestens 2,7-mal höher als in Kontrollproben. Schwarze Punkte repräsentieren Gene mit signifikant unterschiedlicher Häufigkeit (mittlere CLR-Differenz zwischen -1 und 1). Die p-Werte wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test berechnet und mittels Benjamini-Hochberg-Korrektur für Mehrfachvergleiche korrigiert. Die Gene entsprechen repräsentativen Genen aus dem nicht-redundanten Genkatalog. Genbezeichnungen bestehen aus dem KEGG-Symbol für ein KO-Gen. Fettgedruckte mittlere CLR-Differenzen weisen auf signifikant unterschiedliche Häufigkeiten hin. Ein Bindestrich (-) bedeutet, dass für das Gen kein Symbol in der KEGG-Datenbank existiert.
Taxa mit Genen, die mit dem PPA-Stoffwechsel und/oder der PPA-Produktion in Zusammenhang stehen, wurden durch Abgleich der taxonomischen Identität der Contigs mit der Contig-ID des jeweiligen Gens identifiziert. Auf Gattungsebene wiesen 130 Gattungen Gene auf, die mit dem PPA-Stoffwechsel assoziiert sind, und 61 Gattungen, die Gene aufwiesen, die mit der PPA-Produktion in Zusammenhang stehen (Ergänzungstabelle 4). Es zeigten sich jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Häufigkeit zwischen den Gattungen (p > 0,05).
Auf Speziesebene wurden 144 Bakterienarten mit Genen identifiziert, die mit dem PPA-Stoffwechsel assoziiert sind, und 68 Bakterienarten mit Genen, die mit der PPA-Produktion assoziiert sind (Ergänzungstabelle 5). Unter den PPA-Metabolisierern zeigten acht Bakterien signifikante Häufigkeitszunahmen zwischen den Probentypen, und alle wiesen signifikante Veränderungen in ihrer Wirkung auf (Ergänzungstabelle 6). Alle identifizierten PPA-Metabolisierer mit signifikanten Häufigkeitsunterschieden waren in PPA-Proben häufiger vorhanden. Die Klassifizierung auf Speziesebene ergab Vertreter von Gattungen, die sich zwischen den Probentypen nicht signifikant unterschieden, darunter mehrere Bacteroides- und Ruminococcus-Arten sowie Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus und Alcaligenes polymorpha. Unter den PPA-produzierenden Bakterien zeigten vier Bakterien signifikante Häufigkeitsunterschiede zwischen den Probentypen. Zu diesen Arten gehörten Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis und Ruminococcus bovis.
In dieser Studie untersuchten wir die Auswirkungen einer PPA-Exposition auf die Darmmikrobiota von Mäusen. PPA kann unterschiedliche Reaktionen in Bakterien hervorrufen, da es von bestimmten Arten produziert, von anderen als Nahrungsquelle genutzt wird oder antimikrobielle Wirkungen besitzt. Daher kann seine Zufuhr in den Darm über Nahrungsergänzungsmittel je nach Toleranz, Empfindlichkeit und der Fähigkeit, es als Nährstoffquelle zu nutzen, unterschiedliche Auswirkungen haben. Empfindliche Bakterienarten können eliminiert und durch PPA-resistentere oder PPA-verwertbare Arten ersetzt werden, was zu Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota führt. Unsere Ergebnisse zeigten signifikante Unterschiede in der mikrobiellen Zusammensetzung, jedoch keine Auswirkungen auf die Gesamtdiversität der Mikroorganismen. Die größten Effekte wurden auf Artenebene beobachtet, wobei sich die Häufigkeit von über 70 Taxa zwischen PPA- und Kontrollproben signifikant unterschied (Ergänzungstabelle 2). Die weitere Analyse der Zusammensetzung PPA-exponierter Proben ergab eine größere Heterogenität der mikrobiellen Arten im Vergleich zu nicht exponierten Proben. Dies deutet darauf hin, dass PPA die bakteriellen Wachstumseigenschaften fördern und die Anzahl der Bakterienpopulationen, die in PPA-reichen Umgebungen überleben können, begrenzen könnte. Somit kann PPA selektiv Veränderungen hervorrufen, anstatt eine umfassende Störung der Darmmikrobiota-Diversität zu verursachen.
Lebensmittelkonservierungsstoffe wie PPA verändern nachweislich die Häufigkeit von Darmmikrobiomkomponenten, ohne die Gesamtdiversität zu beeinträchtigen (Nagpal et al., 2021). In der vorliegenden Studie beobachteten wir die auffälligsten Unterschiede zwischen den Bacteroidetes-Arten innerhalb des Stammes Bacteroidetes (früher bekannt als Bacteroidetes), die in PPA-exponierten Mäusen signifikant angereichert waren. Eine erhöhte Häufigkeit von Bacteroides-Arten ist mit einem verstärkten Schleimabbau verbunden, was das Infektionsrisiko erhöhen und Entzündungen fördern kann (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Eine Studie zeigte, dass neugeborene männliche Mäuse, die mit Bacteroides fragilis behandelt wurden, Sozialverhalten aufwiesen, das an Autismus-Spektrum-Störungen (ASS) erinnerte (Carmel et al., 2023). Andere Studien belegten, dass Bacteroides-Arten die Immunaktivität verändern und zu einer autoimmunen entzündlichen Kardiomyopathie führen können (Gil-Cruz et al., 2019). Arten der Gattungen Ruminococcus, Prevotella und Parabacteroides waren in Mäusen, die PPA ausgesetzt waren, ebenfalls signifikant erhöht (Coretti et al., 2018). Bestimmte Ruminococcus-Arten werden durch die Produktion proinflammatorischer Zytokine mit Erkrankungen wie Morbus Crohn in Verbindung gebracht (Henke et al., 2019), während Prevotella-Arten wie Prevotella humani mit Stoffwechselerkrankungen wie Bluthochdruck und Insulinresistenz assoziiert sind (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Schließlich stellten wir fest, dass das Verhältnis von Bacteroidetes (früher Firmicutes genannt) zu Bacteroidetes bei PPA-exponierten Mäusen aufgrund einer höheren Gesamthäufigkeit von Bacteroidetes-Arten signifikant niedriger war als bei Kontrollmäusen. Dieses Verhältnis gilt als wichtiger Indikator für die Darmhomöostase, und Störungen dieses Verhältnisses wurden mit verschiedenen Krankheitszuständen (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), einschließlich entzündlicher Darmerkrankungen (Stojanov et al., 2020), in Verbindung gebracht. Insgesamt scheinen Arten des Stammes Bacteroidetes am stärksten von einer erhöhten PPA-Zufuhr über die Nahrung betroffen zu sein. Dies könnte auf eine höhere Toleranz gegenüber PPA oder die Fähigkeit, PPA als Energiequelle zu nutzen, zurückzuführen sein, was für mindestens eine Art, Hoylesella enocea, nachgewiesen wurde (Hitch et al., 2022). Alternativ könnte eine PPA-Exposition der Mutter die fetale Entwicklung fördern, indem sie den Darm der Mäusenachkommen anfälliger für eine Besiedlung mit Bacteroidetes macht; eine solche Beurteilung war jedoch aufgrund unseres Studiendesigns nicht möglich.
Die metagenomische Inhaltsanalyse zeigte signifikante Unterschiede in der Häufigkeit von Genen, die mit dem PPA-Stoffwechsel und der PPA-Produktion assoziiert sind. PPA-exponierte Mäuse wiesen eine höhere Häufigkeit von Genen auf, die für die PPA-Produktion verantwortlich sind, während nicht-exponierte Mäuse eine höhere Häufigkeit von Genen zeigten, die für den PAA-Stoffwechsel verantwortlich sind (Abbildung 6). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Effekt von PPA auf die mikrobielle Zusammensetzung nicht allein auf dessen Verwendung zurückzuführen ist, da andernfalls die Häufigkeit von Genen, die mit dem PPA-Stoffwechsel assoziiert sind, im Darmmikrobiom PPA-exponierter Mäuse höher sein müsste. Eine Erklärung ist, dass PPA die Bakterienhäufigkeit primär durch seine antimikrobiellen Effekte und nicht durch seine Nutzung als Nährstoff durch Bakterien reguliert. Frühere Studien haben gezeigt, dass PPA das Wachstum von Salmonella Typhimurium dosisabhängig hemmt (Jacobson et al., 2018). Die Exposition gegenüber höheren PPA-Konzentrationen könnte Bakterien selektieren, die gegen seine antimikrobiellen Eigenschaften resistent sind und PPA möglicherweise nicht metabolisieren oder produzieren können. Beispielsweise zeigten mehrere Parabacteroides-Arten eine signifikant höhere Abundanz in PPA-Proben, jedoch wurden keine Gene nachgewiesen, die mit dem PPA-Stoffwechsel oder der PPA-Produktion in Zusammenhang stehen (Ergänzungstabellen 2, 4 und 5). Darüber hinaus ist die PPA-Produktion als Fermentationsnebenprodukt weit verbreitet bei verschiedenen Bakterien (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Die höhere bakterielle Diversität könnte die Ursache für die höhere Abundanz von Genen sein, die mit dem PPA-Stoffwechsel in Zusammenhang stehen, in den Kontrollproben (Averina et al., 2020). Weiterhin wurden nur 27 (2,14 %) von 1332 Genen als ausschließlich mit dem PPA-Stoffwechsel assoziiert vorhergesagt. Viele mit dem PPA-Stoffwechsel assoziierte Gene sind auch an anderen Stoffwechselwegen beteiligt. Dies belegt weiterhin, dass die Abundanz von Genen, die am PPA-Stoffwechsel beteiligt sind, in den Kontrollproben höher war; diese Gene könnten in Stoffwechselwegen aktiv sein, die nicht zur PPA-Verwertung oder -Bildung als Nebenprodukt führen. In diesem Fall zeigte nur ein Gen, das mit der PPA-Bildung assoziiert ist, signifikante Unterschiede in der Abundanz zwischen den Probentypen. Im Gegensatz zu Genen, die mit dem PPA-Stoffwechsel assoziiert sind, wurden Marker-Gene für die PPA-Produktion ausgewählt, da sie direkt am bakteriellen PPA-Produktionsweg beteiligt sind. Bei PPA-exponierten Mäusen aller Spezies wurde eine signifikant erhöhte PPA-Menge und -Produktionskapazität festgestellt. Dies stützt die Annahme, dass PPAs PPA-Produzenten selektieren und somit die PPA-Produktionskapazität erhöhen. Allerdings korreliert die Genhäufigkeit nicht zwangsläufig mit der Genexpression; so ist die Expressionsrate von Genen, die mit dem PPA-Stoffwechsel assoziiert sind, in Kontrollproben zwar höher, kann aber abweichen (Shi et al., 2014). Um den Zusammenhang zwischen der Prävalenz PPA-produzierender Gene und der PPA-Produktion zu bestätigen, sind Studien zur Expression von Genen, die an der PPA-Produktion beteiligt sind, erforderlich.
Die funktionelle Annotation der PPA- und Kontroll-Metagenome zeigte einige Unterschiede. Die PCA-Analyse des Geninhalts ergab diskrete Cluster zwischen PPA- und Kontrollproben (Abbildung 5). Die Clusteranalyse innerhalb der Proben zeigte, dass der Geninhalt der Kontrollproben diverser war, während die PPA-Proben einen gemeinsamen Cluster bildeten. Die Clusterung nach Geninhalt war vergleichbar mit der Clusterung nach Artenzusammensetzung. Unterschiede in der Häufigkeit von Stoffwechselwegen korrelieren somit mit Veränderungen in der Häufigkeit spezifischer Arten und Stämme innerhalb dieser Proben. In den PPA-Proben waren zwei Stoffwechselwege mit signifikant höherer Häufigkeit mit dem Aminozucker-/Nukleotidzuckerstoffwechsel (ko:K21279) und mehreren Lipidstoffwechselwegen (ko:K00647, ko:K03801; Ergänzungstabelle 3) assoziiert. Gene, die mit ko:K21279 assoziiert sind, gehören bekanntermaßen zur Gattung Bacteroides, einer der Gattungen mit einer signifikant höheren Artenzahl in den PPA-Proben. Dieses Enzym kann die Immunantwort durch die Expression von Kapselpolysacchariden umgehen (Wang et al., 2008). Dies könnte die Zunahme von Bacteroidetes in PPA-exponierten Mäusen erklären. Dies ergänzt die erhöhte Fettsäuresynthese im PPA-Mikrobiom. Bakterien nutzen den FASIIko:K00647 (fabB)-Stoffwechselweg zur Fettsäurenproduktion, was Auswirkungen auf die Stoffwechselwege des Wirts haben kann (Yao und Rock, 2015; Johnson et al., 2020). Veränderungen im Lipidstoffwechsel könnten wiederum eine Rolle in der neuronalen Entwicklung spielen (Yu et al., 2020). Ein weiterer Stoffwechselweg, der in PPA-Proben vermehrt auftrat, war die Steroidhormonbiosynthese (ko:K12343). Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass zwischen der Fähigkeit der Darmmikrobiota, den Hormonspiegel zu beeinflussen, und ihrer Beeinflussbarkeit durch Hormone eine inverse Beziehung besteht, sodass erhöhte Steroidspiegel gesundheitliche Folgen haben können (Tetel et al., 2018).
Diese Studie weist einige Einschränkungen und zu berücksichtigende Aspekte auf. Ein wichtiger Unterschied besteht darin, dass wir keine physiologischen Untersuchungen der Tiere durchgeführt haben. Daher lässt sich nicht direkt schlussfolgern, ob Veränderungen des Mikrobioms mit einer Erkrankung in Zusammenhang stehen. Zudem erhielten die Mäuse in dieser Studie die gleiche Nahrung wie ihre Mütter. Zukünftige Studien könnten klären, ob ein Wechsel von einer PPA-reichen zu einer PPA-freien Ernährung die Auswirkungen auf das Mikrobiom verbessert. Wie viele andere Studien hat auch unsere Studie eine begrenzte Stichprobengröße. Obwohl sich dennoch valide Schlussfolgerungen ziehen lassen, würde eine größere Stichprobe die statistische Aussagekraft der Ergebnisse erhöhen. Wir sind außerdem vorsichtig, Schlussfolgerungen über einen Zusammenhang zwischen Veränderungen des Darmmikrobioms und Erkrankungen zu ziehen (Yap et al., 2021). Störfaktoren wie Alter, Geschlecht und Ernährung können die Zusammensetzung der Mikroorganismen erheblich beeinflussen. Diese Faktoren könnten die in der Literatur beobachteten Inkonsistenzen hinsichtlich des Zusammenhangs zwischen Darmmikrobiom und komplexen Erkrankungen erklären (Johnson et al., 2019; Lagod und Naser, 2023). So wurde beispielsweise gezeigt, dass Mitglieder der Gattung Bacteroidetes bei Tieren und Menschen mit Autismus-Spektrum-Störung (ASS) sowohl vermehrt als auch vermindert vorkommen (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Ähnliche Ergebnisse zeigten Studien zur Darmzusammensetzung bei Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen, die sowohl Zunahmen als auch Abnahmen derselben Taxa feststellten (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Um den Einfluss geschlechtsspezifischer Verzerrungen zu minimieren, haben wir eine gleichberechtigte Repräsentation der Geschlechter angestrebt, sodass Unterschiede höchstwahrscheinlich auf die Ernährung zurückzuführen sind. Eine Herausforderung der funktionellen Annotation ist die Entfernung redundanter Gensequenzen. Unsere Genclustering-Methode erfordert 95 % Sequenzidentität und 85 % Längenähnlichkeit sowie eine Alignment-Abdeckung von 90 %, um Fehlclusterungen zu vermeiden. In einigen Fällen beobachteten wir jedoch COGs mit identischen Annotationen (z. B. MUT) (Abb. 6). Weitere Untersuchungen sind notwendig, um zu klären, ob diese Orthologe distinkt sind, bestimmten Gattungen zugeordnet werden oder ob dies eine Einschränkung des Genclustering-Ansatzes darstellt. Eine weitere Einschränkung der funktionellen Annotation ist die potenzielle Fehlklassifizierung: Das bakterielle Gen mmdA ist ein bekanntes Enzym der Propionatsynthese, wird aber von KEGG nicht dem Propionat-Stoffwechselweg zugeordnet. Im Gegensatz dazu sind die Orthologe scpB und mmcD verwandt. Die große Anzahl von Genen ohne gezielte Knockouts kann dazu führen, dass PPA-assoziierte Gene bei der Bestimmung der Genhäufigkeit nicht identifiziert werden können. Zukünftige Studien werden von der Metatranskriptomanalyse profitieren, die ein tieferes Verständnis der funktionellen Eigenschaften der Darmmikrobiota ermöglicht und die Genexpression mit potenziellen Folgeeffekten verknüpft. Für Studien zu spezifischen neurologischen Entwicklungsstörungen oder chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen sind physiologische und Verhaltensuntersuchungen an Tieren erforderlich, um Veränderungen in der Zusammensetzung des Mikrobioms mit diesen Erkrankungen in Verbindung zu bringen. Zusätzliche Studien, in denen das Darmmikrobiom in keimfreie Mäuse transplantiert wird, wären ebenfalls hilfreich, um festzustellen, ob das Mikrobiom ein Auslöser oder ein charakteristisches Merkmal der Erkrankung ist.
Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass PPA in der Nahrung die Zusammensetzung der Darmmikrobiota verändert. PPA ist ein von der FDA zugelassenes Konservierungsmittel, das in vielen Lebensmitteln vorkommt und bei langfristiger Exposition die normale Darmflora stören kann. Wir beobachteten Veränderungen in der Häufigkeit verschiedener Bakterien, was darauf hindeutet, dass PPA die Zusammensetzung der Darmmikrobiota beeinflussen kann. Veränderungen der Mikrobiota können wiederum Veränderungen in bestimmten Stoffwechselwegen und damit physiologische Veränderungen zur Folge haben, die für die Gesundheit des Wirtsorganismus relevant sind. Weitere Studien sind erforderlich, um zu klären, ob die Auswirkungen von PPA in der Nahrung auf die mikrobielle Zusammensetzung zu Dysbiose oder anderen Erkrankungen führen können. Diese Studie legt den Grundstein für zukünftige Untersuchungen darüber, wie sich die Auswirkungen von PPA auf die Darmzusammensetzung auf die menschliche Gesundheit auswirken können.
Die in dieser Studie präsentierten Datensätze sind in Online-Repositorien verfügbar. Name und Zugangsnummer des Repositories lauten: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Diese Tierstudie wurde von der Ethikkommission für Tierversuche der University of Central Florida (UCF-IACUC) genehmigt (Genehmigungsnummer für Tierversuche: PROTO202000002). Die Studie entspricht den geltenden Gesetzen, Bestimmungen und institutionellen Vorgaben.
NG: Konzeptualisierung, Datenaufbereitung, Formale Analyse, Untersuchung, Methodik, Software, Visualisierung, Verfassen des Originalentwurfs, Überarbeitung und Redaktion. LA: Konzeptualisierung, Datenaufbereitung, Methodik, Ressourcen, Überarbeitung und Redaktion. SH: Formale Analyse, Software, Überarbeitung und Redaktion. SA: Untersuchung, Überarbeitung und Redaktion. Hauptjuror: Untersuchung, Überarbeitung und Redaktion. SN: Konzeptualisierung, Projektleitung, Ressourcen, Betreuung, Überarbeitung und Redaktion. TA: Konzeptualisierung, Projektleitung, Betreuung, Überarbeitung und Redaktion.
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Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Propionsäure induziert Gliose und Neuroinflammation durch Regulation des PTEN/AKT-Signalwegs bei Autismus-Spektrum-Störungen. Scientific Reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Statistische Analyse von Kompositionsdaten. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Firmicutes/Bacteroidetes-Verhältnis als Risikofaktor für Brustkrebs. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Differenzielle Expressionsanalyse von Sequenzzähldaten. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, et al. (2013). Fäkale Mikrobiota und Metabolom bei Kindern mit Autismus und nicht näher spezifizierter tiefgreifender Entwicklungsstörung. PLoS ONE 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Bakterielle neurometabolische Charakteristika der Darmmikrobiota bei Kleinkindern mit Autismus-Spektrum-Störungen. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Das Mikrobiom als menschliches Organ. Clinical Microbiology and Infection 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Neue Erkenntnisse zur Physiologie propionsäureproduzierender Bakterien: Anaerotignum propionicum und Anaerotignum neopropionicum (ehemals Clostridium propionicum und Clostridium neopropionicum). Microorganisms 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Mütterliche Ernährung und fetale Entwicklung. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y. und Hochberg, J. (1995). Kontrolle der Falsch-Positiv-Rate: Ein praktischer und effizienter Ansatz für multiples Testen. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Veröffentlichungsdatum: 18. April 2025