Immunmodulatorische Metabolite sind ein zentrales Merkmal der Tumormikroumgebung (TME), doch ihre genaue Zusammensetzung ist – bis auf wenige Ausnahmen – weitgehend unbekannt. In dieser Studie analysierten wir Tumoren und T-Zellen aus Tumoren und Aszitesflüssigkeit von Patientinnen mit hochgradigem serösem Karzinom (HGSC), um das Metabolom dieser verschiedenen TME-Kompartimente zu entschlüsseln. Aszitesflüssigkeit und Tumorzellen weisen deutliche Unterschiede in ihrem Metabolom auf. Im Vergleich zur Aszitesflüssigkeit sind die tumorinfiltrierenden T-Zellen signifikant mit 1-Methylnicotinamid (MNA) angereichert. Obwohl der MNA-Spiegel in T-Zellen erhöht ist, beschränkt sich die Expression der Nicotinamid-N-Methyltransferase (ein Enzym, das die Übertragung von Methylgruppen von S-Adenosylmethionin auf Nicotinamid katalysiert) auf Fibroblasten und Tumorzellen. Funktionell induziert MNA die Sekretion des tumorfördernden Zytokins Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) durch T-Zellen. Daher trägt das aus der Tumormikroumgebung stammende MNA zur Immunregulation von T-Zellen bei und stellt ein potenzielles Ziel für die Immuntherapie bei der Behandlung von Krebs beim Menschen dar.
Tumormetaboliten können die Antitumorimmunität stark hemmen, und es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass sie auch eine wichtige Triebkraft für die Krankheitsprogression darstellen können (1). Neben dem Warburg-Effekt charakterisieren neuere Arbeiten den Stoffwechselzustand von Tumorzellen und dessen Beziehung zum Immunstatus der Tumormikroumgebung (TME). Studien an Mausmodellen und humanen T-Zellen haben gezeigt, dass der Glutaminstoffwechsel (2), der oxidative Stoffwechsel (3) und der Glukosestoffwechsel (4) unabhängig voneinander auf verschiedene Immunzellsubgruppen wirken können. Mehrere Metaboliten dieser Stoffwechselwege hemmen die Antitumorfunktion von T-Zellen. Es ist nachgewiesen, dass die Blockade des Coenzyms Tetrahydrobiopterin (BH4) die Proliferation von T-Zellen beeinträchtigen kann und dass ein Anstieg des BH4-Spiegels im Körper die durch CD4 und CD8 vermittelte Antitumor-Immunantwort verstärkt. Darüber hinaus kann die immunsuppressive Wirkung von Kynurenin durch die Gabe von BH4 aufgehoben werden (5). Bei Glioblastomen mit Mutationen der Isocitratdehydrogenase (IDH) hemmt die Sekretion von enantiometabolischem (R)-2-Hydroxyglutarat (R-2-HG) die Aktivierung, Proliferation und zytolytische Aktivität von T-Zellen (6). Kürzlich wurde gezeigt, dass Methylglyoxal, ein Nebenprodukt der Glykolyse, von Suppressorzellen myeloiden Ursprungs produziert wird und dass die Übertragung von Methylglyoxal auf T-Zellen die Funktion von Effektor-T-Zellen hemmen kann. In der Therapie kann die Neutralisierung von Methylglyoxal die Aktivität myeloischer Suppressorzellen (MDSC) aufheben und die Checkpoint-Blockade-Therapie in Mausmodellen synergistisch verstärken (7). Diese Studien unterstreichen zusammenfassend die Schlüsselrolle von aus der Tumormikroumgebung stammenden Metaboliten bei der Regulation der T-Zell-Funktion und -Aktivität.
Eine Funktionsstörung der T-Zellen wurde bei Eierstockkrebs häufig beschrieben (8). Dies ist teilweise auf die mit Hypoxie und der abnormalen Tumorvaskulatur einhergehenden metabolischen Eigenschaften zurückzuführen (9), die zur Umwandlung von Glukose und Tryptophan in Nebenprodukte wie Milchsäure und Kynurenin führen. Überschüssiges extrazelluläres Laktat reduziert die Produktion von Interferon-γ (IFN-γ) und fördert die Differenzierung myelosuppressiver Subgruppen (10, 11). Der Verbrauch von Tryptophan hemmt direkt die T-Zell-Proliferation und die Signalübertragung des T-Zell-Rezeptors (12–14). Trotz dieser Erkenntnisse wurden viele Arbeiten zum Immunstoffwechsel in vitro in T-Zellkulturen mit optimierten Medien durchgeführt oder beschränkten sich auf homologe Mausmodelle in vivo. Beide Ansätze bilden die Heterogenität menschlicher Tumoren und die physiologische Makro- und Mikroumgebung nicht vollständig ab.
Ein häufiges Merkmal von Eierstockkrebs ist die Ausbreitung ins Peritoneum und das Auftreten von Aszites. Die Ansammlung von Zellflüssigkeit im Aszites ist mit einem fortgeschrittenen Krankheitsstadium und einer schlechten Prognose assoziiert (15). Berichten zufolge ist dieses spezielle Kompartiment hypoxisch, weist hohe Konzentrationen an vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) und Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) auf und ist von regulatorischen T-Zellen und myeloiden inhibitorischen Zellen infiltriert (15–18). Das metabolische Milieu des Aszites kann sich von dem des Tumors selbst unterscheiden, weshalb die Reprogrammierung von T-Zellen im Peritonealraum noch nicht vollständig geklärt ist. Darüber hinaus könnten die wesentlichen Unterschiede und die Heterogenität zwischen Aszites und den im Tumormikromilieu vorhandenen Metaboliten die Infiltration von Immunzellen und deren Funktion im Tumor behindern. Weitere Forschung ist daher erforderlich.
Um diese Probleme zu lösen, entwickelten wir eine sensitive Methode zur Zellseparation und Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), mit der sich verschiedene Zelltypen (einschließlich CD4+ und CD8+ T-Zellen) sowie innerhalb und zwischen Tumoren untersuchen lassen. Die dabei nachgewiesenen Metaboliten finden sich in Zellen des gleichen Aszites- und Tumormilieus der Patientin. Wir kombinieren diese Methode mit hochdimensionaler Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq), um ein hochauflösendes Bild des metabolischen Status dieser wichtigen Zellpopulationen zu erhalten. Die Methode zeigte einen signifikanten Anstieg des 1-Methylnicotinamid-Spiegels (MNA) in Tumor-T-Zellen. In-vitro-Experimente belegten zudem die bisher unbekannte immunmodulatorische Wirkung von MNA auf die T-Zell-Funktion. Insgesamt deckt diese Methode die wechselseitigen metabolischen Interaktionen zwischen Tumoren und Immunzellen auf und liefert einzigartige Einblicke in immunregulatorische Metaboliten. Diese Erkenntnisse könnten für die Behandlung von Eierstockkrebs mittels T-Zell-basierter Immuntherapie von Nutzen sein.
Wir verwendeten hochdimensionale Durchflusszytometrie zur simultanen Quantifizierung der Glukoseaufnahme [2-(N-(7-Nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-desoxyglukose (2-NBDG)] und der mitochondrialen Aktivität [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20). Diese Marker dienen als typische Marker zur Unterscheidung von Immunzellen und Tumorzellen (Tabelle S2 und Abbildung S1A). Die Analyse zeigte, dass Aszites- und Tumorzellen im Vergleich zu T-Zellen eine höhere Glukoseaufnahme aufweisen, jedoch geringere Unterschiede in der mitochondrialen Aktivität zeigen. Die durchschnittliche Glukoseaufnahme von Tumorzellen [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ist drei- bis viermal so hoch wie die von T-Zellen, und die durchschnittliche Glukoseaufnahme von CD4+ T-Zellen ist 1,2-mal so hoch wie die von CD8+ T-Zellen. Dies deutet darauf hin, dass tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL) selbst im gleichen Tumormikromilieu (TME) unterschiedliche metabolische Anforderungen haben (Abbildung 1A). Im Gegensatz dazu ähnelt die mitochondriale Aktivität in Tumorzellen derjenigen von CD4+ T-Zellen, und die mitochondriale Aktivität beider Zelltypen ist höher als die von CD8+ T-Zellen (Abbildung 1B). Diese Ergebnisse verdeutlichen den allgemeinen Stoffwechselstatus. Die metabolische Aktivität von Tumorzellen ist höher als die von CD4+ T-Zellen, und die metabolische Aktivität von CD4+ T-Zellen ist höher als die von CD8+ T-Zellen. Trotz dieser Unterschiede zwischen den Zelltypen besteht kein konsistenter Unterschied im metabolischen Status von CD4+ und CD8+ T-Zellen oder deren relativen Anteilen im Aszites im Vergleich zu Tumoren (Abbildung 1C). Im Gegensatz dazu war in der CD45-Zellfraktion der Anteil an EpCAM+-Zellen im Tumor im Vergleich zum Aszites erhöht (Abbildung 1D). Wir beobachteten außerdem einen deutlichen metabolischen Unterschied zwischen EpCAM+- und EpCAM--Zellkomponenten. EpCAM+ (Tumorzellen) weisen eine höhere Glukoseaufnahme und mitochondriale Aktivität auf als EpCAM- Zellen, die wesentlich höher ist als die metabolische Aktivität von Fibroblasten in Tumorzellen im TME (Abbildung 1, E und F).
(A und B) Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der Glukoseaufnahme (2-NBDG) (A) und mitochondriale Aktivität von CD4+ T-Zellen (MitoTracker dunkelrot) (B). Repräsentative Diagramme (links) und tabellarische Daten (rechts) für CD8+ T-Zellen und EpCAM+CD45- Tumorzellen aus Aszites und Tumor. (C) Verhältnis von CD4+ und CD8+ Zellen (von CD3+ T-Zellen) in Aszites und Tumor. (D) Anteil EpCAM+ Tumorzellen in Aszites und Tumor (CD45−). (E und F) Repräsentative Diagramme (links) und tabellarische Daten (rechts) für die Glukoseaufnahme (2-NBDG) von EpCAM+CD45- Tumorzellen und EpCAM-CD45- Matrixzellen (E) und mitochondriale Aktivität (MitoTracker dunkelrot) (F) aus Aszites und Tumorzellen. (G) Repräsentative Diagramme der CD25-, CD137- und PD1-Expression mittels Durchflusszytometrie. (H und I) Expression von CD25, CD137 und PD1 auf CD4+ T-Zellen (H) und CD8+ T-Zellen (I). (J und K) Phänotypen naiver, zentraler Gedächtnis- (Tcm), Effektor- (Teff) und Effektor-Gedächtnis- (Tem) T-Zellen basierend auf der Expression von CCR7 und CD45RO. Repräsentative Bilder (links) und tabellarische Daten (rechts) von CD4+ T-Zellen (J) und CD8+ T-Zellen (K) in Aszites und Tumoren. Die p-Werte wurden mittels gepaartem t-Test ermittelt (*p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001). Die Linie repräsentiert die Daten von jeweils sechs gepaarten Patienten. FMO: Fluoreszenz minus eins; MFI: mittlere Fluoreszenzintensität.
Weiterführende Analysen zeigten weitere signifikante Unterschiede im hochauflösenden Phänotyp der T-Zellen. Aktivierte (Abb. 1, G bis I) und Effektor-Gedächtnis-T-Zellen (Abb. 1, J und K) sind in Tumoren deutlich häufiger als im Aszites (Anteil der CD3+ T-Zellen). Die Analyse des Phänotyps anhand der Expression von Aktivierungsmarkern (CD25 und CD137) und Depletionsmarkern [Programmed Cell Death Protein 1 (PD-1)] ergab, dass sich die metabolischen Eigenschaften dieser Populationen zwar unterscheiden (Abb. S1, B bis E), jedoch keine signifikanten metabolischen Unterschiede zwischen naiven, Effektor- oder Gedächtnis-Subpopulationen konsistent beobachtet wurden (Abb. S1, F bis I). Diese Ergebnisse wurden durch maschinelles Lernen zur automatischen Zuordnung von Zellphänotypen bestätigt (21). Dabei zeigte sich zudem das Vorhandensein einer großen Anzahl von Knochenmarkzellen (CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+) im Aszites des Patienten (Abb. S2A). Unter allen identifizierten Zelltypen wies diese myeloide Zellpopulation die höchste Glukoseaufnahme und mitochondriale Aktivität auf (Abbildung S2, B bis G). Diese Ergebnisse unterstreichen die deutlichen metabolischen Unterschiede zwischen den verschiedenen Zelltypen in Aszitesflüssigkeit und Tumoren von Patientinnen mit HGSC.
Die größte Herausforderung beim Verständnis der metabolomischen Eigenschaften von TIL besteht darin, T-Zellproben von ausreichender Reinheit, Qualität und Quantität aus Tumoren zu isolieren. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Sortierungs- und Bead-Anreicherungsmethoden auf Basis der Durchflusszytometrie zu Veränderungen der zellulären Metabolitprofile führen können (22–24). Um dieses Problem zu beheben, optimierten wir die Bead-Anreicherungsmethode zur Isolierung von TIL aus chirurgisch entferntem menschlichem Ovarialkarzinom vor der Analyse mittels LC-MS/MS (siehe Material und Methoden; Abb. 2A). Um die Gesamtauswirkungen dieses Protokolls auf die Metabolitveränderungen zu beurteilen, verglichen wir die Metabolitprofile von T-Zellen, die von gesunden Spendern nach der Bead-Separation aktiviert wurden, mit denen von Zellen, die nicht Bead-separiert, sondern auf Eis gelagert wurden. Diese Qualitätskontrollanalyse ergab eine hohe Korrelation zwischen den beiden Bedingungen (r = 0,77) und eine hohe technische Reproduzierbarkeit der 86 Metaboliten (Abb. 2B). Daher können diese Methoden eine genaue Metabolitenanalyse in Zellen durchführen, die einer Zelltyp-Anreicherung unterzogen werden, und bieten somit die erste hochauflösende Plattform zur Identifizierung spezifischer Metaboliten in HGSC, wodurch es den Menschen ermöglicht wird, ein tieferes Verständnis des zellspezifischen sexuellen Stoffwechselprogramms zu erlangen.
(A) Schematische Darstellung der Anreicherung mittels magnetischer Beads. Vor der Analyse mittels LC-MS/MS werden die Zellen drei aufeinanderfolgenden Anreicherungszyklen mit magnetischen Beads unterzogen oder auf Eis gelagert. (B) Einfluss der Anreicherungsart auf die Metabolitenkonzentration. Mittelwert aus drei Messungen pro Anreicherungsart ± Standardfehler. Die graue Linie stellt ein 1:1-Verhältnis dar. Die Intraklassenkorrelation (ICC) wiederholter Messungen ist in der Achsenbeschriftung angegeben. NAD, Nicotinamidadenindinukleotid. (C) Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs der Patientenmetabolitenanalyse. Aszites oder Tumoren werden von Patienten entnommen und kryokonserviert. Ein kleiner Teil jeder Probe wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert, während die restlichen Proben drei Anreicherungszyklen für CD4+-, CD8+- und CD45--Zellen durchliefen. Diese Zellfraktionen wurden mittels LC-MS/MS analysiert. (D) Heatmap der standardisierten Metabolitenkonzentration. Das Dendrogramm zeigt die Ward-Clusteranalyse der euklidischen Distanzen zwischen den Proben. (E) Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Metabolitenkarte der Probe, dargestellt sind drei Replikate jeder Probe. Proben desselben Patienten sind durch eine Linie verbunden. (F) Die PCA des Metabolitenprofils der Probe, konditioniert auf den Patienten (d. h. unter Verwendung partieller Redundanz); der Probentyp ist durch die konvexe Hülle begrenzt. PC1, erste Hauptkomponente; PC2, zweite Hauptkomponente.
Anschließend analysierten wir mithilfe dieser Anreicherungsmethode 99 Metabolite in den CD4+-, CD8+- und CD45--Zellfraktionen des primären Aszites und der Tumoren von sechs HGSC-Patientinnen (Abb. 2C, Abb. S3A und Tab. S3 und S4). Die untersuchte Zellpopulation machte 2 % bis 70 % der ursprünglichen großen Probe lebender Zellen aus, wobei der Anteil zwischen den Patientinnen stark variierte. Nach der Trennung der Beads umfasste die angereicherte Fraktion (CD4+, CD8+ oder CD45-) im Durchschnitt mehr als 85 % aller lebenden Zellen in der Probe. Diese Anreicherungsmethode ermöglicht die Analyse von Zellpopulationen aus dem Stoffwechsel menschlichen Tumorgewebes, was bei großen Proben nicht möglich ist. Mithilfe dieses Protokolls stellten wir fest, dass L-Kynurenin und Adenosin, zwei gut charakterisierte immunsuppressive Metaboliten, in Tumor-T-Zellen bzw. Tumorzellen erhöht waren (Abb. S3, B und C). Diese Ergebnisse demonstrieren somit die Genauigkeit und Leistungsfähigkeit unserer Zellseparations- und Massenspektrometrie-Technologie zur Identifizierung biologisch wichtiger Metaboliten in Patientengeweben.
Unsere Analyse zeigte zudem eine deutliche metabolische Trennung der Zelltypen innerhalb und zwischen den Patienten (Abbildung 2D und Abbildung S4A). Insbesondere Patient 70 wies im Vergleich zu anderen Patienten abweichende metabolische Merkmale auf (Abbildung 2E und Abbildung S4B), was auf eine erhebliche metabolische Heterogenität zwischen den Patienten hindeutet. Bemerkenswert ist, dass die Gesamtmenge des bei Patient 70 gesammelten Aszites (80 ml) im Vergleich zu den anderen Patienten (1,2 bis 2 Liter; Tabelle S1) geringer war. Die Kontrolle der interindividuellen Heterogenität während der Hauptkomponentenanalyse (z. B. mittels partieller Redundanzanalyse) zeigte konsistente Veränderungen zwischen den Zelltypen, und die Zelltypen bzw. die Mikroumgebung ließen sich anhand des Metabolitenprofils klar gruppieren (Abbildung 2F). Die Analyse einzelner Metaboliten unterstrich diese Effekte und deckte signifikante Unterschiede zwischen Zelltypen und Mikroumgebung auf. Besonders hervorzuheben ist der extremste Unterschied bei MNA, das üblicherweise in CD45- Zellen sowie in den Tumor infiltrierenden CD4+- und CD8+-Zellen angereichert ist (Abbildung 3A). Bei CD4+-Zellen ist dieser Effekt am deutlichsten ausgeprägt, und auch die MNA in CD8+-Zellen scheint stark von der Umgebung beeinflusst zu werden. Dies ist jedoch nicht relevant, da nur bei drei der sechs Patienten die CD8+-Tumorwerte bestimmt werden konnten. Neben der MNA weisen verschiedene Zelltypen in Aszites und Tumoren auch andere, in TIL bisher wenig charakterisierte Metaboliten unterschiedliche Konzentrationen auf (Abbildungen S3 und S4). Diese Daten zeigen somit ein vielversprechendes Spektrum immunmodulatorischer Metaboliten für weitere Untersuchungen.
(A) Normalisierter MNA-Gehalt in CD4+, CD8+ und CD45- Zellen aus Aszites und Tumor. Der Boxplot zeigt den Median (Linie), den Interquartilsabstand (Rahmenscharnier) und die Spannweite bis zum 1,5-Fachen des Interquartilsabstands (Rahmenwhisker). Wie in „Patientenmaterial und -methoden“ beschrieben, wird der limma-Wert des Patienten zur Bestimmung des p-Werts verwendet (*p < 0,05 und **p < 0,01). (B) Schematische Darstellung des MNA-Metabolismus (60). Metaboliten: S-Adenosyl-1-methionin; SAH, S-Adenosin-1-homocystein; NA, Nicotinamid; MNA, 1-Methylnicotinamid; 2-PY, 1-Methyl-2-pyridon-5-carboxamid; 4-PY, 1-Methyl-4-pyridon-5-carboxamid; NR, Nicotinamidribose; NMN, Nicotinamidmononukleotid. Enzyme (grün): NNMT, Nicotinamid-N-Methyltransferase; SIRT, Sirtuine; NAMPT, Nicotinamid-Phosphoribosyltransferase; AOX1, Aldehydoxidase 1; NRK, Nicotinamid-Ribosidkinase; NMNAT, Nicotinamid-Mononukleotid-Adenylattransferase; Pnp1, Purinnukleosid-Phosphorylase. (C) t-SNE von scRNA-seq aus Aszites (grau) und Tumor (rot; n = 3 Patienten). (D) NNMT-Expression in verschiedenen Zellpopulationen, identifiziert mittels scRNA-seq. (E) Expression von NNMT und AOX1 in SK-OV-3-, humanen embryonalen Nierenzellen (HEK 293T), T-Zellen und MNA-behandelten T-Zellen. Die relative Expression ist im Vergleich zu SK-OV-3 dargestellt. Das Expressionsmuster mit Standardfehler des Mittelwerts (SEM) ist abgebildet (n = 6 gesunde Spender). Ct-Werte über 35 gelten als nicht nachweisbar (UD). (F) Expression von SLC22A1 und SLC22A2 in SK-OV-3-, HEK293T- und T-Zellen sowie in mit 8 mM MNA behandelten T-Zellen. Die relative Expression ist im Vergleich zu SK-OV-3 dargestellt. Das Expressionsmuster mit Standardfehler des Mittelwerts (SEM) ist abgebildet (n = 6 gesunde Spender). Ct-Werte über 35 gelten als nicht nachweisbar (UD). (G) MNA-Gehalt aktivierter T-Zellen gesunder Spender nach 72-stündiger Inkubation mit MNA. Das Expressionsmuster mit Standardfehler des Mittelwerts (SEM) ist abgebildet (n = 4 gesunde Spender).
MNA entsteht durch die Übertragung einer Methylgruppe von S-Adenosyl-1-methionin (SAM) auf Nicotinamid (NA) mittels Nicotinamid-N-Methyltransferase (NNMT; Abb. 3B). NNMT ist in verschiedenen humanen Krebsarten überexprimiert und mit Proliferation, Invasion und Metastasierung assoziiert (25–27). Um die Quelle von MNA in T-Zellen im Tumormikromilieu (TME) besser zu verstehen, charakterisierten wir die NNMT-Expression in verschiedenen Zelltypen im Aszites und in Tumoren von drei Patientinnen mit hochgradigem serösem Ovarialkarzinom (HGSC) mittels Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) (Tab. S5). Die Analyse von ca. 6.500 Zellen zeigte, dass die NNMT-Expression im Aszites und im Tumormikromilieu auf die mutmaßlichen Fibroblasten- und Tumorzellpopulationen beschränkt war (Abb. 3C und D). Es ist bemerkenswert, dass in keiner der PTPRC-exprimierenden (CD45+) Zellpopulationen eine NNMT-Expression nachweisbar ist (Abb. 3D und Abb. S5A). Dies deutet darauf hin, dass das im Metabolitenspektrum detektierte MNA in T-Zellen eingeschleust wurde. Die Expression der Aldehydoxidase 1 (AOX1), die MNA in 1-Methyl-2-pyridon-5-carboxamid (2-PYR) oder 1-Methyl-4-pyridon-5-carboxamid (4-PYR) umwandelt (Abb. 3B), ist ebenfalls auf die COL1A1-exprimierende Fibroblastenpopulation beschränkt (Abb. S5A). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass T-Zellen nicht über die Fähigkeit zum konventionellen MNA-Metabolismus verfügen. Das Expressionsmuster dieser MNA-bezogenen Gene wurde anhand eines zweiten unabhängigen Datensatzes aus Aszites von HGSC-Patientinnen verifiziert (Abb. S5B; n = 6) (16). Darüber hinaus zeigte die quantitative Polymerasekettenreaktion (qPCR) von mit MNA behandelten T-Zellen gesunder Spender, dass NNMT und AOX1 im Vergleich zu den Kontrollzellen (SK-OV-3-Ovarialtumorzellen) nahezu nicht exprimiert wurden (Abbildung 3E). Diese unerwarteten Ergebnisse deuten darauf hin, dass MNA von Fibroblasten oder Tumoren in benachbarte T-Zellen im Tumormikromilieu sezerniert werden könnte.
Obwohl die organischen Kationentransporter 1 bis 3 (OCT1, OCT2 und OCT3), kodiert durch die Familie der löslichen Carrier 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 und SLC22A3), zu den Kandidaten gehören, sind die potenziellen Transporter von MNA weiterhin unbekannt (28). Die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) von mRNA aus T-Zellen gesunder Spender zeigte niedrige Expressionsniveaus von SLC22A1, aber nicht nachweisbare Mengen von SLC22A2, was frühere Literaturangaben bestätigte (Abbildung 3F) (29). Im Gegensatz dazu exprimierte die Ovarialtumorzelllinie SK-OV-3 hohe Mengen beider Transporter (Abbildung 3F).
Um zu untersuchen, ob T-Zellen fremdes MNA aufnehmen können, wurden gesunde Spender-T-Zellen 72 Stunden lang in Gegenwart verschiedener MNA-Konzentrationen kultiviert. Ohne exogenes MNA war der zelluläre MNA-Gehalt nicht nachweisbar (Abbildung 3G). Aktivierte T-Zellen, die mit exogenem MNA behandelt wurden, zeigten jedoch einen dosisabhängigen Anstieg des MNA-Gehalts bis zu einer Konzentration von 6 mM MNA (Abbildung 3G). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass TIL trotz geringer Expression des Transporters und Fehlens des Hauptenzyms für den intrazellulären MNA-Metabolismus MNA aufnehmen können.
Das Spektrum der Metaboliten in den T-Zellen von Patienten und In-vitro-Absorptionsexperimente mit MNA erhöhen die Wahrscheinlichkeit, dass tumorassoziierte Fibroblasten (CAF) MNA sezernieren und Tumorzellen den Phänotyp und die Funktion von TIL regulieren. Um die Wirkung von MNA auf T-Zellen zu bestimmen, wurden gesunde Spender-T-Zellen in vitro mit und ohne MNA aktiviert und ihre Proliferation sowie Zytokinproduktion untersucht. Nach 7 Tagen Zugabe von MNA in der höchsten Dosis war die Populationsverdopplungsrate moderat reduziert, während die Vitalität bei allen Dosen erhalten blieb (Abbildung 4A). Darüber hinaus führte die Behandlung mit exogenem MNA zu einem Anstieg des Anteils von CD4+- und CD8+-T-Zellen, die Tumornekrosefaktor-α (TNFα) exprimierten (Abbildung 4B). Im Gegensatz dazu war die intrazelluläre Produktion von IFN-γ in CD4+-T-Zellen signifikant reduziert, nicht aber in CD8+-T-Zellen, und es zeigte sich keine signifikante Veränderung von Interleukin 2 (IL-2) (Abbildung 4C und D). Daher zeigte der ELISA-Test der Überstände dieser mit MNA behandelten T-Zellkulturen einen signifikanten Anstieg von TNFα, einen Abfall von IFN-γ und keine Veränderung von IL-2 (Abbildung 4, E bis G). Der Abfall von IFN-γ deutet darauf hin, dass MNA die Antitumoraktivität von T-Zellen hemmen könnte. Um den Effekt von MNA auf die T-Zell-vermittelte Zytotoxizität zu simulieren, wurden chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen (FRα-CAR-T-Zellen), die gegen den Folatrezeptor α gerichtet sind, sowie GFP-CAR-T-Zellen (CAR-T-Zellen), die durch grünes Fluoreszenzprotein (GFP) reguliert werden, aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) gesunder Spender hergestellt. Die CAR-T-Zellen wurden 24 Stunden lang in Gegenwart von MNA kultiviert und anschließend mit humanen SK-OV-3-Ovarialtumorzellen, die den Folatrezeptor α exprimieren, im Verhältnis 10:1 (Effektor:Ziel) kokultiviert. Die Behandlung mit MNA führte zu einer signifikanten Verringerung der Abtötungsaktivität der FRα-CAR-T-Zellen, die der von mit Adenosin behandelten FRα-CAR-T-Zellen ähnelte (Abbildung 4H).
(A) Gesamtzellzahl und Populationsverdopplung (PD) direkt aus der Kultur an Tag 7. Das Balkendiagramm zeigt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) von sechs gesunden Spendern. Die Daten stammen aus mindestens n = 3 unabhängigen Experimenten. (B bis D) CD3/CD28 und IL-2 wurden zur Aktivierung von T-Zellen in den jeweiligen MNA-Konzentrationen über 7 Tage verwendet. Vor der Analyse wurden die Zellen 4 Stunden lang mit PMA/Ionomycin und GolgiStop stimuliert. TNFα (B) Expression in T-Zellen. Beispielbild (links) und tabellarische Daten (rechts) zur TNFα-Expression in lebenden Zellen. IFN-γ (C) und IL-2 (D) Expression in T-Zellen. Die Zytokin-Expression wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen. Das Balkendiagramm zeigt den Mittelwert (n = 6 gesunde Spender) ± SEM. Der p-Wert wurde mittels einfaktorieller Varianzanalyse mit Messwiederholung bestimmt (*P<0,05 und **P<0,01). Die Daten stammen aus mindestens n = 3 unabhängigen Experimenten. (E bis G) CD3/CD28 und IL-2 wurden zur Aktivierung von T-Zellen in den jeweiligen MNA-Konzentrationen über 7 Tage verwendet. Das Medium wurde vor und nach 4-stündiger PMA/Ionomycin-Stimulation entnommen. Die Konzentrationen von TNFα (E), IFN-γ (F) und IL-2 (G) wurden mittels ELISA bestimmt. Das Balkendiagramm zeigt den Mittelwert (n = 5 gesunde Spender) ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Der p-Wert wurde mittels einfaktorieller Varianzanalyse mit Messwiederholung ermittelt (*p < 0,05). Die gestrichelte Linie markiert die Nachweisgrenze. (H) Zelllyse-Assay. FRα-CAR-T- oder GFP-CAR-T-Zellen wurden 24 Stunden lang mit Adenosin (250 μM) oder MNA (10 mM) behandelt oder unbehandelt gelassen (Ctrl). Die prozentuale Abtötung von SK-OV-3-Zellen wurde gemessen. Der p-Wert wurde mittels Welch-t-Test ermittelt (*P<0,5 und **P<0,01).
Um die Mechanismen der MNA-abhängigen TNFα-Expressionsregulation zu verstehen, wurden die Veränderungen der TNFα-mRNA in MNA-behandelten T-Zellen untersucht (Abbildung 5A). T-Zellen gesunder Spender, die mit MNA behandelt wurden, zeigten einen zweifachen Anstieg der TNFα-Transkriptionsniveaus, was darauf hindeutet, dass MNA von der transkriptionellen Regulation von TNFα abhängig ist. Um diesen möglichen Regulationsmechanismus zu untersuchen, wurden zwei bekannte Transkriptionsfaktoren, die TNFα regulieren – der aktivierte T-Zell-Nuklearfaktor (NFAT) und das spezifische Protein 1 (Sp1) –, nach Bindung von MNA an den proximalen TNFα-Promotor analysiert (30). Der TNFα-Promotor enthält sechs identifizierte NFAT-Bindungsstellen und zwei Sp1-Bindungsstellen, die sich an einer Stelle [-55 Basenpaare (bp) vom 5'-Cap entfernt] überlappen (30). Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) zeigte, dass die Bindung von Sp1 an den TNFα-Promotor nach Behandlung mit MNA um das Dreifache anstieg. Die Einbindung von NFAT nahm ebenfalls zu und erreichte eine bedeutende Rolle (Abbildung 5B). Diese Daten deuten darauf hin, dass MNA die Expression von TNFα über die Sp1-Transkription und in geringerem Maße die Expression von NFAT reguliert.
(A) Im Vergleich zu T-Zellen, die ohne MNA kultiviert wurden, ist die relative Änderung der TNFα-Expression in mit MNA behandelten T-Zellen dargestellt. Das Expressionsmuster mit Standardfehler des Mittelwerts (SEM) ist abgebildet (n = 5 gesunde Spender). Die Daten stammen aus mindestens n = 3 unabhängigen Experimenten. (B) Der TNFα-Promotor von T-Zellen, die mit oder ohne 8 mM MNA behandelt wurden, wurde nach 4-stündiger Stimulation mit NFAT und Sp1 (Ctrl) bzw. PMA/Ionomycin untersucht. Immunglobulin G (IgG) und H3 dienten als negative bzw. positive Kontrollen für die Immunpräzipitation. Die ChIP-Quantifizierung zeigte, dass die Bindung von Sp1 und NFAT an den TNFα-Promotor in MNA-behandelten Zellen im Vergleich zur Kontrolle um ein Vielfaches erhöht war. Die Daten stammen aus mindestens n = 3 unabhängigen Experimenten. Der p-Wert wurde mittels multipler t-Tests ermittelt (*** p < 0,01). (C) Im Vergleich zum Aszites von HGSC zeigten T-Zellen (nicht-zytotoxisch) eine erhöhte TNF-Expression im Tumor. Die Farben repräsentieren verschiedene Patientinnen. Die dargestellten Zellen wurden zufällig auf 300 Zellen begrenzt und leicht verschoben, um ein Überzeichnen zu vermeiden (** Padj = 0,0076). (D) Vorgeschlagenes Modell von MNA bei Eierstockkrebs. MNA wird in Tumorzellen und Fibroblasten im Tumormikromilieu (TME) produziert und von T-Zellen aufgenommen. MNA erhöht die Bindung von Sp1 an den TNFα-Promotor, was zu einer gesteigerten TNFα-Transkription und TNFα-Zytokinproduktion führt. MNA bewirkt außerdem eine Abnahme von IFN-γ. Die Hemmung der T-Zell-Funktion führt zu einer reduzierten zytotoxischen Wirkung und beschleunigtem Tumorwachstum.
Berichten zufolge besitzt TNFα sowohl tumorhemmende als auch tumorabwehrende Wirkungen, spielt aber bekanntermaßen eine Rolle bei der Förderung von Wachstum und Metastasierung von Eierstockkrebs (31–33). Die Konzentration von TNFα in Aszites und Tumorgewebe von Patientinnen mit Eierstockkrebs ist höher als in benignem Gewebe (34–36). Mechanistisch betrachtet kann TNFα die Aktivierung, Funktion und Proliferation weißer Blutkörperchen regulieren und den Phänotyp von Krebszellen verändern (37, 38). Im Einklang mit diesen Befunden zeigte die differentielle Genexpressionsanalyse eine signifikante Hochregulation von TNF in T-Zellen des Tumorgewebes im Vergleich zu Aszites (Abbildung 5C). Der Anstieg der TNF-Expression war nur in T-Zellpopulationen mit einem nicht-zytotoxischen Phänotyp nachweisbar (Abbildung S5A). Zusammenfassend stützen diese Daten die Annahme, dass MNA in HGSC sowohl immunsuppressive als auch tumorfördernde Wirkungen besitzt.
Die Fluoreszenzmarkierung mittels Durchflusszytometrie hat sich als Hauptmethode zur Untersuchung des TIL-Metabolismus etabliert. Studien haben gezeigt, dass murine und humane TIL im Vergleich zu peripheren Blutlymphozyten oder T-Zellen aus sekundären lymphatischen Organen eine höhere Glukoseaufnahme (4, 39) und einen graduellen Verlust der Mitochondrienfunktion (19, 40) aufweisen. Obwohl wir in dieser Studie ähnliche Ergebnisse beobachtet haben, liegt der entscheidende Fortschritt im Vergleich des Metabolismus von Tumorzellen und TIL aus demselben resezierten Tumorgewebe. Übereinstimmend mit früheren Berichten zeigen Tumorzellen (CD45-EpCAM+) aus Aszites und Tumoren eine höhere Glukoseaufnahme als CD8+ und CD4+ T-Zellen. Dies stützt die Annahme, dass die hohe Glukoseaufnahme von Tumorzellen mit der von T-Zellen vergleichbar ist und somit das Konzept der T-Zell-Konkurrenz im Tumormikromilieu (TME) widerspiegelt. Die mitochondriale Aktivität von Tumorzellen ist jedoch höher als die von CD8+ T-Zellen, ähnelt aber der von CD4+ T-Zellen. Diese Ergebnisse bekräftigen die zunehmende Erkenntnis, dass der oxidative Stoffwechsel für Tumorzellen von Bedeutung ist (41, 42). Sie legen zudem nahe, dass CD8⁺-T-Zellen anfälliger für oxidative Dysfunktion sein könnten als CD4⁺-T-Zellen oder dass CD4⁺-T-Zellen andere Kohlenstoffquellen als Glukose nutzen, um die mitochondriale Aktivität aufrechtzuerhalten (43, 44). Es ist anzumerken, dass wir in Aszites keine Unterschiede in der Glukoseaufnahme oder der mitochondrialen Aktivität zwischen CD4⁺-Effektor-, Effektor-Gedächtnis- und zentralen Gedächtnis-T-Zellen beobachtet haben. Ebenso korreliert der Differenzierungszustand von CD8⁺-T-Zellen in Tumoren nicht mit Veränderungen der Glukoseaufnahme, was den signifikanten Unterschied zwischen in vitro kultivierten T-Zellen und humanen TIL in vivo unterstreicht (22). Diese Beobachtungen wurden auch durch die unvoreingenommene automatische Zellpopulationszuordnung bestätigt, die weiterhin zeigte, dass CD45⁺/CD3^-/CD4⁺/CD45RO⁺-Zellen mit höherer Glukoseaufnahme und mitochondrialer Aktivität als Tumorzellen zwar vorherrschend sind, aber eine metabolisch aktive Zellpopulation darstellen. Diese Population könnte die mutmaßliche Subpopulation von myeloiden Suppressorzellen oder plasmazytoiden dendritischen Zellen darstellen, die in der scRNA-Seq-Analyse identifiziert wurden. Obwohl beide Zelltypen bereits in humanen Ovarialtumoren beschrieben wurden [45], ist weitere Forschung erforderlich, um diese myeloide Subpopulation genauer zu charakterisieren.
Obwohl durchflusszytometrische Methoden die allgemeinen Unterschiede im Glukose- und oxidativen Stoffwechsel zwischen verschiedenen Zelltypen aufklären können, sind die genauen Metaboliten, die durch Glukose oder andere Kohlenstoffquellen für den mitochondrialen Stoffwechsel im Tumormikromilieu (TME) entstehen, noch nicht identifiziert. Die Zuordnung von Metaboliten zu einer bestimmten TIL-Subpopulation erfordert die Aufreinigung der Zellpopulation aus dem entnommenen Gewebe. Daher kann unsere Zellanreicherungsmethode in Kombination mit Massenspektrometrie Einblicke in die Metaboliten liefern, die in T-Zellen und Tumorzellpopulationen in entsprechenden Patientenproben unterschiedlich angereichert sind. Obwohl diese Methode Vorteile gegenüber der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) bietet, können bestimmte Metabolitenbibliotheken aufgrund ihrer inhärenten Stabilität und/oder hohen Umsatzrate beeinträchtigt sein (22). Dennoch konnten wir mit unserer Methode zwei bekannte immunsuppressive Metaboliten, Adenosin und Kynurenin, identifizieren, da diese zwischen verschiedenen Probentypen stark variieren.
Unsere metabolomische Analyse von Tumoren und TIL-Subtypen liefert neue Erkenntnisse über die Rolle von Metaboliten im ovariellen Tumormikromilieu (TME). Erstens stellten wir mittels Durchflusszytometrie fest, dass sich die mitochondriale Aktivität zwischen Tumoren und CD4+ T-Zellen nicht unterscheidet. Die LC-MS/MS-Analyse zeigte jedoch signifikante Veränderungen in der Metabolitenkonzentration zwischen diesen Zellpopulationen, was darauf hindeutet, dass Schlussfolgerungen zum TIL-Metabolismus und seiner Gesamtaktivität mit Vorsicht zu interpretieren sind. Zweitens ist MNA der Metabolit mit dem größten Unterschied zwischen CD45+ Zellen und T-Zellen im Aszites, nicht aber in Tumoren. Daher können Kompartimentierung und Tumorlokalisation unterschiedliche Auswirkungen auf den TIL-Metabolismus haben, was die mögliche Heterogenität innerhalb einer gegebenen Mikroumgebung unterstreicht. Drittens ist die Expression des MNA-produzierenden Enzyms NNMT hauptsächlich auf CAF beschränkt, in geringerem Maße auch auf Tumorzellen. Detektierbare MNA-Konzentrationen wurden jedoch in tumorabgeleiteten T-Zellen beobachtet. Die Überexpression von NNMT in ovariellen CAFs hat eine bekannte krebsfördernde Wirkung, die teilweise auf die Förderung des CAF-Metabolismus, der Tumorinvasion und der Metastasierung zurückzuführen ist (27). Obwohl die Gesamtmenge an TILs moderat ist, korreliert die NNMT-Expression in CAFs eng mit dem mesenchymalen Subtyp des Cancer Genome Atlas (TCGA), der mit einer schlechten Prognose assoziiert ist (27, 46, 47). Schließlich ist die Expression des für den MNA-Abbau verantwortlichen Enzyms AOX1 ebenfalls auf die CAF-Population beschränkt, was darauf hindeutet, dass T-Zellen MNA nicht metabolisieren können. Diese Ergebnisse stützen die Annahme, dass hohe MNA-Konzentrationen in T-Zellen auf ein immunsuppressives CAF-Mikromilieu hinweisen könnten, auch wenn weitere Untersuchungen zur Bestätigung dieses Befundes erforderlich sind.
Angesichts der geringen Expression von MNA-Transportern und der nicht nachweisbaren Konzentrationen wichtiger Proteine ​​des MNA-Metabolismus ist das Vorhandensein von MNA in T-Zellen unerwartet. Weder NNMT noch AOX1 konnten mittels scRNA-Seq-Analyse und gezielter qPCR in zwei unabhängigen Kohorten nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass MNA nicht von T-Zellen synthetisiert, sondern aus der umgebenden Tumormikroumgebung aufgenommen wird. In-vitro-Experimente zeigen, dass T-Zellen exogenes MNA tendenziell akkumulieren.
Unsere In-vitro-Studien haben gezeigt, dass exogenes MNA die Expression von TNFα in T-Zellen induziert und die Bindung von Sp1 an den TNFα-Promotor verstärkt. Obwohl TNFα sowohl tumorhemmende als auch tumorfördernde Funktionen besitzt, kann es bei Eierstockkrebs das Tumorwachstum fördern (31–33). Die Neutralisierung von TNFα in Eierstocktumorzellkulturen oder die Eliminierung des TNFα-Signals in Mausmodellen kann die TNFα-vermittelte Produktion entzündungsfördernder Zytokine verbessern und das Tumorwachstum hemmen (32, 35). Daher kann in diesem Fall aus der Tumormikroumgebung stammendes MNA über einen TNFα-abhängigen Mechanismus im autokrinen Regelkreis als proinflammatorischer Metabolit wirken und so die Entstehung und Ausbreitung von Eierstockkrebs begünstigen (31). Ausgehend von dieser Möglichkeit wird die Blockade von TNFα als potenzieller Therapieansatz für Eierstockkrebs untersucht (37, 48, 49). Darüber hinaus beeinträchtigt MNA die Zytotoxizität von CAR-T-Zellen gegenüber Eierstocktumorzellen, was die Annahme einer MNA-vermittelten Immunsuppression weiter untermauert. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse auf ein Modell hin, in dem Tumoren und CAF-Zellen MNA in die extrazelluläre Tumormikroumgebung (TME) sezernieren. Dies könnte durch (i) die TNF-induzierte Wachstumsstimulation von Eierstockkrebs und (ii) die MNA-induzierte Hemmung der zytotoxischen Aktivität von T-Zellen einen dualen Tumoreffekt haben (Abbildung 5D).
Zusammenfassend zeigte diese Studie durch die Kombination von schneller Zellanreicherung, Einzelzellsequenzierung und metabolischem Profiling die enormen immunmetabolomischen Unterschiede zwischen Tumorzellen und Asziteszellen bei Patientinnen mit hochgradigem serösem Ovarialkarzinom (HGSC). Die umfassende Analyse ergab Unterschiede in der Glukoseaufnahme und der mitochondrialen Aktivität von T-Zellen und identifizierte MNA als nicht-zellautonomen immunregulatorischen Metaboliten. Diese Daten tragen zum Verständnis bei, wie die Tumormikroumgebung (TME) den T-Zell-Metabolismus bei menschlichen Tumoren beeinflusst. Obwohl ein direkter Nährstoffwettbewerb zwischen T-Zellen und Krebszellen beschrieben wurde, können Metaboliten auch als indirekte Regulatoren wirken, das Tumorwachstum fördern und möglicherweise endogene Immunantworten unterdrücken. Die weitere Aufklärung der funktionellen Rolle dieser regulatorischen Metaboliten könnte alternative Strategien zur Stärkung der Antitumor-Immunantwort eröffnen.
Patientenproben und klinische Daten wurden über die von der Canadian Tissue Repository Network zertifizierte BC-Tumorgewebebank bezogen. Gemäß dem von der Ethikkommission für Krebsforschung in British Columbia und der University of British Columbia (H07-00463) genehmigten Protokoll wurde für alle Patientenproben und klinischen Daten eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt bzw. formell auf die Einwilligung verzichtet. Die Proben werden in der zertifizierten Biobank (BRC-00290) gelagert. Detaillierte Patientenmerkmale sind in den Tabellen S1 und S5 dargestellt. Zur Kryokonservierung wird die Tumorprobe des Patienten mit einem Skalpell mechanisch zerkleinert und anschließend durch einen 100-µm-Filter filtriert, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Das Aszites der Patienten wurde 10 Minuten bei 4 °C und 1500 U/min zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren und den Überstand zu entfernen. Aus Tumorgewebe und Aszites gewonnene Zellen wurden in 50 % hitzeinaktiviertem humanem AB-Serum (Sigma-Aldrich), 40 % RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) und 10 % Dimethylsulfoxid kryokonserviert. Diese konservierten Einzelzellsuspensionen wurden aufgetaut und für die unten beschriebenen Metabolomik- und Metabolitenbestimmungen verwendet.
Das vollständige Medium besteht aus 0,22 μm-filtriertem 50:50-Gemisch aus RPMI 1640 und AimV. RPMI 1640 enthält 2,05 mM L-Glutamin (Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem humanem AB-Serum (Sigma-Aldrich), 12,5 mM HEPES (Thermo Fisher Scientific), 2 mM L-Glutamin (Thermo Fisher Scientific), 1x Penicillin-Streptomycin-Lösung (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) und 50 μM M-Mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) wird mit 20 mM HEPES (Thermo Fisher Scientific) und 2 mM L-Glutamin (Thermo Fisher Scientific) ergänzt. Der Durchflusszytometer-Färbepuffer bestand aus 0,22 μm-filtriertem phosphatgepuffertem Salzlösung (PBS; Invitrogen), ergänzt mit 3 % hitzeinaktiviertem AB-Humanserum (Sigma). Der Zellanreicherungspuffer bestand aus 0,22 μm-filtriertem PBS und wurde mit 0,5 % hitzeinaktiviertem AB-Humanserum (Sigma-Aldrich) ergänzt.
In 37 °C warmem Vollmedium wurden die Zellen 30 Minuten lang mit 10 nM MT DR und 100 μM 2-NBDG inkubiert. Anschließend erfolgte eine Inkubation mit dem Vitalfarbstoff eF506 für 15 Minuten bei 4 °C. Die Zellen wurden in FC Block (eBioscience) und Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) resuspendiert, mit Durchflusszytometrie-Färbepuffer (gemäß Herstellerangaben) verdünnt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden 20 Minuten lang bei 4 °C mit einem Antikörpersatz (Tabelle S2) in Durchflusszytometrie-Färbepuffer inkubiert. Vor der Analyse wurden die Zellen in Durchflusszytometrie-Färbepuffer (Cytek Aurora; Konfiguration 3L-16V-14B-8R) resuspendiert. Die Zellzählungsdaten wurden mit SpectroFlo und FlowJo V10 analysiert und mit GraphPad Prism 8 visualisiert. Die mediane Fluoreszenzintensität (MFI) von 2-NBDG und MT DR wurde logarithmisch normalisiert. Anschließend wurde ein gepaarter t-Test zur statistischen Analyse verwendet, um die Übereinstimmung der Patienten zu berücksichtigen. Populationen mit weniger als 40 Ereignissen wurden von der Analyse ausgeschlossen. Negative MFI-Werte wurden vor der statistischen Analyse und Datenvisualisierung auf 1 gesetzt.
Um die manuelle Gating-Strategie des oben beschriebenen Prozesspanels zu ergänzen, nutzten wir die vollständige Annotation mittels Shape Restriction Tree (FAUST) (21), um Zellen nach dem Entfernen toter Zellen in FlowJo automatisch der Population zuzuordnen. Die Ausgabe wurde manuell bearbeitet, um scheinbar falsch zugeordnete Populationen (Kombination von PD1+- und PD1--Tumorzellen) mit den verbleibenden Populationen zusammenzuführen. Jede Probe enthält durchschnittlich mehr als 2 % Zellen, insgesamt also 11 Populationen.
Zur Trennung von PBMC aus Leukozytenseparationsprodukten wurde eine Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation (STEMCELL Technologies) verwendet. CD8⁺-T-Zellen wurden mittels CD8-Mikrokügelchen (Miltenyi) aus PBMC isoliert und gemäß Herstellerangaben zwei Wochen lang in Vollmedium mit TransAct (Miltenyi) expandiert. Anschließend wurden die Zellen fünf Tage lang in Vollmedium mit IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) inkubiert und danach erneut mit TransAct stimuliert. Am siebten Tag wurden die Zellen gemäß Herstellerangaben in drei aufeinanderfolgenden Zyklen mit humanen CD45-Mikrokügelchen (Miltenyi) angereichert. Die Zellen wurden für die Durchflusszytometrie (wie oben beschrieben) aliquotiert, und eine Million Zellen wurden dreimal für die LC-MS/MS-Analyse aliquotiert. Die Proben wurden wie unten beschrieben mittels LC-MS/MS aufbereitet. Der Wert fehlender Metaboliten wurde mit einer Ionenzahl von 1000 geschätzt. Jede Probe wird anhand der Gesamtionenzahl (TIC) normalisiert, logarithmisch umgewandelt und vor der Analyse in MetaboAnalystR automatisch normalisiert.
Die Einzelzellsuspension jedes Patienten wurde aufgetaut und durch einen 40-µm-Filter in Vollmedium filtriert (wie oben beschrieben). Gemäß Herstellerprotokoll wurden drei aufeinanderfolgende Runden positiver Selektion mittels magnetischer Bead-Separation mit MicroBeads (Miltenyi) durchgeführt, um die Proben mit CD8+-, CD4+- und CD45--Zellen anzureichern (auf Eis). Kurz gesagt, die Zellen werden in Zellanreicherungspuffer resuspendiert (wie oben beschrieben) und gezählt. Die Zellen wurden 15 Minuten bei 4 °C mit humanen CD8-, humanen CD4- oder humanen CD45-Beads (Miltenyi) inkubiert und anschließend mit Zellanreicherungspuffer gewaschen. Die Probe wird durch die LS-Säule (Miltenyi) geleitet und die positiven und negativen Fraktionen werden aufgefangen. Um die Dauer zu verkürzen und die Zellausbeute zu maximieren, wird die CD8-Fraktion für die zweite Runde der CD4+-Anreicherung und die CD4-Fraktion für die anschließende CD45-Anreicherung verwendet. Die Lösung während des gesamten Trennprozesses auf Eis halten.
Zur Probenvorbereitung für die Metabolitenanalyse wurden die Zellen einmal mit eiskalter Salzlösung gewaschen. Anschließend wurden zu jeder Probe 1 ml 80%iges Methanol gegeben, die Proben vortexiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Proben wurden drei Gefrier-Auftau-Zyklen unterzogen und 15 Minuten bei 14.000 U/min und 4 °C zentrifugiert. Der die Metaboliten enthaltende Überstand wurde eingedampft. Die Metaboliten wurden in 50 μl 0,03%iger Ameisensäure gelöst, vortexiert und anschließend zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen.
Die Metaboliten wurden wie oben beschrieben extrahiert. Der Überstand wurde für die Metabolomik-Analyse in eine HPLC-Flasche überführt. Um Batch-Effekte zu vermeiden, wurde jede Probe mit einer ähnlichen Zellzahl behandelt. Die qualitative Analyse der Gesamtmetaboliten erfolgte mit dem AB SCIEX QTRAP 5500 Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (50). Chromatographische Analyse und Peakflächenintegration wurden mit der Software MultiQuant Version 2.1 (Applied Biosystems SCIEX) durchgeführt.
Zur Schätzung fehlender Metabolitwerte wurde eine Ionenanzahl von 1000 verwendet. Der TIC jeder Probe diente zur Berechnung der normalisierten Peakfläche jedes detektierten Metaboliten, um durch die Probenverarbeitung bedingte Veränderungen bei der instrumentellen Analyse zu korrigieren. Nach der TIC-Normalisierung wurde MetaboAnalystR (51) (Standardparameter) für die logarithmische Transformation und die automatische Skalierung der Normlinie eingesetzt. Mittels PCA und dem R-Paket vegan führten wir eine explorative Analyse der Metabolomunterschiede zwischen den Probentypen durch und analysierten Patientendaten mittels partieller Redundanzanalyse. Zur Clusterung der euklidischen Distanz zwischen den Proben wurde ein Heatmap-Dendrogramm nach Ward erstellt. Mit limma (52) auf Basis der standardisierten Metabolithäufigkeit identifizierten wir differentiell häufig vorkommende Metaboliten innerhalb des gesamten Zelltyps und der Mikroumgebung. Zur Vereinfachung der Erklärung verwendeten wir den Gruppenmittelwert als Parameter für das Modell und betrachteten die Zelltypen in der Mikroumgebung als jeweils eine Gruppe (n = 6 Gruppen). Für den Signifikanztest führten wir drei Wiederholungsmessungen für jeden Metaboliten durch. Um eine falsche Replikation zu vermeiden, wurde der Patient als Hindernis in das limma-Design einbezogen. Um die Unterschiede in den Metaboliten zwischen verschiedenen Patienten zu überprüfen, passten wir das limma-Modell unter Einbeziehung der Patienten auf festgelegte Weise an. Wir berichten über die Signifikanz des vordefinierten Kontrasts zwischen Zelltyp und Mikroumgebung von Padj < 0,05 (Benjamini-Hochberg-Korrektur).
Nach Anreicherung der Zellen mittels Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80 % Viabilität) wurde die Einzelzell-Transkriptomsequenzierung der gesamten lebenden, gefrorenen Aszites- und Tumorproben mit einem 10x 5′-Genexpressionsprotokoll durchgeführt. Fünf Fälle mit übereinstimmenden Tumoren und Aszitesproben wurden analysiert, wobei die geringe Viabilität einer Tumorprobe deren Einschluss verhinderte. Um eine Mehrfachauswahl von Patienten zu ermöglichen, wurden die Proben jedes Patienten in den Spuren des 10x Chromium-Controllers kombiniert und die Aszites- und Tumorstellen separat analysiert. Nach der Sequenzierung [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp Paired-End (PE), Quebec-Genom; Mit durchschnittlich 73.488 bzw. 41.378 Reads pro Zelle für Tumor- bzw. Aszitesproben verwendeten wir CellSNP und Vireo (53) (basierend auf CellSNP). Der häufigste humane SNP (VCF), der von GRCh38 bereitgestellt wird, wird einer Spenderidentität zugeordnet. Wir verwenden SNPRelate, um die nächstliegende Identität (IBS) des Genotypstatus des Patienten abzuleiten, wobei nicht zugeordnete Zellen und als Duplexe identifizierte Zellen sowie übereinstimmende Spender zwischen Aszites- und Tumorproben ausgeschlossen werden (54). Auf dieser Grundlage behielten wir drei Fälle mit reichlicher Zellrepräsentation im Tumor und Aszites für die nachfolgende Analyse bei. Nach einem Massenfiltrationsschritt in den BioConductor-Paketen scater (55) und scran (56) ergab dies 6975 Zellen (2792 Zellen aus Tumor und 4183 Zellen aus Aszites) für die Analyse. Wir verwenden igraphs (57) Louvain-Clustering des Shared Nearest Neighbor Network (SNN) basierend auf Die Zellen wurden anhand ihrer Expression mittels Jaccard-Distanz gruppiert. Die Cluster wurden manuell anhand der Markergenexpression potenziellen Zelltypen zugeordnet und mit t-SNE visualisiert. Zytotoxische T-Zellen sind durch die Expression von CD8A und GZMA definiert, wobei Subcluster mit geringer ribosomaler Proteinexpression ausgeschlossen wurden. Wir griffen auf die veröffentlichten Daten von Izar et al. (16) zurück, einschließlich deren t-SNE-Einbettung, um die Expressionsüberlappung zwischen Immunzellmarkern und NNMT-Expression zu kontrollieren.
PBMC wurden mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation aus Leukozytenseparationsprodukten (STEMCELL Technologies) isoliert. CD3+-Zellen wurden mit CD3-Beads (Miltenyi) aus den PBMC isoliert. In Gegenwart oder Abwesenheit von MNA wurden die CD3+-Zellen mit plattengebundenem CD3 (5 μg/ml), löslichem CD28 (3 μg/ml) und IL-2 (300 U/ml; Proleukin) aktiviert. Am letzten Tag der Expansion wurden die Viabilität (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) und die Proliferation (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Effektorfunktion wurde durch Stimulation der Zellen mit PMA (20 ng/ml) und Ionomycin (1 μg/ml) unter Verwendung von GolgiStop für 4 Stunden untersucht. Anschließend wurden CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) und TNFα-Fluoresceinisothiocyanat (FITC) (MAb11, BD) analysiert. Für qPCR und ChIP wurden die Zellen ebenfalls mit PMA (20 ng/ml) und Ionomycin (1 μg/ml) für 4 Stunden stimuliert. Der ELISA-Überstand wurde vor und nach der Stimulation mit PMA (20 ng/ml) und Ionomycin (1 μg/ml) für 4 Stunden gewonnen.
Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers zur RNA-Isolierung mit dem RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Homogenisieren Sie die Probe mit dem QIAshredder (QIAGEN). Verwenden Sie das High-Capacity RNA to cDNA Kit (Thermo Fisher Scientific) zur Synthese von komplementärer DNA (cDNA). Quantifizieren Sie die Genexpression mit der TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) (gemäß Herstellerprotokoll) und den folgenden Sonden: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [Glycerinaldehyd-3-phosphat-ab-Wasserstoff (GAPDH)] und Hs01010726_m1 (SLC22A2). Die Proben wurden auf dem StepOnePlus Real-Time-PCR-System (Applied Biosystems) in der MicroAmp Fast Optical 96-Well-Reaktionsplatte (Applied Biosystems) mit MicroAmp-Optikfilm analysiert. Jeder Ct-Wert über 35 gilt als oberhalb der Nachweisgrenze liegend und wird als nicht nachweisbar gekennzeichnet.
Die ChIP-Analyse wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (58). Kurz gesagt, die Zellen wurden mit Formaldehyd (Endkonzentration 1,42 %) behandelt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 10 Minuten auf Eis in ergänztem Quellpuffer (25 mM HEPES, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM KCl und 0,1 % NP-40) inkubiert und danach wie beschrieben (58) in Immunpräzipitationspuffer resuspendiert. Die Probe wurde dann mit folgenden Zyklen sonifiziert: 10 Zyklen (20 Pulse à 1 Sekunde) und eine statische Zeit von 40 Sekunden. Die ChIP-geeigneten Antikörper gegen Immunglobulin G (Cell Signaling Technology; 1 μl), Histon H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) und SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) wurden über Nacht bei 4 °C unter Schütteln mit der Probe inkubiert. Protein-A-Beads (Thermo Fisher Scientific) wurden mit der Probe 1 Stunde lang bei 4 °C unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend wurde die DNA mit Chelex-Beads (Bio-Rad) angereichert und die Proteine ​​mit Proteinase K (Thermo Fisher) verdaut. Der TNFα-Promotor wurde mittels PCR nachgewiesen: Vorwärts-Primer: GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; Rückwärts-Primer: GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207 bp Produkt). Die Bilder wurden mit Image Lab (Bio-Rad) erstellt und mit der Software ImageJ quantifiziert.
Der Zellkulturüberstand wurde wie oben beschrieben gewonnen. Die Bestimmung erfolgte gemäß den Herstellerangaben der humanen TNFα-ELISA-Kits (Invitrogen), der humanen IL-2-ELISA-Kits (Invitrogen) und der humanen IFN-γ-ELISA-Kits (Abcam). Gemäß Herstellerprotokoll wurde der Überstand 1:100 für den Nachweis von TNFα und IL-2 und 1:3 für den Nachweis von IFN-γ verdünnt. Die Absorptionsmessung bei 450 nm erfolgte mit dem EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer).
PBMC wurden mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation aus Leukozytenseparationsprodukten (STEMCELL Technologies) isoliert. CD3+-Zellen wurden mit CD3-Beads (Miltenyi) aus den PBMC isoliert. In Gegenwart oder Abwesenheit von MNA wurden die CD3+-Zellen drei Tage lang mit plattengebundenem CD3 (5 μg/ml), löslichem CD28 (3 μg/ml) und IL-2 (300 U/ml; Proleukin) aktiviert. Nach drei Tagen wurden die Zellen geerntet, mit 0,9%iger Kochsalzlösung gewaschen und das Zellpellet schockgefroren. Die Zellzählung erfolgte mittels Durchflusszytometrie (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R-Konfiguration) unter Verwendung von 123count eBeads.
Die Metaboliten wurden wie oben beschrieben extrahiert. Der getrocknete Extrakt wurde in einer Konzentration von 4000 Zelläquivalenten/µl rekonstituiert. Die Analyse der Probe erfolgte mittels Umkehrphasenchromatographie (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) und einer CORTECS T3-Säule (2,1 × 150 mm, Partikelgröße 1,6 µm, Porengröße 120 Å; #186008500, Waters). Die Massenspektrometrie wurde mit einem polaren Massenspektrometer (6470, Agilent) durchgeführt, in dem die Elektrospray-Ionisation im positiven Modus arbeitete. Die mobile Phase A bestand aus 0,1 % Ameisensäure (in H₂O), die mobile Phase B aus 90 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure. Der LC-Gradient verläuft von 0 bis 2 Minuten für 100 % A, von 2 bis 7,1 Minuten für 99 % B und von 7,1 bis 8 Minuten für 99 % B. Anschließend wird die Säule mit mobiler Phase A bei einer Flussrate von 0,6 ml/min für 3 Minuten reäquilibriert. Die Flussrate beträgt 0,4 ml/min, und die Säulenkammer wird auf 50 °C erhitzt. Zur Bestimmung der Retentionszeit (RT) und der Transformationen (RT = 0,882 Minuten, Transformation 1 = 137→94,1, Transformation 2 = 137→92, Transformation 3 = 137→78) wird der reine chemische Standard von MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) verwendet. Wenn alle drei Übergänge zur korrekten Retentionszeit erfolgen, wird Transformation 1 zur Quantifizierung verwendet, um die Spezifität sicherzustellen. Die Standardkurve für MNA (Toronto Research Chemical Company) wurde durch sechs serielle Verdünnungen der Stammlösung (1 mg/ml) erstellt, um Standards mit Konzentrationen von 0,1, 1,0, 10 und 100 ng/ml bzw. 1,0 und 10 µg/ml zu erhalten. Die Nachweisgrenze liegt bei 1 ng/ml, der lineare Bereich erstreckt sich von 10 ng/ml bis 10 µg/ml. Für die LC/MS-Analyse wurden jeweils zwei Mikroliter Probe und Standard injiziert. Zur Sicherstellung der Stabilität der Analyseplattform wurde alle acht Injektionen eine gemischte Qualitätskontrollprobe analysiert. Die MNA-Signale aller mit MNA behandelten Zellproben lagen innerhalb des linearen Bereichs des Assays. Die Datenanalyse erfolgte mit der quantitativen Analysesoftware MassHunter (Version 9.0, Agilent).
Das αFR-CAR-Konstrukt der zweiten Generation stammt von Song et al. (59). Kurz gesagt, enthält es folgende Bestandteile: die CD8a-Leadersequenz, das humane αFR-spezifische Einzelketten-Variablenfragment, die CD8a-Scharnier- und Transmembranregion, die intrazelluläre Domäne von CD27 und die intrazelluläre Domäne von CD3ζ. Die vollständige CAR-Sequenz wurde von GenScript synthetisiert und anschließend in den lentiviralen Expressionsvektor der zweiten Generation stromaufwärts der GFP-Expressionskassette kloniert, die zur Bestimmung der Transduktionseffizienz verwendet wurde.
Lentivirus wird durch Transfektion von HEK293T-Zellen (American Type Culture Collection (ATCC)) hergestellt. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin kultiviert. Als Vektor diente der CAR-GFP-Vektor. Die Verpackungsplasmide (psPAX2 und pMD2.G, Addgene) wurden mittels Lipofektionsamin (Sigma-Aldrich) transfiziert. Der virushaltige Überstand wurde 48 und 72 Stunden nach der Transfektion geerntet, filtriert und durch Ultrazentrifugation konzentriert. Der konzentrierte virale Überstand wird bis zur Transduktion bei -80 °C gelagert.
PBMC werden mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation aus Leukozytenseparationsprodukten gesunder Spender (STEMCELL Technologies) isoliert. CD8+-Zellen werden mithilfe von CD8-Mikrokügelchen (Miltenyi) zur positiven Selektion aus den PBMC isoliert. T-Zellen werden mit TransAct (Miltenyi) in TexMACS-Medium (Miltenyi, ergänzt mit 3 % hitzeinaktiviertem Humanserum, 1 % PenStrep und IL-2 (300 U/ml)) stimuliert. 24 Stunden nach der Stimulation werden die T-Zellen mit Lentivirus transduziert (10 μl konzentrierter Virusüberstand pro 10⁶ Zellen). 1 bis 3 Tage nach der Transduktion wird auf Cytek Aurora (FSC/SSC, Singlet, GFP+) die GFP-Expression der Zellen analysiert, um eine Transduktionseffizienz von mindestens 30 % nachzuweisen.
CAR-T-Zellen wurden 24 Stunden lang in Immunocult (STEMCELL Technologies; ergänzt mit 1 % PenStrep) unter folgenden Bedingungen kultiviert: unbehandelt, behandelt mit 250 μM Adenosin oder 10 mM MNA. Nach der Vorbehandlung wurden die CAR-T-Zellen mit PBS gewaschen und mit 20.000 SK-OV-3-Zellen [ATCC; in McCoy 5A-Medium (Sigma-Aldrich), ergänzt mit 10 % FBS und 1 % PenStrep] im Verhältnis 10:1 (Effektor:Ziel) kombiniert. Das Effektor-Ziel-Verhältnis von 1 wurde in dreifacher Ausführung in ergänztem Immunocult-Medium amplifiziert. SK-OV-3-Zellen und mit Digitalissaponin (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) lysierte SK-OV-3-Zellen dienten als Negativ- bzw. Positivkontrolle. Nach 24 Stunden Kokultivierung wurde der Überstand abgenommen und die Laktatdehydrogenase (LDH) gemäß den Herstellerangaben (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) gemessen. Der LDH-Überstand wurde 1:50 mit LDH-Puffer verdünnt. Die Abtötungsrate wurde anhand folgender Formel berechnet: Abtötungsrate = Korrekturrate / maximale Abtötungsrate × 100 %, wobei die Korrekturrate der Kokultur mit T-Zellen entspricht und die maximale Abtötungsrate der Differenz zwischen Positiv- und Negativkontrolle entspricht.
Wie im Text bzw. im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben, verwenden Sie GraphPad Prism 8, Microsoft Excel oder R v3.6.0 für die statistische Analyse. Werden mehrere Proben vom selben Patienten entnommen (z. B. Aszites und Tumor), verwenden wir einen gepaarten t-Test oder beziehen den Patienten gegebenenfalls als Zufallseffekt in ein lineares oder generalisiertes Modell ein. Für die Metabolomanalyse wird der Wichtigkeitstest dreifach durchgeführt.
Ergänzendes Material zu diesem Artikel finden Sie unter http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
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Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA trägt zur Immunsuppression von T-Zellen bei und stellt ein potenzielles Ziel für die Immuntherapie bei der Behandlung von Krebs beim Menschen dar.
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