Verschiedene Theorien zur Pflanzenabwehr liefern wichtige theoretische Ansätze zur Erklärung der Muster des spezialisierten Pflanzenstoffwechsels, doch ihre zentralen Vorhersagen müssen noch überprüft werden. In dieser Studie nutzten wir unvoreingenommene Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS), um das Metabolom attenuierter Tabakstämme systematisch zu untersuchen – von einzelnen Pflanzen über Populationen bis hin zu eng verwandten Arten. Wir verarbeiteten eine Vielzahl massenspektrometrischer Merkmalstheorien, basierend auf den Spektren der Verbindungen, um die zentralen Vorhersagen der Theorien der optimalen Verteidigung (OD) und des beweglichen Ziels (MT) zu testen. Die Informationskomponente der Pflanzenmetabolomik steht im Einklang mit der OD-Theorie, widerspricht jedoch der Hauptvorhersage der MT-Theorie zur durch Herbivoren verursachten Metabolomdynamik. Von der mikro- bis zur makroevolutionären Ebene wurde das Jasmonat-Signal als Hauptdeterminante der OD identifiziert, während das Ethylen-Signal eine Feinabstimmung der herbivorenspezifischen Reaktion ermöglichte, die durch das MS/MS-Molekülnetzwerk annotiert wurde.
Spezielle Metaboliten mit vielfältigen Strukturen spielen eine zentrale Rolle bei der Anpassung von Pflanzen an ihre Umwelt, insbesondere bei der Abwehr von Feinden (1). Die erstaunliche Diversifizierung des speziellen Pflanzenstoffwechsels hat jahrzehntelange, intensive Forschung zu seinen zahlreichen ökologischen Funktionen angeregt und eine lange Liste von Pflanzenabwehrtheorien hervorgebracht, die die evolutionäre und ökologische Entwicklung der Interaktionen zwischen Pflanzen und Insekten widerspiegeln. Empirische Forschung liefert wichtige Anhaltspunkte (2). Diese Pflanzenabwehrtheorien folgten jedoch nicht dem normativen Ansatz hypothetisch-deduktiven Denkens, bei dem zentrale Vorhersagen auf derselben Analyseebene betrachtet (3) und experimentell überprüft wurden, um den nächsten Zyklus der Theorieentwicklung voranzutreiben (4). Technische Beschränkungen begrenzen die Datenerhebung auf spezifische Stoffwechselkategorien und verhindern eine umfassende Analyse spezialisierter Metaboliten. Dadurch werden Vergleiche zwischen verschiedenen Kategorien unterbunden, die für die Theorieentwicklung unerlässlich sind (5). Der Mangel an umfassenden Metabolomik-Daten und einer gemeinsamen Vergleichsgrundlage für die Verarbeitungsprozesse im Stoffwechselraum verschiedener Pflanzengruppen behindert die wissenschaftliche Reife des Forschungsfelds.
Die neuesten Entwicklungen auf dem Gebiet der Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) in der Metabolomik ermöglichen eine umfassende Charakterisierung der Stoffwechselveränderungen innerhalb und zwischen Arten eines gegebenen Systemclades und können mit computergestützten Methoden kombiniert werden, um die strukturelle Ähnlichkeit dieser komplexen Gemische zu berechnen. Vorkenntnisse in Chemie sind erforderlich (5). Die Kombination fortschrittlicher Analyse- und Computertechnologien bietet einen notwendigen Rahmen für die Langzeitprüfung zahlreicher Vorhersagen ökologischer und evolutionärer Theorien zur metabolischen Diversität. Shannon (6) führte die Informationstheorie erstmals 1948 in seinem wegweisenden Artikel ein und legte damit den Grundstein für die mathematische Analyse von Information, die in vielen Bereichen jenseits ihrer ursprünglichen Anwendung Verwendung findet. In der Genomik wurde die Informationstheorie erfolgreich zur Quantifizierung sequenzkonservierter Informationen eingesetzt (7). In der Transkriptomik analysiert die Informationstheorie die Gesamtveränderungen im Transkriptom (8). In früheren Arbeiten haben wir den statistischen Rahmen der Informationstheorie auf die Metabolomik angewendet, um die metabolische Expertise auf Gewebeebene in Pflanzen zu beschreiben (9). Hier kombinieren wir den MS/MS-basierten Arbeitsablauf mit dem statistischen Rahmen der Informationstheorie, der durch die metabolische Diversität in der gemeinsamen Währung charakterisiert ist, um die wichtigsten Vorhersagen der Pflanzenabwehrtheorie des durch Herbivoren induzierten Metaboloms zu vergleichen.
Die theoretischen Rahmenwerke der Pflanzenabwehr sind in der Regel einander ergänzend und lassen sich in zwei Kategorien einteilen: Solche, die die Verteilung pflanzenspezifischer Metabolite auf der Grundlage von Abwehrfunktionen erklären, wie die Theorie der optimalen Abwehr (OD) (10), die Theorie des beweglichen Ziels (MT) (11) und die Erscheinungstheorie (12), und solche, die mechanische Erklärungen dafür suchen, wie sich Veränderungen der Ressourcenverfügbarkeit auf das Pflanzenwachstum und die Akkumulation spezialisierter Metabolite auswirken, wie die Kohlenstoff-Nährstoff-Balance-Hypothese (13), die Wachstumsratenhypothese (14) und die Wachstums- und Differenzierungsgleichgewichtshypothese (15). Die beiden Theoriegruppen befinden sich auf unterschiedlichen Analyseebenen (4). Zwei Theorien, die Abwehrfunktionen auf der funktionalen Ebene einbeziehen, dominieren jedoch die Diskussion über konstitutive und induzierbare Pflanzenabwehr: die OD-Theorie, die davon ausgeht, dass Pflanzen nur bei Bedarf in ihre aufwändigen chemischen Abwehrstoffe investieren, beispielsweise bei der Aufnahme von Schädlingen. Wenn also ein Grastier angreift, wird je nach Wahrscheinlichkeit eines zukünftigen Angriffs die Verbindung mit einer Abwehrfunktion ausgewählt (10). Die MT-Hypothese besagt, dass es keine gerichtete Metabolitveränderung gibt, sondern dass sich die Metabolite zufällig verändern. Dadurch wird die Möglichkeit geschaffen, das metabolische „Ziel“ angreifender Pflanzenfresser zu blockieren. Anders ausgedrückt: Diese beiden Theorien treffen gegensätzliche Vorhersagen über die metabolische Umstrukturierung nach einem Pflanzenfresserangriff: den Zusammenhang zwischen der gerichteten Akkumulation von Metaboliten mit Abwehrfunktion (OD) und ungerichteten metabolischen Veränderungen (MT) (11).
Die OD- und MT-Hypothesen umfassen nicht nur die induzierten Veränderungen des Metaboloms, sondern auch die ökologischen und evolutionären Folgen der Akkumulation dieser Metabolite, wie beispielsweise die adaptiven Kosten und Vorteile dieser Stoffwechselveränderungen in einem spezifischen ökologischen Umfeld (16). Obwohl beide Hypothesen die Abwehrfunktion spezialisierter Metabolite anerkennen, die mitunter kostspielig sein kann, liegt die zentrale Vorhersage, die die OD- und MT-Hypothesen unterscheidet, in der Richtung der induzierten Stoffwechselveränderungen. Die Vorhersage der OD-Theorie wurde bisher experimentell am intensivsten untersucht. Diese Untersuchungen umfassen die Erforschung der direkten und indirekten Abwehrfunktionen spezifischer Verbindungen in verschiedenen Geweben unter Gewächshaus- und natürlichen Bedingungen sowie Veränderungen im Entwicklungsstadium von Pflanzen (17–19). Bislang fehlt jedoch ein Arbeitsablauf und ein statistisches Rahmenwerk für eine umfassende Analyse der metabolischen Diversität eines Organismus. Die zentrale Vorhersage der beiden Theorien – die Richtung der Stoffwechselveränderungen – muss daher noch überprüft werden. Wir liefern hier eine solche Analyse.
Eine der bedeutendsten Eigenschaften pflanzenspezifischer Metabolite ist ihre extreme strukturelle Diversität auf allen Ebenen – von einzelnen Pflanzen über Populationen bis hin zu ähnlichen Arten (20). Auf Populationsebene lassen sich viele quantitative Veränderungen spezialisierter Metabolite beobachten, während auf Artenebene in der Regel starke qualitative Unterschiede bestehen bleiben (20). Daher ist die metabolische Diversität von Pflanzen ein Hauptaspekt der funktionellen Diversität und spiegelt die Anpassungsfähigkeit an unterschiedliche ökologische Nischen wider, insbesondere solche mit unterschiedlichen Invasionsmöglichkeiten durch spezielle Insekten und häufige Herbivoren (21). Seit Fraenkels (22) bahnbrechender Arbeit über die Ursachen der Existenz pflanzenspezifischer Metabolite gelten Interaktionen mit verschiedenen Insekten als wichtige Selektionsdrücke, die Pflanzen im Laufe der Evolution maßgeblich geprägt haben (23). Unterschiede zwischen Arten in der Diversität spezialisierter Metabolite können auch das physiologische Gleichgewicht zwischen konstitutiver und induzierbarer Pflanzenabwehr gegen herbivore Strategien widerspiegeln, da diese beiden Arten häufig negativ miteinander korreliert sind (24). Obwohl eine dauerhaft gute Verteidigung vorteilhaft sein kann, bieten zeitlich abgestimmte Stoffwechselveränderungen im Zusammenhang mit der Abwehr klare Vorteile, da Pflanzen so wertvolle Ressourcen für andere physiologische Prozesse einsetzen können (19, 24) und die Notwendigkeit einer Symbiose vermeiden. Kollateralschäden (25) können ebenfalls auftreten. Darüber hinaus können diese durch pflanzenfressende Insekten verursachten Umstrukturierungen spezialisierter Metaboliten zu einer destruktiven Verteilung innerhalb der Population führen (26) und direkte Messwerte substanzieller natürlicher Veränderungen des Jasmonsäure-Signals (JA) widerspiegeln, das in der Population erhalten bleiben kann. Hohe und niedrige JA-Signale stellen einen Kompromiss zwischen der Verteidigung gegen Pflanzenfresser und der Konkurrenz mit bestimmten Arten dar (27). Zudem unterliegen Biosynthesewege spezialisierter Metaboliten im Laufe der Evolution einem raschen Verlust und einer Transformation, was zu einer uneinheitlichen Stoffwechselverteilung zwischen eng verwandten Arten führt (28). Diese Polymorphismen können sich als Reaktion auf veränderte Fraßmuster von Pflanzenfressern schnell ausbilden (29), was bedeutet, dass die Fluktuation von Pflanzenfressergemeinschaften ein Schlüsselfaktor für die metabolische Heterogenität ist.
Hier haben wir insbesondere die folgenden Probleme gelöst: (I) Wie verändert das pflanzenfressende Insekt das pflanzliche Metabolom? (II) Welche Hauptinformationskomponenten der metabolischen Plastizität lassen sich quantifizieren, um die Vorhersagen der Langzeitverteidigungstheorie zu überprüfen? (III) Wird das pflanzliche Metabolom auf eine für den Angreifer einzigartige Weise umprogrammiert? Wenn ja, welche Rolle spielen Pflanzenhormone bei der Anpassung einer spezifischen metabolischen Reaktion, und welche Metaboliten tragen zur Artenspezifität der Verteidigung bei? (IV) Da die Vorhersagen vieler Verteidigungstheorien auf alle Ebenen biologischer Gewebe übertragbar sind, haben wir untersucht, wie konsistent die ausgelöste metabolische Reaktion im Vergleich innerhalb einer Art und im Vergleich zwischen verschiedenen Arten ist. Zu diesem Zweck haben wir das Blattmetabolom von Nikotin-Tabak systematisch untersucht. Nikotin-Tabak ist eine ökologische Modellpflanze mit einem komplexen Spezialstoffwechsel und wirkt effektiv gegen die Larven zweier einheimischer Pflanzenfresser: Datura (Ms) (sehr aggressiv, hauptsächlich gefressen) und Spodoptera littoralis (Sl), die Baumwollraupen befallen. Diese bilden eine Art „Gattung“ und befallen neben den Wirtspflanzen der Solanaceae auch andere Gattungen und Familien. Wir analysierten das MS/MS-Metabolomspektrum und extrahierten informationstheoretische statistische Deskriptoren, um die Theorien der optischen Diffusor- (OD) und Metabolit-Diffusor- (MT) Genetik zu vergleichen. Spezifitätskarten wurden erstellt, um die Identität wichtiger Metaboliten aufzudecken. Die Analyse wurde auf die einheimische Population von N. nasi und eng verwandte Tabakarten ausgeweitet, um die Kovarianz zwischen Pflanzenhormonsignalisierung und OD-Induktion weiter zu untersuchen.
Um eine Gesamtkarte der Plastizität und Struktur des Blattmetaboloms von herbivorem Tabak zu erstellen, nutzten wir einen zuvor entwickelten Analyse- und Berechnungs-Workflow zur umfassenden Erfassung und Dekonvolution hochauflösender, datenunabhängiger MS/MS-Spektren aus Pflanzenextrakten (9). Diese undifferenzierte Methode (MS/MS) ermöglicht die Erstellung nicht-redundanter Verbindungsspektren, die für alle hier beschriebenen Analysen auf Verbindungsebene verwendet werden können. Die dekonvolvierten Pflanzenmetaboliten sind vielfältig und umfassen Hunderte bis Tausende von Metaboliten (ca. 500–1000 pro MS/MS). Wir betrachten die metabolische Plastizität im Rahmen der Informationstheorie und quantifizieren die Diversität und Spezialisierung des Metaboloms anhand der Shannon-Entropie der metabolischen Häufigkeitsverteilung. Mithilfe der zuvor implementierten Formel (8) berechneten wir eine Reihe von Indikatoren zur Quantifizierung der Metabolomdiversität (Hj-Indikator), der Spezialisierung des metabolischen Profils (δj-Indikator) und der metabolischen Spezifität eines einzelnen Metaboliten (Si-Indikator). Zusätzlich verwendeten wir den Relative Distance Plasticity Index (RDPI), um die Induzierbarkeit des Metaboloms durch Herbivoren zu quantifizieren (Abbildung 1A) (30). In diesem statistischen Rahmen betrachten wir das MS/MS-Spektrum als grundlegende Informationseinheit und verarbeiten die relative Häufigkeit von MS/MS zu einer Häufigkeitsverteilungskarte. Anschließend schätzen wir die Metabolomdiversität mithilfe der Shannon-Entropie. Die Spezialisierung des Metaboloms wird durch die durchschnittliche Spezifität eines einzelnen MS/MS-Spektrums gemessen. Daher wird der Anstieg der Häufigkeit bestimmter MS/MS-Klassen nach Herbivoreninduktion in spektrale Induzierbarkeit, RDPI und Spezialisierung, d. h. in einen Anstieg des δj-Index, umgewandelt, da spezialisiertere Metabolite produziert werden und ein hoher Si-Index entsteht. Die Verringerung des Hj-Diversitätsindex spiegelt wider, dass entweder die Anzahl der generierten MS/MS reduziert ist oder sich die Häufigkeitsverteilung des Profils in eine weniger einheitliche Richtung verändert, während gleichzeitig die Gesamtunsicherheit verringert wird. Mithilfe der Berechnung des Si-Index lässt sich hervorheben, welche MS/MS durch bestimmte Herbivoren induziert werden und welche MS/MS im Gegensatz dazu nicht auf die Induktion reagieren. Dies ist ein wichtiger Indikator zur Unterscheidung von MT und OD-Vorhersagen.
(A) Statistische Deskriptoren für die MS/MS-Dateninduzierbarkeit (RDPI), Diversität (Hj-Index), Spezialisierung (δj-Index) und Metabolitspezifität (Si-Index) bei Herbivoren (H1 bis Hx). Ein höherer Spezialisierungsgrad (δj) deutet auf eine durchschnittliche Produktion herbivorerspezifischer Metaboliten hin, während eine geringere Diversität (Hj) eine reduzierte Metabolitproduktion oder eine ungleichmäßige Metabolitverteilung anzeigt. Der Si-Wert gibt an, ob ein Metabolit spezifisch für einen bestimmten Zustand (hier: Herbivoren) ist oder ob seine Konzentration konstant bleibt. (B) Konzeptuelles Diagramm der Vorhersage der Verteidigungstheorie anhand der Informationstheorie. Die Verteidigungstheorie sagt voraus, dass ein Herbivorenangriff die Produktion von Verteidigungsmetaboliten erhöht und dadurch δj steigert. Gleichzeitig sinkt Hj, da das Profil aufgrund der reduzierten Unsicherheit der metabolischen Information neu organisiert wird. Die MT-Theorie sagt voraus, dass der Angriff von Pflanzenfressern zu ungerichteten Veränderungen im Metabolom führt, wodurch Hj als Indikator für erhöhte metabolische Informationsunsicherheit ansteigt und eine zufällige Verteilung von Si verursacht wird. Wir haben außerdem ein Mischmodell, das beste MT-Modell, vorgeschlagen, in dem einige Metaboliten mit höherem Abwehrwert besonders stark erhöht sind (hoher Si-Wert), während andere zufällige Reaktionen zeigen (niedrigerer Si-Wert).
Mithilfe informationstheoretischer Deskriptoren interpretieren wir die OD-Theorie dahingehend, dass herbivoreninduzierte Veränderungen spezieller Metabolite in einem nicht-induzierten konstitutiven Zustand zu (i) einer Erhöhung der metabolischen Spezifität (Si-Index) führen, die die metabonomische Spezifität (δj-Index) bedingt – d. h. die Zunahme bestimmter Gruppen spezieller Metabolite mit höherem Verteidigungswert – und (ii) einer Abnahme der Metabolomdiversität (Hj-Index) aufgrund der Verschiebung der metabolischen Häufigkeitsverteilung hin zu einer stärkeren Verteilung von Leptin-Körpern. Auf der Ebene eines einzelnen Metaboliten wird eine geordnete Si-Verteilung erwartet, wobei der Metabolit den Si-Wert entsprechend seinem Verteidigungswert erhöht (Abbildung 1B). In diesem Zusammenhang erklären wir die MT-Theorie dahingehend, dass die Anregung zu (i) ungerichteten Veränderungen der Metabolite führt, was eine Abnahme des δj-Index zur Folge hat, und (ii) zu einer Zunahme des Hj-Index aufgrund einer erhöhten metabolischen Unsicherheit bzw. Zufälligkeit, die durch die Shannon-Entropie in Form von generalisierter Diversität quantifiziert werden kann. Bezüglich der metabolischen Zusammensetzung sagt die MT-Theorie eine zufällige Verteilung von Si voraus. Da bestimmte Metaboliten unter spezifischen Bedingungen eine andere Wirkung zeigen und ihr Schutzwert von der Umgebung abhängt, haben wir ein gemischtes Schutzmodell vorgeschlagen. In diesem Modell sind δj und Hj entlang der Si-Achse in zwei Richtungen verteilt. Si nimmt in alle Richtungen zu, wobei nur bestimmte Metabolitgruppen mit höherem Schutzwert Si besonders stark erhöhen, während andere eine zufällige Verteilung aufweisen (Abbildung 1B).
Um die Vorhersage der neu definierten Verteidigungstheorie anhand des informationstheoretischen Deskriptors zu testen, züchteten wir pflanzenfressende Raupen (Experten- bzw. Generalistenraupen) auf den Blättern von Nepenthes pallens (Abbildung 2A). Mittels MS/MS-Analyse gewannen wir 599 nicht-redundante MS/MS-Spektren (Datendatei S1) aus Methanolextrakten von Blattgewebe, das nach der Fressphase der Raupen entnommen wurde. Die Visualisierung der Informationsgehaltsrekonfiguration in den MS/MS-Konfigurationsdateien mithilfe der Indizes RDPI, Hj und δj zeigt interessante Muster (Abbildung 2B). Der allgemeine Trend ist, dass – wie im Informationsdeskriptor beschrieben – der Grad der gesamten metabolischen Reorganisation mit der Zeit zunimmt, je mehr Blätter die Raupen fressen: 72 Stunden nach der Fressphase steigt der RDPI signifikant an. Im Vergleich zur unbeschädigten Kontrolle war Hj signifikant reduziert, was auf den erhöhten Spezialisierungsgrad des Stoffwechselprofils zurückzuführen ist, der durch den δj-Index quantifiziert wurde. Dieser beobachtete Trend stimmt mit den Vorhersagen der OD-Theorie überein, steht jedoch im Widerspruch zu den Hauptvorhersagen der MT-Theorie, die davon ausgeht, dass zufällige (nicht gerichtete) Veränderungen der Metabolitkonzentrationen als defensive Tarnung dienen (Abbildung 1B). Obwohl sich die Elicitor-Konzentration im oralen Sekret (OS) und das Fressverhalten dieser beiden Herbivoren unterscheiden, führte ihre direkte Nahrungsaufnahme während der 24- und 72-stündigen Erntezeiträume zu ähnlichen Veränderungen der Richtungen von Hj und δj. Der einzige Unterschied trat 72 Stunden nach der ersten Nahrungsaufnahme (RDPI) auf. Im Vergleich zur durch die Nahrungsaufnahme von Ms induzierten Stoffwechselaktivität war die durch die Nahrungsaufnahme von Sl induzierte Gesamtstoffwechselaktivität höher.
(A) Versuchsaufbau: Hausschweine (S1) oder erfahrene Pflanzenfresser (Ms) wurden mit entsalzten Blättern von Kannenpflanzen gefüttert. Zur Simulation von Pflanzenfraß wurde das OS von Ms (W + OSMs) verwendet, um die Verletzung standardisierter Blattpositionen zu handhaben. S1 (W + OSMs)-Larven oder Wasser (W + W) wurden gefüttert. Die Kontrolle (C) bestand aus einem unbeschädigten Blatt. (B) Induzierbarkeit (RDPI im Vergleich zur Kontrollkarte), Diversität (Hj-Index) und Spezialisierung (δj-Index) wurden für die spezielle Metabolitenkarte (599 MS/MS; Datendatei S1) berechnet. Asteriske kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen der direkten Pflanzenfresserfütterung und der Kontrollgruppe (Student-t-Test mit gepaartem t-Test, *P<0,05 und ***P<0,001). ns, nicht signifikant. (C) Zeitlicher Auflösungsindex des Hauptmetabolitenspektrums (blauer Kasten: Aminosäuren, organische Säuren und Zucker; Datendatei S2) und des Spektrums spezieller Metaboliten (roter Kasten: 443 MS/MS; Datendatei S1) nach simulierter Herbivoriebehandlung. Die Farbskala gibt das 95%-Konfidenzintervall an. Der Stern markiert einen signifikanten Unterschied zwischen der Behandlung und der Kontrolle [quadratische Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt vom Tukey-HSD-Test für multiple Post-hoc-Vergleiche, *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001]. (D) Darstellung der Streudiagramme und Profile spezieller Metaboliten (wiederholte Proben mit unterschiedlichen Behandlungen).
Um zu untersuchen, ob sich die durch Pflanzenfresser hervorgerufene Umstrukturierung des Metaboloms in den Veränderungen der Konzentrationen einzelner Metaboliten widerspiegelt, konzentrierten wir uns zunächst auf die Metaboliten, die bereits in den Blättern von Nepenthes pallens mit nachgewiesener Pflanzenfresserresistenz untersucht wurden. Phenolamide sind Hydroxyzimtsäureamid-Polyamin-Konjugate, die sich während des Fraßvorgangs von Insekten anreichern und bekanntermaßen die Leistungsfähigkeit der Insekten beeinträchtigen (32). Wir suchten nach den Vorläufern der entsprechenden MS/MS-Spektren und stellten deren kumulative Kinetikkurven dar (Abbildung S1). Erwartungsgemäß werden Phenolderivate, die nicht direkt an der Abwehr gegen Pflanzenfresser beteiligt sind, wie Chlorogensäure (CGA) und Rutin, nach dem Fraß herunterreguliert. Im Gegensatz dazu können Pflanzenfresser Phenolamide hochwirksam machen. Die kontinuierliche Fütterung mit den beiden Pflanzenfressern führte zu einem nahezu identischen Anregungsspektrum der Phenolamide, wobei dieses Muster besonders deutlich bei der Neusynthese von Phenolamiden zu beobachten war. Das gleiche Phänomen wird bei der Untersuchung des 17-Hydroxygeranyl-Nonandiol-Diterpenglykosid-(17-HGL-DTG)-Stoffwechselwegs beobachtet, der eine große Anzahl acyclischer Diterpene mit effektiven Anti-Herbivoren-Funktionen (33) hervorbringt, von denen Ms Feeding with Sl ein ähnliches Expressionsprofil auslöste (Abbildung S1)).
Ein möglicher Nachteil direkter Fraßversuche mit Pflanzenfressern liegt in der unterschiedlichen Blattfraßrate und Fressdauer der Pflanzenfresser. Dies erschwert die Eliminierung pflanzenfresserspezifischer Effekte, die durch Verletzungen und Pflanzenfresser verursacht werden. Um die Pflanzenfresserspezifität der induzierten Blattstoffwechselreaktion besser zu erfassen, simulierten wir die Nahrungsaufnahme von Ms- und Sl-Larven, indem wir frisch gesammelte organische Substanzen (OSM und OSS1) unmittelbar auf die standardisierte Punktionsstelle W an gleichbleibenden Blattpositionen auftrugen. Dieses Verfahren, die sogenannte W + OS-Behandlung, standardisiert die Induktion durch präzise zeitliche Abstimmung des Beginns der durch den Pflanzenfresser ausgelösten Reaktion, ohne störende Effekte durch Unterschiede in der Rate oder Menge des Gewebeverlusts zu verursachen (Abbildung 2A) (34). Mithilfe der MS/MS-Analyse- und Berechnungspipeline erhielten wir 443 MS/MS-Spektren (Datendatei S1), die sich mit den zuvor aus direkten Fraßversuchen gewonnenen Spektren überschnitten. Die informationstheoretische Analyse dieses MS/MS-Datensatzes zeigte, dass die Reprogrammierung blattspezifischer Metabolome durch die Simulation von Herbivoren OS-spezifische Induktionen aufwies (Abbildung 2C). Insbesondere führte OSM im Vergleich zur OSS1-Behandlung nach 4 Stunden zu einer verstärkten Metabolomspezialisierung. Bemerkenswert ist, dass die im zweidimensionalen Raum visualisierte Stoffwechselkinetik (mit Hj und δj als Koordinaten) und die Richtung der Metabolomspezialisierung als Reaktion auf die simulierte Herbivorenbehandlung im Zeitverlauf konsistent zunahmen (Abbildung 2D). Gleichzeitig quantifizierten wir den Gehalt an Aminosäuren, organischen Säuren und Zuckern (Datensatz S2), um zu untersuchen, ob diese gezielte Zunahme der Metabolomspezialisierung auf die Rekonfiguration des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels als Reaktion auf die simulierten Herbivoren zurückzuführen ist (Abbildung S2). Um dieses Muster besser zu erklären, überwachten wir darüber hinaus die metabolische Akkumulationskinetik der zuvor diskutierten Phenolamid- und 17-HGL-DTG-Stoffwechselwege. Die OS-spezifische Induktion bei Herbivoren führt zu einem differenziellen Umlagerungsmuster im Phenolamid-Stoffwechsel (Abbildung S3). Phenolamide mit Cumarin- und Kaffeesäureresten werden bevorzugt durch OSS1 induziert, während OSMs eine spezifische Induktion von Ferulylkonjugaten auslösen. Für den 17-HGL-DTG-Stoffwechselweg wurde eine differenzielle OS-Induktion durch nachgeschaltete Malonylierungs- und Dimalonylierungsprodukte nachgewiesen (Abbildung S3).
Anschließend untersuchten wir die OS-induzierte Transkriptomplastizität anhand eines zeitlich gestaffelten Microarray-Datensatzes. Dieser simuliert die Anwendung von OSMs zur Behandlung der Blätter von Rosettenpflanzen in Herbivoren. Die Kinetik der Probenahme deckt sich im Wesentlichen mit der in dieser Metabolomik-Studie verwendeten Kinetik (35). Im Vergleich zur Metabolom-Rekonfiguration, bei der die metabolische Plastizität im Zeitverlauf besonders zunimmt, beobachten wir in durch Ms induzierten Blättern vorübergehende Transkriptionsspitzen. Dabei erreichen die Transkriptom-Induzierbarkeit (RDPI) und die Spezialisierung (δj) zu diesem Zeitpunkt einen signifikanten Anstieg. Die Diversität (Hj) nimmt zu diesem Zeitpunkt signifikant zu, die Expression von BMP1 ist signifikant reduziert, gefolgt von einer Abschwächung der Transkriptom-Spezialisierung (Abbildung S4). Metabolische Genfamilien (wie P450, Glycosyltransferasen und BAHD-Acyltransferasen) sind an der Assemblierung spezieller Metaboliten aus Struktureinheiten des Primärstoffwechsels beteiligt und folgen dem oben genannten Modell der frühen Hochspezialisierung. Als Fallbeispiel wurde der Phenylalanin-Stoffwechselweg analysiert. Die Analyse bestätigte, dass die Kerngene des Phenolamid-Stoffwechsels in Herbivoren im Vergleich zu nicht angelockten Pflanzen stark durch oxidativen Stress induziert werden und in ihren Expressionsmustern eng beieinander liegen. Der Transkriptionsfaktor MYB8 und die Strukturgenen PAL1, PAL2, C4H und 4CL, die diesem Stoffwechselweg vorgelagert sind, zeigten einen frühen Beginn der Transkription. Acyltransferasen, die an der finalen Synthese von Phenolamid beteiligt sind, wie AT1, DH29 und CV86, weisen ein anhaltendes Hochregulationsmuster auf (Abbildung S4). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die frühe Spezialisierung des Transkriptoms und die spätere Verstärkung der Spezialisierung des Metaboloms gekoppelt sind. Dies könnte auf ein synchrones Regulationssystem zurückzuführen sein, das eine starke Abwehrreaktion auslöst.
Die Umstrukturierung der pflanzlichen Hormonsignalwege fungiert als regulatorische Ebene, die Informationen über Herbivoren integriert, um die Pflanzenphysiologie umzuprogrammieren. Nach der Herbivorensimulation haben wir die kumulative Dynamik wichtiger Pflanzenhormonkategorien gemessen und deren zeitliche Koexpression visualisiert (Pearson-Korrelationskoeffizient (PCC) > 0,4) (Abbildung 3A). Wie erwartet, sind biosyntheserelevante Pflanzenhormone innerhalb des Koexpressionsnetzwerks der Pflanzenhormone verknüpft. Zusätzlich wurde die metabolische Spezifität (Si-Index) diesem Netzwerk zugeordnet, um die durch verschiedene Behandlungen induzierten Pflanzenhormone hervorzuheben. Zwei Hauptbereiche herbivorierspezifischer Reaktionen wurden identifiziert: einer im JA-Cluster, wo JA (seine biologisch aktive Form JA-Ile) und andere JA-Derivate den höchsten Si-Wert aufweisen; der andere im Ethylen-Cluster (ET). Gibberellin zeigte nur einen moderaten Anstieg der Herbivorenspezifität, während andere Pflanzenhormone wie Cytokinin, Auxin und Abscisinsäure eine geringe Induktionsspezifität für Herbivoren aufwiesen. Im Vergleich zur alleinigen Verwendung von W + W kann die Verstärkung des Spitzenwerts von JA-Derivaten durch die OS-Anwendung (W + OS) im Wesentlichen in einen starken spezifischen Indikator für JAs umgewandelt werden. Überraschenderweise ist bekannt, dass OSM und OSS1 mit unterschiedlichem Elicitorgehalt eine ähnliche Akkumulation von JA und JA-Ile verursachen. Im Gegensatz zu OSS1 wird OSM spezifisch und stark durch OSMs induziert, während OSS1 die Reaktion basaler Wunden nicht verstärkt (Abbildung 3B).
(A) Analyse des Koexpressionsnetzwerks basierend auf der PCC-Berechnung der Simulation der durch Herbivoren induzierten Akkumulationskinetik von Pflanzenhormonen. Jeder Knoten repräsentiert ein einzelnes Pflanzenhormon, und seine Größe gibt den spezifischen Si-Index des jeweiligen Pflanzenhormons zwischen den Behandlungen an. (B) Akkumulation von JA, JA-Ile und ET in Blättern nach verschiedenen Behandlungen (farblich gekennzeichnet: aprikosefarben, W + OSM; blau, W + OSM; schwarz, W + W; grau, C (Kontrolle)). Asterisken kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen Behandlung und Kontrolle (zweifaktorielle ANOVA mit anschließendem Tukey-HSD-Post-hoc-Test, *** P < 0,001). Informationstheoretische Analyse von (C) 697 MS/MS (Datensatz S1) in der JA-Biosynthese und dem beeinträchtigten Wahrnehmungsspektrum (irAOC und irCOI1) sowie (D) 585 MS/MS (Datensatz S1) in ETR1 mit beeinträchtigtem ET-Signal. Zwei simulierte Herbivorenbehandlungen induzierten die Expression in Pflanzenlinien und in Kontrollpflanzen mit leerem Vehikel (EV). Sternchen kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen der W+OS-Behandlung und der unbeschädigten Kontrolle (zweifaktorielle ANOVA mit anschließendem Tukey-HSD-Post-hoc-Test, *P<0,05, **P<0,01 und ***P<0,001). (E) Streudiagramme der Streuung der Opposition zur Spezialisierung. Die Farben repräsentieren verschiedene gentechnisch veränderte Stämme; die Symbole repräsentieren verschiedene Behandlungsmethoden: Dreieck, W + OSS1; Rechteck, W + OSM; Kreis C
Anschließend analysierten wir mithilfe eines gentechnisch veränderten, abgeschwächten Nepenthes-Stammes (irCOI1 und sETR1) in den Schlüsselschritten der JA- und ET-Biosynthese (irAOC und irACO) sowie deren Wahrnehmung (irCOI1 und sETR1) den Metabolismus dieser beiden Pflanzenhormone unter dem Einfluss von Herbivoren und den relativen Beitrag der Reprogrammierung. In Übereinstimmung mit früheren Experimenten bestätigten wir die Induktion von Herbivoren-OS in Pflanzen mit leerem Träger (EV) (Abbildung 3, C bis D) und die allgemeine Abnahme des Hj-Index durch OSM, während der δj-Index anstieg. Diese Reaktion ist ausgeprägter als die durch OSS1 ausgelöste. Ein Zwei-Linien-Diagramm mit Hj und δj als Koordinaten zeigt die spezifische Deregulierung (Abbildung 3E). Der auffälligste Trend ist, dass in Stämmen ohne JA-Signal die durch Herbivoren verursachten Veränderungen der Metabolomdiversität und -spezialisierung nahezu vollständig eliminiert werden (Abbildung 3C). Im Gegensatz dazu schwächt die stille ET-Wahrnehmung in sETR1-Pflanzen, obwohl der Gesamteffekt auf Veränderungen im Herbivorenstoffwechsel deutlich geringer ist als der der JA-Signalgebung, den Unterschied in den Hj- und δj-Indizes zwischen OSM- und OSS1-Stimulationen ab (Abbildung 3D und Abbildung S5). Dies deutet darauf hin, dass die ET-Signaltransduktion neben ihrer Kernfunktion der JA-Signaltransduktion auch der Feinabstimmung der artspezifischen Stoffwechselreaktion von Herbivoren dient. Entsprechend dieser Feinabstimmungsfunktion zeigte sich in sETR1-Pflanzen keine Veränderung der allgemeinen Induzierbarkeit des Metaboloms. Im Vergleich zu sETR1-Pflanzen induzierten irACO-Pflanzen hingegen ähnliche Gesamtamplituden von durch Herbivoren hervorgerufenen Stoffwechselveränderungen, wiesen aber signifikant unterschiedliche Hj- und δj-Werte zwischen OSM- und OSS1-Stimulationen auf (Abbildung S5).
Um spezialisierte Metabolite zu identifizieren, die wesentlich zur artspezifischen Reaktion von Herbivoren beitragen, und deren Produktion mittels ET-Signalen feinabzustimmen, verwendeten wir die zuvor entwickelte strukturelle MS/MS-Methode. Diese Methode basiert auf dem Bi-Clustering-Verfahren, um die Metabolitenfamilie aus MS/MS-Fragmenten [normalisiertes Punktprodukt (NDP)] und einem Ähnlichkeitswert basierend auf dem Neutralverlust (NL) abzuleiten. Der durch die Analyse von ET-transgenen Linien erstellte MS/MS-Datensatz umfasste 585 MS/MS-Spektren (Datendatei S1), die durch Clustering in sieben Haupt-MS/MS-Module (M) unterteilt wurden (Abbildung 4A). Einige dieser Module enthalten viele zuvor charakterisierte Spezialmetaboliten: Beispielsweise sind M1, M2, M3, M4 und M7 reich an verschiedenen Phenolderivaten (M1), Flavonoidglykosiden (M2), Acylzuckern (M3 und M4) und 17-HGL-DTG (M7). Zusätzlich wird die metabolische Spezifität (Si-Index) eines einzelnen Metaboliten in jedem Modul berechnet und dessen Si-Verteilung anschaulich dargestellt. Kurz gesagt: MS/MS-Spektren mit hoher Herbivorie- und Genotypspezifität zeichnen sich durch hohe Si-Werte aus, und die Kurtosis-Statistik deutet auf eine Verteilung der Hauptkomponenten hin. Eine solche Verteilung mit geringer Kolloidkonzentration wurde in M1 nachgewiesen, wobei Phenolamid den höchsten Si-Anteil aufwies (Abbildung 4B). Das bereits erwähnte herbivore, induzierbare 17-HGL-DTG in M7 zeigte einen moderaten Si-Wert, was auf eine moderate differentielle Regulation zwischen den beiden OS-Typen hindeutet. Im Gegensatz dazu weisen die meisten konstitutiv produzierten Spezialmetaboliten, wie Rutin, CGA und Acylzucker, die niedrigsten Si-Werte auf. Um die strukturelle Komplexität und die Si-Verteilung zwischen den Spezialmetaboliten besser zu untersuchen, wurde für jedes Modul ein molekulares Netzwerk erstellt (Abbildung 4B). Eine wichtige Vorhersage der OD-Theorie (zusammengefasst in Abbildung 1B) ist, dass die Reorganisation spezieller Metaboliten nach Fraßschäden zu einseitigen Veränderungen von Metaboliten mit hohem Verteidigungswert führen sollte, insbesondere durch Erhöhung ihrer Spezifität (im Gegensatz zu einer zufälligen Verteilung). Die meisten der in M1 akkumulierten Phenolderivate stehen in funktionellem Zusammenhang mit der verminderten Leistungsfähigkeit der Insekten (32). Beim Vergleich der Si-Werte der M1-Metaboliten zwischen den induzierten Blättern und den Blättern der EV-Kontrollpflanzen nach 24 Stunden beobachteten wir einen signifikanten Anstieg der metabolischen Spezifität vieler Metaboliten nach Fraßschäden (Abbildung 4C). Der spezifische Anstieg des Si-Wertes wurde nur bei defensiven Phenolamiden festgestellt, nicht jedoch bei anderen Phenolen und unbekannten Metaboliten, die in diesem Modul koexistieren. Dies ist ein spezialisiertes Modell, das mit der OD-Theorie verwandt ist. Die wichtigsten Vorhersagen der durch Herbivoren verursachten metabolischen Veränderungen stimmen überein. Um zu prüfen, ob diese Besonderheit des Phenolamid-Spektrums durch OS-spezifische ET induziert wurde, stellten wir den Metaboliten-Si-Index und den differentiellen Expressionswert zwischen OSM und OSS1 in den EV- und sETR1-Genotypen dar (Abbildung 4D). In sETR1 war der Phenamid-induzierte Unterschied zwischen OSM und OSS1 deutlich reduziert. Die Bi-Clustering-Methode wurde auch auf MS/MS-Daten angewendet, die in Stämmen mit unzureichender JA gewonnen wurden, um die wichtigsten MS/MS-Module zu identifizieren, die mit der JA-regulierten metabolischen Spezialisierung zusammenhängen (Abbildung S6).
(A) Die Clusteranalyse von 585 MS/MS-Spektren basierend auf gemeinsamen Fragmenten (NDP-Ähnlichkeit) und gemeinsamen neutralen Verlusten (NL-Ähnlichkeit) führt zu Modulen (M), die entweder mit bekannten Stoffgruppen übereinstimmen oder auf unbekannte bzw. schlecht metabolisierbare Metaboliten hinweisen. Neben jedem Modul ist die Metaboliten-spezifische Verteilung (Si) dargestellt. (B) Modulares Molekülnetzwerk: Knoten repräsentieren MS/MS-Spektren, Kanten NDP- (rot) und NL-MS/MS-Scores (blau) (Cut-off > 0,6). Der abgestufte Metaboliten-Spezifitätsindex (Si) ist modulabhängig farblich dargestellt (links) und dem Molekülnetzwerk zugeordnet (rechts). (C) Modul M1 der EV-Pflanze im konstitutiven (Kontrolle) und induzierten Zustand (simulierter Herbivoren) nach 24 Stunden: Molekülnetzwerkdiagramm (Si-Wert entspricht der Knotengröße; das defensive Phenolamid ist blau hervorgehoben). (D) Das M1-Molekülnetzwerkdiagramm der Spektrallinie sETR1 mit beeinträchtigter EV- und ET-Wahrnehmung: Die phenolische Verbindung wird durch den grünen Kreisknoten dargestellt, und der signifikante Unterschied (p-Wert) zwischen den Behandlungen W + OSM und W + OSS1 wird als Knotengröße angegeben. CP, N-Caffeoyl-Tyrosin; CS, N-Caffeoyl-Spermidin; FP, N-Ferulasäureester-Harnsäure; FS, N-Ferulyl-Spermidin; CoP, N',N"-Cumarolyl-Tyrosin; DCS, N',N"-Dicaffeoyl-Spermidin; CFS, N',N"-Caffeoyl-Feruloyl-Spermidin; Lycium barbarum in Goji-Beeren; O-AS, O-Acylzucker.
Wir weiteten die Analyse von einem einzelnen abgeschwächten Nepenthes-Genotyp auf natürliche Populationen aus, in denen bereits starke intraspezifische Veränderungen der JA-Konzentrationen und spezifischer Metabolitkonzentrationen nach Herbivorenfraß beschrieben wurden (26). Anhand dieses Datensatzes untersuchten wir 43 Genbanken. Diese Genbanken umfassen 123 Pflanzenarten der Art N. pallens. Die Pflanzen stammen aus Samen, die in verschiedenen natürlichen Habitaten in Utah, Nevada, Arizona und Kalifornien gesammelt wurden (Abbildung S7). Wir berechneten die Metabolomdiversität (hier als Populationsdiversität bezeichnet) und die durch OSM verursachte Spezialisierung. In Übereinstimmung mit früheren Studien beobachteten wir eine große Bandbreite an Stoffwechselveränderungen entlang der Hj- und δj-Achsen, was darauf hindeutet, dass die Genbanken signifikante Unterschiede in der Plastizität ihrer Stoffwechselreaktionen auf Herbivoren aufweisen (Abbildung S7). Diese Struktur ähnelt früheren Beobachtungen zum dynamischen Bereich der durch Herbivoren verursachten JA-Veränderungen und weist in einer einzelnen Population einen sehr hohen Wert auf (26, 36). Durch die Verwendung von JA und JA-Ile zur Prüfung der Korrelation zwischen Hj und δj konnten wir eine signifikante positive Korrelation zwischen JA und dem β-Diversitäts- und Spezialisierungsindex des Metaboloms feststellen (Abbildung S7). Dies deutet darauf hin, dass die auf Populationsebene beobachtete, durch Pflanzenfresser hervorgerufene Heterogenität der JA-Induktion auf wichtige metabolische Polymorphismen zurückzuführen sein könnte, die durch die Selektion durch pflanzenfressende Insekten verursacht wurden.
Frühere Studien haben gezeigt, dass sich Tabakarten hinsichtlich Art und relativer Abhängigkeit von induzierten und konstitutiven metabolischen Abwehrmechanismen stark unterscheiden. Es wird angenommen, dass diese Veränderungen in der Signaltransduktion und den Abwehrfähigkeiten gegen Pflanzenfresser durch den Insektenpopulationsdruck, den Lebenszyklus der Pflanze und die Kosten der Abwehrproduktion in der jeweiligen ökologischen Nische reguliert werden. Wir untersuchten die Konsistenz der durch Pflanzenfresser induzierten Umstrukturierung des Blattmetaboloms von sechs in Nord- und Südamerika heimischen Nicotiana-Arten. Diese Arten sind eng mit Nepenthes North America verwandt, nämlich *Nicotiana bociflo*, *N. nicotinis*, *Nicotiana attenuated grass*, *Nicotiana tabacum*, *Nicotiana spegazzinii* und *Nicotiana obtusifolia* (Abbildung 5A) (37). Sechs dieser Arten, darunter die gut charakterisierte Art *N. please*, sind einjährige Pflanzen der Petunien-Klade, während *N. obtusifolia* mehrjährig zur Schwesterklade Trigonophyllae gehört (38). Anschließend wurden an diesen sieben Arten W + W-, W + OSM- und W + OSS1-Induktionen durchgeführt, um die metabolische Umstrukturierung der Insektenernährung auf Artenebene zu untersuchen.
(A) Ein Bootstrap-Phylogeniebaum basierend auf Maximum-Likelihood [für die nukleäre Glutaminsynthese (38)] und die geografische Verbreitung von sieben eng verwandten Nicotiana-Arten (unterschiedliche Farben) (37). (B) Ein Streudiagramm der spezialisierten Diversität der Stoffwechselprofile von sieben Nicotiana-Arten (939 MS/MS; Datensatz S1). Auf Artenebene korreliert die Metabolomdiversität negativ mit dem Spezialisierungsgrad. Die Analyse der Korrelation zwischen Stoffwechseldiversität und Spezialisierung sowie JA-Akkumulation auf Artenebene ist in Abbildung 2 dargestellt. S9. Farbe: verschiedene Typen; Dreieck: W + OSS1; Rechteck: W + OSM. (C) Die Dynamik von Nicotiana JA und JA-Ile ist nach der OS-Anregungsamplitude geordnet (zweifaktorielle ANOVA und Tukey-HSD-Post-hoc-Test, * P < 0,05, ** P < 0,01 und ** für den Vergleich von W + OS und W + W, P < 0,001). Boxplot der (D) Diversität und (E) Spezialisierung jeder Art nach Simulation von Herbivorie und Methyljasmonat (MeJA). Der Stern kennzeichnet den signifikanten Unterschied zwischen W + OS und W + W oder Lanolin plus W (Lan + W) oder Lan plus MeJA (Lan + MeJa) und der Lan-Kontrolle (zweifaktorielle Varianzanalyse, gefolgt von Tukey-HSD-Post-hoc-Test für Mehrfachvergleiche, *P<0,05, **P<0,01 und ***P<0,001).
Mithilfe der Dual-Cluster-Methode identifizierten wir 9 Module von 939 MS/MS (Datendatei S1). Die Zusammensetzung der durch verschiedene Behandlungen rekonfigurierten MS/MS variiert stark zwischen den Modulen und Arten (Abbildung S8). Die Visualisierung von Hj (hier als γ-Diversität auf Artenebene bezeichnet) und δj zeigt, dass sich verschiedene Arten im metabolischen Raum in sehr unterschiedliche Gruppen gruppieren, wobei die Unterscheidung auf Artenebene in der Regel stärker ausgeprägt ist als die Anregung. Mit Ausnahme von N. linear und N. obliquus weisen diese Arten einen großen dynamischen Bereich an Induktionseffekten auf (Abbildung 5B). Im Gegensatz dazu zeigen Arten wie N. purpurea und N. obtusifolia eine weniger deutliche metabolische Reaktion auf die Behandlung, ihr Metabolom ist jedoch diverser. Die artspezifische Verteilung der induzierten metabolischen Reaktion führte zu einer signifikanten negativen Korrelation zwischen Spezialisierung und γ-Diversität (PCC = -0,46, P = 4,9 × 10⁻⁸). OS-induzierte Veränderungen der JA-Konzentrationen korrelieren positiv mit der Spezialisierung des Metaboloms und negativ mit der metabolischen Gamma-Diversität der jeweiligen Spezies (Abbildung 5B und Abbildung S9). Bemerkenswert ist, dass die in Abbildung 5C umgangssprachlich als „signalreaktive“ Spezies bezeichneten Arten, wie z. B. Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute und Nepenthes attenuated, nach 30 Minuten signifikante Anzeichen zeigten. Dies betrifft die kürzlich aufgetretenen OS-spezifischen JA- und JA-Ile-Ausbrüche. Andere Bakterien, die als „signalunreaktiv“ gelten, wie z. B. Nepenthes mills, Nepenthes powdery und N. obtusifolia, zeigten hingegen lediglich eine Induktion von JA-Ile Edge ohne OS-Spezifität (Abbildung 5C). Auf metabolischer Ebene wiesen die signalreaktiven Substanzen bei attenuated Nepenthes, wie bereits erwähnt, OS-Spezifität auf und erhöhten δj signifikant, während sie Hj reduzierten. Dieser OS-spezifische Priming-Effekt wurde in Arten, die als signalnichtreaktiv klassifiziert wurden, nicht beobachtet (Abbildung 5, D und E). OS-spezifische Metabolite treten häufiger zwischen signalreaktiven Arten auf, und diese Signalcluster gruppieren sich mit Arten mit schwächeren Signalreaktionen, während Arten mit schwächeren Signalreaktionen eine geringere Interdependenz aufweisen (Abbildung S8). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die OS-spezifische Induktion von JAs und die OS-spezifische Rekonfiguration des nachgeschalteten Metaboloms auf Artenebene gekoppelt sind.
Anschließend behandelten wir Pflanzen mit einer Lanolinpaste, die Methyl-Jasmin (MeJA) enthielt, um zu untersuchen, ob diese Kopplungsmechanismen durch die Verfügbarkeit von exogen zugeführtem Jasmin (JA) im Zytoplasma der Pflanzen eingeschränkt werden. Schnelle Deesterifizierung ist JA. Wir beobachteten denselben Trend des allmählichen Übergangs von signalreaktiven zu signalunreaktiven Spezies durch die kontinuierliche Zufuhr von JA (Abbildung 5, D und E). Kurz gesagt, die MeJA-Behandlung führte zu einer starken Umprogrammierung der Metabolome der linearen Nematoden N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens und N. mikimotoi, was einen signifikanten Anstieg von δj und eine Abnahme von Hj zur Folge hatte. N. purpurea zeigte lediglich einen Anstieg von δj, nicht aber von Hj. N. obtusifolia, von dem bereits bekannt ist, dass es extrem niedrige JA-Konzentrationen akkumuliert, reagierte ebenfalls nur schwach auf die MeJA-Behandlung hinsichtlich der Umstrukturierung des Metaboloms. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die JA-Produktion bzw. Signaltransduktion in signalunempfindlichen Arten physiologisch eingeschränkt ist. Um diese Hypothese zu überprüfen, untersuchten wir die vier Arten (N. pallens, N. mills, N. pink und N. microphylla) nach Stimulation mit W + W, W + OSMs und W + OSS1 (Transkriptom (39)). Entsprechend dem Muster der Metabolom-Umstrukturierung sind die Arten im Transkriptom deutlich voneinander getrennt. N. attenuated zeigte die höchste OS-induzierte RDPI, während N. gracilis die niedrigste aufwies (Abbildung 6A). Die durch N. oblonga induzierte Transkriptomdiversität war jedoch die geringste unter den vier Arten, im Gegensatz zur zuvor in sieben Arten nachgewiesenen höchsten metabolomischen Diversität von N. oblonga. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine Gruppe von Genen, die mit frühen Abwehrsignalen, einschließlich JA-Signalen, in Zusammenhang stehen, die Spezifität der durch herbivorenassoziierte Elicitoren induzierten frühen Abwehrreaktionen in Nicotiana-Arten erklärt (39). Der Vergleich der JA-Signalwege dieser vier Arten ergab ein interessantes Muster (Abbildung 6B). Die meisten Gene dieses Signalwegs, wie AOC, OPR3, ACX und COI1, zeigten in allen vier Arten eine relativ hohe Induktion. Das Schlüsselgen JAR4 wandelt JA jedoch in seine biologisch aktive Form, JA-Ile, um, dessen Transkriptionsgrad sehr niedrig ist, insbesondere in N. mills, Nepenthes pieris und N. microphylla. Darüber hinaus war das Transkript des Gens AOS in N. bifidum nicht nachweisbar. Diese Veränderungen der Genexpression könnten für die extremen Phänotypen verantwortlich sein, die durch die geringe JA-Produktion in signalanergischen Arten und die Induktion in N. gracilis hervorgerufen werden.
(A) Informationstheoretische Analyse der Umprogrammierung früher Transkriptionsantworten von vier eng verwandten Tabakarten, die 30 Minuten nach Herbivorieinduktion beprobt wurden. Der RDPI-Wert wurde durch Vergleich der durch den Herbivoren OS induzierten Blätter mit der Wundkontrolle berechnet. Die Farben kennzeichnen verschiedene Arten, die Symbole verschiedene Behandlungsmethoden. (B) Analyse der Genexpression in JA-Signalwegen der vier Arten. Der vereinfachte JA-Signalweg ist neben dem Boxplot dargestellt. Unterschiedliche Farben kennzeichnen verschiedene Verarbeitungsmethoden. Der Stern markiert einen signifikanten Unterschied zwischen der Behandlung W + OS und der Kontrolle W + W (Student-t-Test für paarweise Unterschiede: *P<0,05, **P<0,01 und ***P<0,001). OPDA: 12-Oxophytodiensäure; OPC-8: 0,3-Oxo-2-(2′(Z)-pentenyl)-cyclopentan-1-octansäure.
Im letzten Teil untersuchten wir, wie die artspezifische Umgestaltung des Metaboloms verschiedener Pflanzenarten zur Resistenz gegen Herbivoren beitragen kann. Frühere Studien konzentrierten sich auf die Gattung Nicotiana. Deren Resistenz gegenüber Ms und Larven unterscheidet sich stark (40). Hier untersuchten wir den Zusammenhang zwischen diesem Modell und ihrer metabolischen Plastizität. Anhand der vier oben genannten Tabakarten und durch Testen der Korrelation zwischen der durch Herbivoren verursachten Diversität und Spezialisierung des Metaboloms und der Resistenz der Pflanzen gegenüber Ms und Sl stellten wir fest, dass Resistenz, Diversität und Spezialisierung gegenüber dem Generalisten Sl positiv korreliert sind, während die Korrelation zwischen Resistenz gegenüber spezialisierten Weibchen und Spezialisierung schwach und die Korrelation mit der Diversität nicht signifikant ist (Abbildung S10). Bezüglich der S1-Resistenz zeigten sowohl die abgeschwächten N. chinensis als auch N. gracilis, die zuvor sowohl JA-Signaltransduktionsniveaus als auch Metabolomplastizität aufwiesen, stark unterschiedliche Reaktionen auf die Herbivoreninduktion und wiesen zudem eine ähnlich hohe Resistenz auf.
In den letzten sechzig Jahren hat die Pflanzenabwehrtheorie einen theoretischen Rahmen geschaffen, auf dessen Grundlage Forscher zahlreiche Evolutions- und Funktionsvorhersagen zu spezialisierten Pflanzenmetaboliten getroffen haben. Die meisten dieser Theorien folgen nicht dem üblichen Verfahren starker Schlussfolgerungen (41). Sie stellen zentrale Vorhersagen (3) auf derselben Analyseebene auf. Wenn die Überprüfung dieser zentralen Vorhersagen die Analyse spezifischer Theorien ermöglicht, wird das Forschungsfeld dadurch gestärkt, während andere verworfen werden (42). Stattdessen trifft die neue Theorie Vorhersagen auf verschiedenen Analyseebenen und fügt eine neue Ebene deskriptiver Betrachtungen hinzu (42). Die beiden auf funktionaler Ebene vorgeschlagenen Theorien, MT und OD, lassen sich jedoch leicht als wichtige Vorhersagen zu spezialisierten Stoffwechselveränderungen durch Herbivoren erklären: Die OD-Theorie geht davon aus, dass Veränderungen im spezialisierten Stoffwechselraum stark gerichtet sind. Die MT-Theorie hingegen nimmt an, dass diese Veränderungen ungerichtet und zufällig im Stoffwechselraum verteilt sind und tendenziell zu Metaboliten mit hohem Abwehrwert führen. Bisherige Untersuchungen von OD- und MT-Vorhersagen basierten auf einer begrenzten Anzahl a priori definierter „Abwehr“-Verbindungen. Diese metabolitzentrierten Tests erlauben es nicht, Ausmaß und Verlauf der Metabolom-Rekonfiguration während des Pflanzenfraßes zu analysieren und führen nicht zu Tests innerhalb eines konsistenten statistischen Rahmens, um zentrale Vorhersagen zu treffen, die als Ganzes betrachtet werden können. Quantifizierung von Veränderungen im pflanzlichen Metabolom. Hier nutzten wir die innovative Technologie der computergestützten Massenspektrometrie (MS) und führten eine Dekonvolutions-MS-Analyse mit allgemein gültigen Deskriptoren der Informationstheorie durch, um die Unterscheidung zwischen den beiden auf globaler Metabolomik-Ebene vorgeschlagenen Modellen zu testen. Die Informationstheorie wurde in vielen Bereichen angewendet, insbesondere im Kontext der Biodiversitäts- und Nährstoffflussforschung (43). Soweit uns bekannt, ist dies jedoch die erste Anwendung zur Beschreibung des metabolischen Informationsraums von Pflanzen und zur Lösung ökologischer Probleme im Zusammenhang mit temporären metabolischen Veränderungen als Reaktion auf Umweltreize. Die Stärke dieser Methode liegt insbesondere in ihrer Fähigkeit, Muster innerhalb und zwischen Pflanzenarten zu vergleichen, um zu untersuchen, wie sich Pflanzenfresser von verschiedenen Arten zu interspezifischen makroevolutionären Mustern auf verschiedenen Evolutionsebenen entwickelt haben. Stoffwechsel.
Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) transformiert einen multivariaten Datensatz in einen dimensionsreduzierten Raum, um die Haupttrends der Daten zu erklären. Daher wird sie häufig als explorative Technik zur Datenanalyse eingesetzt, beispielsweise zur Dekonvolution des Metaboloms. Allerdings geht durch die Dimensionsreduktion ein Teil des Informationsgehalts verloren, und die PCA liefert keine quantitativen Informationen über Merkmale, die für die ökologische Theorie besonders relevant sind. Beispiele hierfür sind: Wie verändern Herbivoren die Diversität in spezialisierten Bereichen (z. B. Artenreichtum, Verbreitung und Abundanz) von Metaboliten? Welche Metaboliten sagen den induzierten Zustand eines bestimmten Herbivoren voraus? Aus der Perspektive von Spezifität, Diversität und Induzierbarkeit wird der Informationsgehalt des blattspezifischen Metabolitprofils analysiert. Dabei zeigt sich, dass die Nahrungsaufnahme von Herbivoren spezifische Stoffwechselprozesse aktivieren kann. Unerwarteterweise stellten wir fest, dass die resultierende Stoffwechselsituation nach den Angriffen der beiden Herbivoren (des nachtaktiven Generalisten Sl und des Solanaceae-Spezialisten Ms) – wie in den implementierten Indikatoren der Informationstheorie beschrieben – eine große Überlappung aufweist, obwohl sich ihr Fressverhalten und ihre Konzentration deutlich unterscheiden. Fettsäure-Aminosäure-Konjugat (FAC) ist ein Initiator in OS (31). Die Behandlung standardisierter Stichwunden mit Herbivoren-OS zeigte auch bei simulierter Herbivorenbehandlung einen ähnlichen Trend. Dieses standardisierte Verfahren zur Simulation der Pflanzenreaktion auf Herbivorenangriffe eliminiert die Störfaktoren, die durch Veränderungen im Fressverhalten der Herbivoren verursacht werden und zu unterschiedlichen Zeitpunkten zu unterschiedlich starken Schäden führen (34). FAC, das als Hauptursache für OSM bekannt ist, reduziert JAS und andere pflanzliche Hormonreaktionen in OSS1 um Hunderte Male (31). OSS1 verursachte jedoch ähnliche JA-Akkumulationswerte wie OSM. Es wurde bereits gezeigt, dass die JA-Reaktion in abgeschwächten Nepenthes-Arten sehr empfindlich auf OSM reagiert, wobei FAC seine Aktivität selbst bei einer Verdünnung von 1:1000 mit Wasser beibehält (44). Obwohl die FAC-Konzentration in OSS1 im Vergleich zu OSM sehr niedrig ist, reicht sie daher aus, um einen ausreichenden JA-Ausbruch zu induzieren. Frühere Studien haben gezeigt, dass porinähnliche Proteine ​​(45) und Oligosaccharide (46) als molekulare Hinweise zur Auslösung pflanzlicher Abwehrreaktionen in OSS1 dienen können. Es ist jedoch noch unklar, ob diese Auslöser in OSS1 für die in der vorliegenden Studie beobachtete JA-Akkumulation verantwortlich sind.
Obwohl nur wenige Studien die unterschiedlichen metabolischen Profile beschreiben, die durch die Anwendung verschiedener Herbivoren oder exogener JA oder SA (Salicylsäure) hervorgerufen werden (47), hat bisher niemand die herbivorenspezifische Störung im Pflanzen-Gras-Netzwerk und deren Auswirkungen auf den spezifischen Gesamtmetabolismus systematisch untersucht. Diese Analyse bestätigte weiterhin, dass die interne Hormonnetzwerkverbindung mit anderen Pflanzenhormonen als JAs die Spezifität der durch Herbivoren verursachten metabolischen Reorganisation prägt. Insbesondere stellten wir fest, dass der durch OSM verursachte ET signifikant höher war als der durch OSS1 verursachte. Dieser Befund steht im Einklang mit dem höheren FAC-Gehalt in OSM, der eine notwendige und hinreichende Bedingung für die Auslösung eines ET-Anstiegs darstellt (48). Im Kontext der Interaktion zwischen Pflanzen und Herbivoren ist die Signalwirkung von ET auf die pflanzenspezifische Metabolitdynamik noch sporadisch und betrifft nur eine einzige Verbindungsgruppe. Darüber hinaus verwendeten die meisten Studien die exogene Applikation von ET, seinen Vorstufen oder verschiedenen Inhibitoren zur Untersuchung der ET-Regulation. Diese exogenen chemischen Applikationen rufen jedoch zahlreiche unspezifische Nebenwirkungen hervor. Unseres Wissens stellt diese Studie die erste umfassende systematische Untersuchung der Rolle von ET bei der Erzeugung und Wahrnehmung beeinträchtigter transgener Pflanzen zur Koordination der pflanzlichen Metabolomdynamik dar. Die herbivorespezifische ET-Induktion kann letztendlich die Metabolomantwort modulieren. Besonders hervorzuheben ist die transgene Manipulation der ET-Biosynthese- (ACO) und -Wahrnehmungsgene (ETR1), die die herbivorespezifische De-novo-Akkumulation von Phenolamiden aufdeckte. Es wurde bereits gezeigt, dass ET die JA-induzierte Nikotinakkumulation durch die Regulation der Putrescin-N-Methyltransferase feinabstimmen kann (49). Mechanistisch ist jedoch unklar, wie ET die Phenamid-Induktion feinabstimmt. Neben der Signaltransduktionsfunktion von ET kann der Stoffwechselfluss auch auf S-Adenosyl-1-methionin umgeleitet werden, um die Bildung von Polyaminophenolamiden zu regulieren. S-Adenosyl-1-methionin ist ein ET und ein häufiges Zwischenprodukt im Biosyntheseweg der Polyamine. Der Mechanismus, durch den das ET-Signal den Phenolamidspiegel reguliert, bedarf weiterer Untersuchungen.
Aufgrund der Vielzahl spezieller Metabolite unbekannter Struktur war es lange Zeit trotz intensiver Forschung zu spezifischen Stoffwechselkategorien nicht möglich, die zeitlichen Veränderungen der metabolischen Diversität nach biologischen Interaktionen präzise zu erfassen. Aktuelle, informationstheoretische Analysen zeigen anhand von MS/MS-Spektren unvoreingenommener Metabolite, dass Herbivoren, die Pflanzenfresser fressen oder deren Verhalten simulieren, die Gesamtdiversität des Blattmetaboloms kontinuierlich reduzieren und gleichzeitig dessen Spezialisierungsgrad erhöhen. Dieser durch Herbivoren verursachte, vorübergehende Anstieg der Metabolomspezifität geht mit einem synergistischen Anstieg der Transkriptomspezifität einher. Das Merkmal, das am stärksten zu dieser verstärkten Metabolomspezialisierung beiträgt (mit einem höheren Si-Wert), ist der spezielle Metabolit mit der zuvor charakterisierten herbivoren Funktion. Dieses Modell stimmt mit den Vorhersagen der OD-Theorie überein, nicht jedoch mit den Vorhersagen der MT-Theorie bezüglich der Zufälligkeit der Metabolom-Reprogrammierung. Allerdings stimmen diese Daten auch mit der Vorhersage des gemischten Modells überein (bestes MT; Abbildung 1B), da andere uncharakterisierte Metaboliten mit unbekannten Abwehrfunktionen möglicherweise noch einer zufälligen Si-Verteilung folgen.
Ein bemerkenswertes Muster, das diese Forschung ebenfalls aufzeigt, ist, dass von der Mikroevolutionsebene (einzelne Pflanzen und Tabakpopulationen) bis hin zu einer größeren evolutionären Skala (eng verwandte Tabakarten) unterschiedliche Ebenen der evolutionären Organisation die „beste Verteidigung“ darstellen. Es bestehen signifikante Unterschiede in den Fähigkeiten von Herbivoren. Moore et al. (20) und Kessler und Kalske (1) schlugen unabhängig voneinander vor, die drei von Whittaker (50) ursprünglich unterschiedenen funktionellen Ebenen der Biodiversität in die konstitutiven und induzierten zeitlichen Veränderungen der chemischen Diversität umzuwandeln; diese Autoren fassten jedoch weder die Verfahren zur groß angelegten Metabolomdatenerfassung zusammen, noch beschreiben sie, wie die metabolische Diversität aus diesen Daten berechnet werden kann. In dieser Studie werden geringfügige Anpassungen an Whittakers funktioneller Klassifizierung vorgenommen, wobei die α-metabolische Diversität als die Diversität der MS/MS-Spektren in einer bestimmten Pflanze, die β-metabolische Diversität als der grundlegende intraspezifische Metabolismus einer Gruppe von Populationen im Raum und die γ-metabolische Diversität als eine Erweiterung der Analyse ähnlicher Arten betrachtet werden.
Das JA-Signal ist für eine Vielzahl von Stoffwechselreaktionen pflanzenfressender Organismen essenziell. Allerdings fehlen strenge quantitative Untersuchungen zum Beitrag der intraspezifischen Regulation der JA-Biosynthese zur Metabolomdiversität, und es ist weiterhin unklar, ob das JA-Signal ein allgemeiner Ansatzpunkt für stressinduzierte metabolische Diversifizierung auf einer höheren makroevolutionären Ebene ist. Wir beobachteten, dass die pflanzenfressende Lebensweise von Nepenthes-Arten eine Metabolomspezialisierung induziert und dass die Variation dieser Spezialisierung innerhalb der Nicotiana-Population sowie zwischen eng verwandten Nicotiana-Arten systematisch positiv mit der JA-Signalgebung korreliert. Darüber hinaus wird die durch einen einzelnen Genotyp induzierte metabolische Spezifität aufgehoben, wenn das JA-Signal beeinträchtigt ist (Abbildung 3, C und E). Da die Veränderungen des Stoffwechselspektrums der natürlich geschwächten Nepenthes-Populationen überwiegend quantitativer Natur sind, dürften die Veränderungen der metabolischen β-Diversität und -Spezifität in dieser Analyse größtenteils durch die starke Aktivierung metabolitreicher Verbindungskategorien bedingt sein. Diese Verbindungsklassen dominieren einen Teil des Metabolomprofils und führen zu einer positiven Korrelation mit JA-Signalen.
Da sich die biochemischen Mechanismen der eng verwandten Tabakarten stark unterscheiden, werden die Metaboliten qualitativ identifiziert, was einen analytischeren Ansatz ermöglicht. Die informationstheoretische Auswertung des erfassten Stoffwechselprofils zeigt, dass die Induktion durch Pflanzenfresser den Zielkonflikt zwischen metabolischer Gamma-Diversität und Spezialisierung verstärkt. Das JA-Signal spielt dabei eine zentrale Rolle. Die Zunahme der Metabolomspezialisierung stimmt mit der Hauptvorhersage der optischen Diffusion (OD) überein und korreliert positiv mit dem JA-Signal, während dieses negativ mit der metabolischen Gamma-Diversität korreliert. Diese Modelle deuten darauf hin, dass die OD-Kapazität von Pflanzen maßgeblich durch die Plastizität von JA bestimmt wird, sowohl auf mikroevolutionärer als auch auf evolutionärer Ebene. Experimente mit exogener JA-Applikation, die Defekte in der JA-Biosynthese umgehen, zeigen weiterhin, dass eng verwandte Tabakarten – analog zu ihrer durch Pflanzenfresser induzierten JA- und Metabolomplastizität – in signalresponsive und signalnicht-responsive Arten unterteilt werden können. Arten, die nicht auf das Signal reagieren, können aufgrund ihrer Unfähigkeit, endogenes JA zu produzieren, nicht reagieren und unterliegen daher physiologischen Einschränkungen. Dies könnte durch Mutationen in einigen Schlüsselgenen des JA-Signalwegs (AOS und JAR4 in N. crescens) verursacht werden. Dieses Ergebnis unterstreicht, dass diese interspezifischen makroevolutionären Muster hauptsächlich durch Veränderungen in der internen Hormonwahrnehmung und -reaktion bedingt sein könnten.
Neben der Interaktion zwischen Pflanzen und Herbivoren ist die Erforschung der metabolischen Diversität eng mit allen wichtigen theoretischen Fortschritten in der Forschung zur biologischen Anpassung an die Umwelt und zur Evolution komplexer phänotypischer Merkmale verknüpft. Dank der zunehmenden Datenmenge, die mit modernen MS-Instrumenten erfasst wird, können Hypothesen zur metabolischen Diversität nun über individuelle/kategoriebezogene Metabolitunterschiede hinausgehen und globale Analysen durchführen, um unerwartete Muster aufzudecken. Bei der groß angelegten Analyse ist die Idee, aussagekräftige Karten zu erstellen, die zur Datenexploration genutzt werden können, eine wichtige Metapher. Ein wichtiges Ergebnis der aktuellen Kombination von unvoreingenommener MS/MS-Metabolomik und Informationstheorie ist daher die Bereitstellung einer einfachen Metrik, mit der Karten erstellt werden können, um die metabolische Diversität auf verschiedenen taxonomischen Ebenen zu erfassen. Dies ist eine Grundvoraussetzung dieser Methode für die Erforschung der Mikro-/Makroevolution und der Ökologie von Lebensgemeinschaften.
Auf makroevolutionärer Ebene besagt die Kernaussage der Pflanzen-Insekten-Koevolutionstheorie von Ehrlich und Raven (51), dass die Variation der metabolischen Diversität zwischen den Arten die Ursache für die Diversifizierung pflanzlicher Abstammungslinien ist. In den fünfzig Jahren seit der Veröffentlichung dieser bahnbrechenden Arbeit wurde diese Hypothese jedoch selten überprüft (52). Dies liegt vor allem an den phylogenetischen Merkmalen vergleichbarer metabolischer Eigenschaften über weit entfernte Pflanzenlinien hinweg. Diese Seltenheit kann genutzt werden, um gezielte Analysemethoden zu etablieren. Der aktuelle MS/MS-Workflow, der auf Informationstheorie basiert, quantifiziert die MS/MS-Strukturähnlichkeit unbekannter Metaboliten (ohne vorherige Metabolitenauswahl) und wandelt diese MS/MS-Spektren in einen Satz von MS/MS-Spektren um. So können diese makroevolutionären Modelle anhand einfacher statistischer Indikatoren auf einer Klassifizierungsskala verglichen werden. Das Verfahren ähnelt der phylogenetischen Analyse, die Sequenzalignments nutzt, um die Diversifizierungsrate oder die Evolution von Merkmalen ohne vorherige Vorhersage zu quantifizieren.
Auf biochemischer Ebene zeigt die Screening-Hypothese von Firn und Jones (53), dass die metabolische Diversität auf verschiedenen Ebenen aufrechterhalten wird, um Rohstoffe für die biologischen Aktivitäten zuvor nicht verwandter oder substituierter Metaboliten bereitzustellen. Methoden der Informationstheorie bieten einen Rahmen, in dem diese metabolitspezifischen evolutionären Übergänge, die während der Metabolitspezialisierung auftreten, als Teil des vorgeschlagenen evolutionären Screening-Prozesses quantifiziert werden können: biologisch aktive Anpassung von niedrig- zu hochspezifisch gehemmten Metaboliten einer gegebenen Umgebung.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in den Anfängen der Molekularbiologie wichtige Theorien zur Pflanzenabwehr entwickelt wurden und deduktive, hypothesenbasierte Methoden weithin als einziger Weg zu wissenschaftlichem Fortschritt gelten. Dies ist vor allem auf die technischen Beschränkungen der Messung des gesamten Metaboloms zurückzuführen. Obwohl hypothesenbasierte Methoden besonders nützlich sind, um andere Kausalmechanismen zu identifizieren, ist ihr Beitrag zum Verständnis biochemischer Netzwerke begrenzter als der der in der modernen datenintensiven Wissenschaft verfügbaren computergestützten Methoden. Daher liegen Theorien, die nicht vorhergesagt werden können, weit jenseits des Rahmens der verfügbaren Daten, sodass der hypothetische Formel-Test-Zyklus des Forschungsfortschritts nicht abgeschafft werden kann (4). Wir gehen davon aus, dass der hier vorgestellte computergestützte Workflow der Metabolomik das Interesse an den jüngsten (Wie) und letztendlichen (Warum) Fragen der metabolischen Diversität neu entfachen und zu einer neuen Ära theoriegeleiteter Datenwissenschaft beitragen kann. Diese Ära befasst sich erneut mit den wichtigen Theorien, die frühere Generationen inspiriert haben.
Die direkte Fraßaktivität von Pflanzenfressern wurde untersucht, indem Larven des zweiten Larvenstadiums oder Sl-Larven auf einem einzelnen Blatt der Kannenpflanze (Phoenix canadensis) einer blühenden Rose aufgezogen wurden. Pro Pflanze wurde dies zehnmal wiederholt. Die Insektenlarven wurden mit Klammern fixiert, und das verbleibende Blattgewebe wurde 24 und 72 Stunden nach der Infektion entnommen, schockgefroren und die Metaboliten extrahiert.
Die Behandlung durch Pflanzenfresser wird hochgradig synchronisiert simuliert. Dazu werden während des Wachstumsstadiums der Stoffgirlande auf jeder Seite der Mittelrippe drei Dornenreihen in die drei voll entwickelten Blätter der Pflanze gestochen. Anschließend wird sofort eine 1:5 verdünnte Ms.-Lösung aufgetragen. Alternativ kann S1 OS mit behandschuhten Fingern in die Einstichstelle eingeführt werden. Ein Blatt wird wie oben beschrieben geerntet und verarbeitet. Primäre Metaboliten und Pflanzenhormone werden nach der zuvor beschriebenen Methode extrahiert (54).
Für die exogene JA-Anwendung wurden die drei Blattstiele jeder der sechs blühenden Rosenpflanzen jeder Art mit 20 µl Lanolinpaste, die 150 µg MeJA enthielt (Lan + MeJA), oder mit 20 µl Lanolin plus Wundbehandlung (Lan + W) behandelt. Als Kontrolle dienten 20 µl reines Lanolin. Die Blätter wurden 72 Stunden nach der Behandlung geerntet, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert.
In unserer Forschungsgruppe wurden vier transgene Linien identifiziert, die JA und ET exprimieren: irAOC (36), irCOI1 (55), irACO und sETR1 (48). irAOC zeigte eine deutliche Reduktion der JA- und JA-Ile-Konzentrationen, während irCOI1 unempfindlich gegenüber JA war. Im Vergleich zu EV war die JA-Ile-Akkumulation erhöht. Ebenso reduziert irACO die ET-Produktion, und sETR1, das unempfindlich gegenüber ET ist, erhöht diese im Vergleich zu EV.
Zur nicht-invasiven ET-Messung wurde ein photoakustisches Laserspektrometer (Sensor Sense ETD-300 Echtzeit-ET-Sensor) verwendet. Unmittelbar nach der Behandlung wurde die Hälfte der Blätter abgeschnitten und in ein 4 ml verschlossenes Glasfläschchen überführt. Der Gasraum konnte sich innerhalb von 5 Stunden anreichern. Während der Messung wurde jedes Fläschchen 8 Minuten lang mit einem Strom von 2 Litern/Stunde reiner Luft gespült, die zuvor durch einen von Sensor Sense bereitgestellten Katalysator geleitet worden war, um CO₂ und Wasser zu entfernen.
Die Microarray-Daten wurden ursprünglich in (35) veröffentlicht und in der Gene Expression Comprehensive Database des National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter der Zugangsnummer GSE30287 gespeichert. Für diese Studie wurden die Daten der Blätter nach der Behandlung mit W + OSMs sowie der unbeschädigten Kontrollgruppe extrahiert. Die Rohintensität wurde als Logarithmus zur Basislinie (log2) angegeben. Vor der statistischen Analyse wurde die Basislinie mithilfe des R-Softwarepakets auf das 75. Perzentil normalisiert.
Die ursprünglichen RNA-Sequenzierungsdaten (RNA-seq) von Nicotiana-Arten wurden aus dem NCBI Short Reading Archives (SRA) unter der Projektnummer PRJNA301787 abgerufen, wie von Zhou et al. (39) beschrieben. Die weitere Verarbeitung erfolgte wie in (56) beschrieben. Die mit W+W, W+OSM und W+OSS1 verarbeiteten Rohdaten von Nicotiana-Arten wurden für diese Studie ausgewählt und wie folgt verarbeitet: Zunächst wurden die RNA-seq-Rohdaten in das FASTQ-Format konvertiert. HISAT2 konvertierte FASTQ in SAM, und SAMtools wandelte die SAM-Dateien in sortierte BAM-Dateien um. Die Genexpression wurde mit StringTie berechnet. Die Expressionsmethode basiert auf der Anzahl der Fragmente pro tausend Basen pro Million sequenzierter Transkriptionsfragmente.
Die für die Analyse verwendete Acclaim-Chromatographiesäule (150 mm × 2,1 mm; Partikelgröße 2,2 μm) und die 4 mm × 4 mm Vorsäule bestehen aus demselben Material. Im Dionex UltiMate 3000 Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie-System (UHPLC) wird folgender binärer Gradient verwendet: 0 bis 0,5 Minuten, isokratisch 90 % A [deionisiertes Wasser, 0,1 % (v/v) Acetonitril und 0,05 % Ameisensäure], 10 % B (Acetonitril und 0,05 % Ameisensäure); 0,5 bis 23,5 Minuten, Gradientenphase 10 % A und 90 % B; 23,5 bis 25 Minuten, isokratisch 10 % A und 90 % B. Die Flussrate beträgt 400 μl/min. Für alle MS-Analysen wird das Säuleneluat in einen Quadrupol- und Flugzeit-Massenspektrometer (qTOF) injiziert, das mit einer Elektrospray-Quelle ausgestattet ist, die im positiven Ionisationsmodus arbeitet (Kapillarspannung 4500 V; Kapillarausgang 130 V; Trocknungstemperatur 200 °C; Trocknungsluftstrom 10 Liter/min).
Es wird eine MS/MS-Fragmentanalyse (im Folgenden als MS/MS bezeichnet) durchgeführt, deren Fragmente irrelevant oder nicht von den Daten zu unterscheiden sind, um Strukturinformationen über das gesamte detektierbare Stoffwechselprofil zu erhalten. Das Konzept der indiskriminierenden MS/MS-Methode beruht darauf, dass das Quadrupol-Massenspektrometer ein sehr großes Massenisolationsfenster aufweist [daher werden alle Masse-zu-Ladungs-Verhältnis-Signale (m/z) als Fragmente betrachtet]. Da das Impact II-Instrument aus diesem Grund keine CE-Neigung erzeugen konnte, wurden mehrere unabhängige Analysen mit erhöhten Werten der kollisionsinduzierten Dissoziationsenergie (CE) durchgeführt. Kurz gesagt, wird die Probe zunächst mittels UHPLC-Elektrospray-Ionisation/qTOF-MS im Einzelmassenspektrometrie-Modus (niedrige Fragmentierungsbedingungen durch In-Source-Fragmentierung) analysiert, wobei der m/z-Bereich von 50 bis 1500 mit einer Wiederholfrequenz von 5 Hz gescannt wird. Verwenden Sie Stickstoff als Kollisionsgas für die MS/MS-Analyse und führen Sie unabhängige Messungen bei den folgenden vier verschiedenen CID-Spannungen durch: 20, 30, 40 und 50 eV. Während des gesamten Messvorgangs verfügt das Quadrupol über das größte Massenisolationsfenster von m/z 50 bis 1500. Wenn das Experiment für m/z 200 und die Isolationsbreite am Frontkörper eingestellt ist, wird der Massenbereich automatisch von der Gerätesoftware aktiviert und auf 0 Da gesetzt. Scannen Sie nach Massenfragmenten wie im Einzelmassenmodus. Verwenden Sie Natriumformiat (50 ml Isopropanol, 200 μl Ameisensäure und 1 ml 1 M NaOH-Lösung) zur Massenkalibrierung. Mithilfe des hochpräzisen Kalibrieralgorithmus von Bruker wird die Datendatei nach der Aufnahme des Mittelwertspektrums über einen bestimmten Zeitraum kalibriert. Verwenden Sie die Exportfunktion der Software Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Deutschland), um die Rohdatendateien in das NetCDF-Format zu konvertieren. Der MS/MS-Datensatz wurde in der offenen Metabolomik-Datenbank MetaboLights (www.ebi.ac.uk) unter der Zugangsnummer MTBLS1471 gespeichert.
Die MS/MS-Assemblierung kann durch Korrelationsanalyse zwischen MS1- und MS/MS-Qualitätssignalen für niedrige und hohe Kollisionsenergien sowie durch neu implementierte Regeln realisiert werden. Das R-Skript dient der Korrelationsanalyse der Präkursor-Produkt-Verteilung, während das C#-Skript (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) die Regeln implementiert.
Um falsch-positive Ergebnisse aufgrund von Hintergrundrauschen und falsche Korrelationen durch die Detektion bestimmter m/z-Merkmale in nur wenigen Proben zu reduzieren, verwenden wir die Funktion „Filled Peak“ des R-Pakets XCMS (zur Hintergrundrauschkorrektur). Diese Funktion ersetzt die Intensität „NA“ (nicht detektierter Peak). Bei Verwendung der Fill-Peak-Funktion verbleiben jedoch viele Intensitätswerte „0“ im Datensatz, die die Korrelationsberechnung beeinflussen. Daher vergleichen wir die Ergebnisse der Datenverarbeitung mit und ohne Filled Peak-Funktion und berechnen den Hintergrundrauschenwert anhand des durchschnittlichen korrigierten Schätzwertes. Anschließend ersetzen wir die fehlenden Intensitätswerte „0“ durch den berechneten Hintergrundwert. Wir berücksichtigen nur Merkmale, deren Intensität das Dreifache des Hintergrundwertes übersteigt, und betrachten diese als „echte Peaks“. Für die PCC-Berechnungen werden nur die m/z-Signale des Probenpräkursors (MS1) und der Fragmentdatensätze mit mindestens acht echten Peaks berücksichtigt.
Wenn die Intensität des Vorläufer-Qualitätsmerkmals in der gesamten Probe signifikant mit der reduzierten Intensität desselben Qualitätsmerkmals nach Kollision mit niedriger oder hoher Energie korreliert und dieses Merkmal von CAMERA nicht als Isotopenpeak identifiziert wird, kann es weiter charakterisiert werden. Anschließend wird die Korrelationsanalyse durchgeführt, indem alle möglichen Vorläufer-Produkt-Paare innerhalb von 3 s (dem geschätzten Retentionszeitfenster für die Peakretention) berechnet werden. Nur wenn der m/z-Wert niedriger als der Vorläuferwert ist und die MS/MS-Fragmentierung an derselben Stelle im Datensatz erfolgt wie der Vorläufer, von dem sie abgeleitet ist, wird sie als Fragment betrachtet.
Anhand dieser beiden einfachen Regeln schließen wir die angegebenen Fragmente mit m/z-Werten größer als der m/z-Wert des identifizierten Vorläuferions aus, basierend auf der Probenposition, an der das Vorläuferion und das angegebene Fragment auftreten. Es ist auch möglich, die Qualitätsmerkmale vieler im MS1-Modus erzeugter In-Source-Fragmente als Kandidaten für Vorläuferionen auszuwählen, wodurch redundante MS/MS-Verbindungen entstehen. Um diese Datenredundanz zu reduzieren, werden Spektren zusammengeführt, deren NDP-Ähnlichkeit 0,6 übersteigt und die zur Chromatogramm-„pcgroup“ gehören, die von CAMERA annotiert wurde. Schließlich werden alle vier CE-Ergebnisse, die mit dem Vorläuferion und den Fragmenten verknüpft sind, zum endgültigen dekonvolvierten Kompositspektrum zusammengeführt, indem der Peak mit der höchsten Intensität unter allen Kandidatenpeaks mit demselben m/z-Wert bei unterschiedlichen Kollisionsenergien ausgewählt wird. Die nachfolgenden Verarbeitungsschritte basieren auf dem Konzept des Kompositspektrums und berücksichtigen die unterschiedlichen CE-Bedingungen, die erforderlich sind, um die Fragmentierungswahrscheinlichkeit zu maximieren, da einige Fragmente nur bei einer bestimmten Kollisionsenergie detektiert werden können.
RDPI (30) wurde zur Berechnung der Induzierbarkeit des metabolischen Profils verwendet. Die Diversität des metabolischen Spektrums (Hj-Index) wird aus der Häufigkeit der MS/MS-Vorläufer unter Verwendung der Shannon-Entropie der MS/MS-Häufigkeitsverteilung mithilfe der folgenden von Martínez et al. (8) beschriebenen Gleichung abgeleitet: Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij), wobei Pij der relativen Häufigkeit des i-ten MS/MS in der j-ten Probe entspricht (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Die metabolische Spezifität (Si-Index) ist definiert als die Expressionsidentität eines gegebenen MS/MS-Profils im Verhältnis zur Häufigkeit zwischen den betrachteten Proben. Die MS/MS-Spezifität wird wie folgt berechnet: Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Verwenden Sie die folgende Formel, um den metabolomspezifischen δj-Index jeder Probe j und den Mittelwert der MS/MS-Spezifität δj = ∑i = 1mPijSi zu messen.
MS/MS-Spektren werden paarweise ausgerichtet, und die Ähnlichkeit wird anhand zweier Werte berechnet. Zunächst wird die Segmentähnlichkeit zwischen Spektren mithilfe der Standard-NDP-Methode (auch bekannt als Kosinuskorrelationsmethode) anhand der folgenden Gleichung bewertet: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2, wobei S1 und S2 entsprechend für Spektrum 1 und Spektrum 2 sowie für WS1, i und WS2 steht. i repräsentiert die Gewichtung basierend auf der Peakintensität, bei der die Differenz des i-ten gemeinsamen Peaks zwischen den beiden Spektren weniger als 0,01 Da beträgt. Die Gewichtung wird wie folgt berechnet: W = [Peakintensität] m [Qualität] n, m = 0,5, n = 2, wie von MassBank vorgeschlagen.
Eine zweite Bewertungsmethode wurde implementiert, die die Analyse der gemeinsamen natürlichen Liste (NL) zwischen MS/MS-Spektren umfasste. Hierzu verwendeten wir die 52 häufig während der MS-Fragmentierung auftretenden NL-Listen zusammen mit der spezifischeren NL (Datendatei S1), die zuvor für das MS/MS-Spektrum der Sekundärmetaboliten der geschwächten Nepenthes-Arten annotiert wurde (9, 26). Für jedes MS/MS-Spektrum wurde ein Binärvektor aus 1 und 0 erstellt, der dem Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein einer NL entspricht. Basierend auf der euklidischen Distanz wurde für jedes Paar binärer NL-Vektoren der NL-Ähnlichkeitswert berechnet.
Für das duale Clustering verwendeten wir das R-Paket DiffCoEx, das auf einer Erweiterung der gewichteten Gen-Koexpressionsanalyse (WGCNA) basiert. Mithilfe der NDP- und NL-Scoring-Matrizen der MS/MS-Spektren berechneten wir mit DiffCoEx die vergleichende Korrelationsmatrix. Das binäre Clustering erfolgte durch Setzen des Parameters „cutreeDynamic“ auf method = „hybrid“, cutHeight = 0,9999, deepSplit = T und minClusterSize = 10. Der R-Quellcode von DiffCoEx wurde aus der Zusatzdatei 1 von Tesson et al. (57) heruntergeladen; das benötigte R-Softwarepaket WGCNA ist unter https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA verfügbar.
Zur Durchführung der MS/MS-Molekülnetzwerkanalyse berechneten wir die gepaarte spektrale Konnektivität auf Basis der Ähnlichkeitstypen NDP und NL und verwendeten die Cytoscape-Software, um die Netzwerktopologie mithilfe des organischen Layouts in der CyFilescape yFiles Layout-Algorithmus-Erweiterungsanwendung zu visualisieren.
Die statistische Analyse der Daten erfolgte mit R (Version 3.0.1). Die statistische Signifikanz wurde mittels zweifaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) und anschließendem Tukey-HSD-Post-hoc-Test ermittelt. Um den Unterschied zwischen der Behandlung mit herbivoren Tieren und der Kontrollgruppe zu analysieren, wurde die zweiseitige Verteilung der beiden Stichprobengruppen mit gleicher Varianz mittels t-Test nach Student geprüft.
Ergänzendes Material zu diesem Artikel finden Sie unter http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
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Die Informationstheorie liefert eine universelle Währung für den Vergleich spezieller Metabolome und die Vorhersage von Testverteidigungstheorien.
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